Summary
Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.
Abstract
El reclutamiento de los leucocitos sobre lesiones o inflamación a los sitios de lesión o daño tisular ha sido investigado durante las últimas décadas y se ha traducido en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos involucrados en el reclutamiento leucocitario todavía no sido plenamente identificados. Puesto que el reclutamiento del leucocito sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y la (auto) inmune investigación, presentamos un ensayo sencillo basado en el flujo laminar para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia, y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. El ensayo en vitro puede utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares en diferentes modelos de inflamación vascular. Este protocolo describe un ensayo de flujo laminar usando una cámara de flujo paralelo y un microscopio invertido de contraste de fase conectada a una cámara para estudiar las interacciones de los leucocitos y las células endoteliales o plaquetas, que pueden ser visualizadas y registradas entonces Análisis fuera de línea. Las células endoteliales, plaquetas y leucocitos pueden ser pretratados con inhibidores o anticuerpos para determinar el papel de moléculas específicas durante este proceso. Condiciones de esfuerzo cortante, tensión de esquileo es decir, arterial o venoso, pueden ser adaptadas fácilmente por la viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal.
Introduction
Sobre la lesión, inflamación o infección, leucocitos responden rápidamente al patógeno o daños asociada - molecular (PAMPs, humedades), cambiar a un estado activado y salir del torrente sanguíneo a sitios de inflamación y tejido de daños. La capacidad de interactuar con su entorno celular y molecular de los leucocitos es esencial para su correcto funcionamiento como las células inmunes, como resaltado por trastornos genéticos como de deficiencia de adhesión leucocitaria1. Adherencia del leucocito ha sido objeto de intensa investigación durante las últimas décadas y esto ha derivado en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria en los comienzos del decenio de 19902,3. Adherencia del leucocito es iniciada por la captura de selectina-mediada de los leucocitos al endotelio, causando las células a rodar sobre la superficie vascular. Este balanceo permite leucocitos buscar señales migratorias endotelio-limite, por ejemplo, quimiocinas, que inducen la activación de las integrinas. Posteriormente, las integrinas activadas median la Unión a ligandos endoteliales, dando por resultado la detención firme del leucocito. Leucocitos pueden posteriormente preparar a extravasate de arrastre y difusión, antes de penetrar en la monocapa endotelial y transmigrating en el tejido subyacente. El concepto básico de la cascada del leucocito canónico ha permaneció prácticamente sin cambios desde su introducción, con algunos pasos intermedios adicionales4. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos y los roles de los jugadores muchos involucrados en el reclutamiento leucocitario no aclarados hasta el momento, y reclutamiento leucocitario sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y (auto-) inmune investigación.
Por ejemplo, durante enfermedades inflamatorias vasculares como la aterosclerosis, mayor reclutamiento leucocitario en el desarrollo de placa buque pared unidades. Las placas ateroscleróticas inestables podrían romperse, llevando a la activación masiva de las plaquetas y el sistema de coagulación y posteriormente a la obstrucción de los vasos5. Esto puede resultar en resultados cardiovasculares graves como infarto de miocardio o accidente cerebrovascular. Además, denudación endotelial, como ocurre clínicamente, por ejemplo, después de stenting de la arteria coronaria, conduce a una multitud de interacciones de los leucocitos y las plaquetas en el interior de pared expuesta del recipiente (p. ej., componentes de la matriz y liso las células del músculo) y de leucocitos con las plaquetas cubriendo la lesión vascular. Estas interacciones son importantes para el desarrollo de la enfermedad como interacciones de monocito plaquetas podrían conducir la formación de neoíntima6,7. Además, las interacciones plaquetas leucocitos mediaron por la integrina leucocitaria Mac-1 (α βM2) y plaquetas GPIbα recientemente han sido identificadas como nuevos controladores de la trombosis en ratones8.
Dada la amplia disponibilidad de sangre humana y animal como fuente de leucocitos y plaquetas para la investigación y el amplio espectro de moléculas de matriz aislada y líneas celulares inmortalizadas de leucocito y de origen vascular, es factible simular del leucocito interacciones bajo flujo en un laboratorio de creación, utilizando cámaras de perfusión de flujo especialmente diseñada. Muchas variantes se han diseñado en las últimas décadas, que van de vacío a cámaras de perfusión auta-adhesivo. Todas las variantes tienen en común que la parte inmóvil (p. ej., células vasculares cultivadas o proteínas de la matriz) está montada en una cámara de prueba de fugas más grande equipada con un canal predefinido que permite la perfusión de fluidos sobre la parte inmóvil. Además, avances en la tecnología de moldeo permitieron el desarrollo de soluciones a medida basadas en polímeros de sílice9. La viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal principalmente determinan las características de la tensión de esquileo del flujo perfusión dispositivo10. En este artículo presentamos un método en vitro para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. La ventaja de los métodos presentados aquí es que se puede realizar utilizando un microscopio de fluorescencia con cámara conectada común y no requieren un experimentadores poseer alto nivel técnico. El ensayo en vitro puede ser manipulado de muchas maneras (por ejemplo, mediante la adición de inhibidores o anticuerpos de bloqueo) y por lo tanto es aplicable en diferentes modelos de inflamación vascular y permite la investigación de la adherencia de funciones de la proteína o la evaluación de compuestos específicos.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ética médica y Animal ético tableros de la Universidad de Maastricht.
1. flujo basada en el ensayo con células humanas
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Aislamiento de las plaquetas de sangre humana
- Extraer la sangre venosa en anticoagulante de citrato (3.2%).
- Añadir el 15/1 volumen de ácido citrato dextrosa (ACD: citrato trisódico 80 mM, 52 mM cítrico y 183 mM de glucosa) a la sangre.
- Centrifugue a 350 g de x sin freno durante 15 minutos obtener plasma rico en plaquetas (PRP).
- Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mL y añadir 1/20 volumen de ACD.
- Centrifugue a 1.110 g sin freno durante 15 minutos obtener plasma pobre en plaquetas (PPP).
- Deseche el sobrenadante. Corte el extremo de la punta de la pipeta (1000 P), lo que amplia del alesaje, que SIDA en la prevención de la activación plaquetaria y cuidadosamente suspender el sedimento de la plaqueta en el mismo volumen que el PRP en plaquetas de tampón pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM de MgCl2, seroalbúmina bovina al 0.1% y 0.1% de glucosa). Añadir el 20/1 volumen de ACD y mezclar suavemente.
- De la pelotilla de las plaquetas a 1.110 g sin freno durante 15 minutos.
- Deseche el sobrenadante y cuidadosamente suspender las plaquetas como por encima de 1 mL de tampón de plaquetas (pH 7.5).
- Medir la concentración de plaquetas en una dilución 1/10 con un analizador de la hematología automatizada.
- Ajuste el volumen con buffer de plaquetas (pH 7.5) para conseguir una cuenta de 2 x 107/ml.
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Aislamiento de células polimorfonucleares de la sangre humana (adaptado de Brinkmann et al. 11 )
- Sorteo 24 mL de sangre en heparina (10 U/mL) como anticoagulante.
- Añadir 6 mL de medio de diatrizoato de sodio polysucrose de densidad de 1,077 g/mL (véase Tabla de materiales) a un tubo cónico de 15 mL y cuidadosamente capa 5-6 mL sangre en la parte superior.
- Centrifugar 20 min a 800 g de x sin freno.
- Aspirar y descartar la capa superior clara amarillenta y transferir la fase rojiza inferior que contiene granulocitos en frescos tubos cónicos de 15 mL. Lavar las células mediante la adición de PBS que contenía 2 mM EDTA hasta un volumen final de 14 mL y centrifugar 10 min a 300 x g sin freno.
- Mientras tanto, preparar un medio de gradiente de densidad (e.g., percoll, véase Tabla de materiales) solución de trabajo mezclando medio gradiente de densidad de 18 mL con 2 mL 10 x solución stock de PBS. Diluir esta solución de trabajo con PBS (1 x) para obtener 4,25 mL cada uno de 85%, 80%, 75%, 70% y 65% soluciones medio degradadas.
- Preparar 2 tubos cónicos con el gradiente de densidad por capas de 2 mL de cada medio porcentaje encima de la otra. Comenzar con la concentración más alta y continuar en orden decreciente. Marque las capas en el tubo con un marcador a prueba de agua.
- Cuidadosamente 2 mL de las suspensiones de células en cada uno de los dos gradientes preparados de la capa.
- Centrifugar por 20 min a 800 x g sin freno en una centrifugadora cuidadosamente equilibrada.
- Después de la centrifugación, retirar la capa superior y más del 65% (primer anillo) la capa con las PBMCs y recoger en nuevos tubos blanco restante interfases hasta el 85% de la capa (segundo anillo, PMN).
- Lavar las células rellenando los tubos con PBS 2 mM EDTA y centrifugar 10 min a 300 x g sin freno.
- Quite el sobrenadante y suspender las células sedimentadas (normalmente ≥ 95% son PMN) en 1 mL de tampón de Hank (pH 7.45), que contiene 10 mM Hepes y 0.2% de albúmina humana (tampón de ensayo).
- Contar las células usando un hemocitómetro y suspender las células en 1 x 106/ml.
- Continuar con perfusión de leucocitos (paso 3.3) y etiquetado fluorescente.
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Preparación de plaquetas adherentes - y monocapas de células vasculares
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PREPARACION de cultura celular (células cultivadas)
- La capa de los platos de cultivo celular de 35 mm con 1 mL de colágeno de la cola de rata diluido (30 μg/mL diluido en PBS filtra sobre un filtro de 0.2 μm).
- Incubar durante 30 min a 37 ° C, eliminar la solución de colágeno y lave el plato una vez con PBS.
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Cultura de las células vasculares en platos de la cultura
- Separar primaria (p. ej., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) o inmortalizadas las células vasculares (p. ej., EA. Hy926, SVEC) a confluencia en un matraz T75 con 1,5 mL de solución de la separación de la célula (e.g., accutase). Agregar 4,5 mL de medio de crecimiento apropiado para neutralizar la solución de la separación de células y determinar la concentración de células con un celular con cámara. Suspender las células en 0,5 x 105 células/mL en el medio de crecimiento apropiado (p. ej., medio de cultivo de células endoteliales completo).
- Añadir 2 mL de la suspensión celular en cada plato de 35 mm. La cultura de las células en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2 hasta confluencia (de 24 a 48 h, dependiendo del tipo de célula).
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Cubreobjetos de vidrio preparación (plaquetas adherentes)
- Sumerja el cubreobjetos de vidrio una vez en HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
- Enjuague el cubreobjetos 2 veces en agua ultrapura.
- Seque el cubreobjetos bajo N2.
- La capa el cubreobjetos de vidrio con 100 μl, según la posición del canal de la cámara de perfusión de colágeno de cola de rata diluido tipo I (30 μg/mL diluido en PBS filtra sobre un filtro de 0.2 μm).
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, eliminar la solución de colágeno y lavar lo cubreobjetos 3 x con PBS.
- Bloque el cubreobjetos de colágeno recubierta con BSA 1% en HEPES de 0.5 h a TA.
- Lave y seque el cubreobjetos y montarlo en la cámara de perfusión. Aislar las plaquetas de humana o sangre de ratón como se indica en el paso 1.1 o 2.1, respectivamente.
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Inmovilización de las plaquetas
- Añadir 70 μl de una suspensión de plaquetas/ml de 2 x 107por canal e incubar durante 1,5 h a 37 ° C y 5% CO2.
- Vuelva a colocar cuidadosamente las plaquetas no adherente con solución de bloqueo (5% de BSA en HEPES) durante al menos 30 min a TA. continuar con etiquetado fluorescente y perfusión de los leucocitos (paso 3.3).
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Estimulación de la monocapa de células vasculares
- Estimular las células vasculares mediante la sustitución de los medios de comunicación con medio fresco que contiene 10 ng/mL factor de necrosis tumoral α (TNFα) durante 4 h a 37 ° C y 5% CO2.
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PREPARACION de cultura celular (células cultivadas)
2. flujo basada en ensayo con células murinas
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Aislamiento de las plaquetas de la sangre de ratón
- Drenaje de sangre por punción cardiaca usando una aguja 21 G (~ 1 mL) de anestesia (ketamina 80 mg/kg y medetomidina 0,3 mg/kg) de 6 – 8 semanas-ratones viejos (C57Bl/6) en (3.2%) citrato como anticoagulante.
- Añadir el 1/6 volumen de ACD.
- Centrífuga x 220 g, freno medio durante 5 minutos obtener plasma rico en plaquetas (PRP).
- Transferir el sobrenadante (~ 600 μL) más 1/3 de células de sangre rojas a un tubo nuevo
- Centrifugue a 95 g de x sin freno durante 6 minutos.
- Transferir el sobrenadante (PRP) y medir la concentración de plaquetas en una dilución 1/10 en buffer de Tyrode (buffer de TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM de MgCl2, seroalbúmina bovina al 0.1% y 0.1% glucosa) con un analizador de la hematología automatizada.
- Lavar las plaquetas mediante la adición de 1/25 volumen de ACD + 0.1 apyrase U/mL y centrifugar a 2.870 g, freno media durante 2 minutos.
- Deseche el sobrenadante y añadir 600 μl de tampón de TH, 1/10 volumen de ACD y 0.1 apyrase U/mL. Cortar la punta de la pipeta (1000 P), lo que amplia alesaje, que ayuda en la prevención de la activación plaquetaria y suspender suavemente el sedimento.
- Centrifugar a 2.870 g, freno medio durante 2 min.
- Deseche el sobrenadante y suavemente suspender las plaquetas en tampón de TH.
- Ajuste el volumen con buffer de TH para conseguir una cuenta de 2 x 107/ml.
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Preparación de monocapas de plaquetas adherentes
- Preparar el vidrio cubreobjetos (plaquetas adherentes) según 1.3.3.
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Inmovilización de las plaquetas
- Añada 100 μl de una suspensión de plaquetas/ml de 2 x 107por canal e incubar durante 1,5 h a 37 ° C y 5% CO2.
- Vuelva a colocar cuidadosamente las plaquetas no adherente con solución de bloqueo (5% de BSA en HEPES) durante al menos 30 min a RT. continuar con perfusión de leucocitos (paso 3.3) y etiquetado fluorescente
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Estimulación de monocapa de plaquetas de ratón
- Antes de la perfusión de los leucocitos (paso 3.3), estimular las plaquetas por la perfusión de la trombina (0,5 nM) en tampón HHHSA durante 3 minutos a 37 ° C.
3. etiquetado fluorescente y perfusión de leucocitos (PMN o THP-1 264.7 y humanos o monocitos primario de ratón para ensayo de flujo murino)
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Etiquetado fluorescente
- Etiqueta de los leucocitos (1 x 106/ml) con la tinción de ácido nucleico de fluorescente verde florescente de la célula (1 μm). Incube las células durante 30 min a 37 ° C.
- Lavar las células con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 min y suspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL (5 mL por la condición de prueba, dependiendo de la velocidad de flujo) en tampon de ensayo.
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Preparación del análisis de flujo de cámara
- Para la adherencia del leucocito en una monocapa de células, desechar el medio de cultivo celular de la fuente y montar en la cámara de flujo. Conecte la tubería a la jeringa. Para la adherencia del leucocito en plaquetas inmovilizadas, conecte el micro slide a la jeringa. Caliente previamente un baño de agua a 37 ° C.
- Tome una jeringa de perfusión (50 mL), jeringa de instalar en el soporte de jeringa y retirar la bomba en conjunto modo. Ajuste el volumen de la bomba a 0 mL y selecciona el diámetro mm 26,70 para la jeringa de 50 mL.
- Conecte un conector luer de codo a un extremo de la tubería. Colocar un acoplador de la cerradura de luer a la jeringa y conectar el tubo con el conector luer de codo al acoplador de la cerradura de luer. Conecte el extremo libre de la tubería a la cámara de flujo.
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Adherencia y perfusión del leucocito
- Para la adherencia del leucocito en una monocapa de células, desechar el medio de cultivo celular de la fuente y montar en la cámara de flujo. Conecte la tubería a la jeringa. Para la adherencia del leucocito en plaquetas inmovilizadas, conecte el micro slide a la jeringa.
- Para la perfusión del leucocito y adherencia sobre un vascular- o monocapa de plaquetas, coloque el segundo tubo en un tubo cónico de 50 mL que contiene tampón de ensayo y llenado de la tubería con pipeta de 1 mL, luego apriete el tubo y conectarlo a una cámara de flujo.
- Antes de la perfusión del leucocito, añadir 3 mM CaCl2 y 2 mM de MgCl2 a la suspensión de células e incubar 5 min a 37 ° C.
- Tampón de ensayo antes de la perfusión de las células para eliminar el posible aire de la cámara y el tubo de perfusión.
- Cerrar los extremos del tubo, apretando firmemente y cambiar tubo de tampón de ensayo, suspensión de la célula, impidiendo el quedar atrapado burbujas de aire. Perfusión de las células con el esfuerzo de velocidad/esfuerzo cortante flujo apropiado hasta que lleguen las primeras células.
- Perfusión de las células con la tensión de velocidad/esfuerzo cortante flujo apropiado durante 2 min y captura al menos 6 cuadros entre 2 – 6 min de balanceo y adherentes de células con un microscopio de contraste de la fluorescencia de fase invertida (por ejemplo, EVOS-FL) de 100 aumentos conectado para una cámara digital CCD o CMOS.
Nota: Tensión de frecuencia/esquileo del flujo depende de las dimensiones de la cámara de flujo y viscosidad de la solución. Para cámara de perfusión utilizada aquí (véase Tabla de materiales):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: esfuerzo cortante (1 dyn/cm2)
Η: viscosidad (0.015 dyn * s/cm2)
Φ: caudal (0,67 mL/min)
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La adherencia del leucocito
- Para de-adhesion, cambiar tubo de suspensión celular, tampón de ensayo apretando el tubo, evitando burbujas de aire quede atrapada.
- Separar las células, perfusión con tampón de ensayo con una tensión de tasa/esquileo del flujo apropiado (véase 3.3.7 la nota).
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Transmigración de leucocitos
- Para transmigración leucocitaria, perfusión leucocitos (paso 3) hasta que la cantidad de leucocitos se adhieren (~ 50 campo de células/vista).
- Reemplazar la suspensión de leucocitos con tampón de ensayo.
- Grabar las células transmigrating por lapso de tiempo cada 10 – 15 s durante 30 – 60 min a 37 ° C.
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Representative Results
Para estudiar la adhesión endotelial leucocitaria, fluorescencia etiquetadas células THP-1 fueron perfundidas en una monocapa endotelial TNFα - o no-estimulados por 2 min a 3 Dina/cm2. El número total de células monocytic adherentes se determinó después de 2 min de la perfusión por la captura de 6 campos independientes durante un período de 2-6 min. Las células adherentes se cuantificaron en al menos 6 imágenes capturadas con un microscopio de contraste de la fluorescencia de fase invertida (por ejemplo, EVOS-FL) de 10 aumentos conectado a una cámara digital del CCD o CMOS y la media se expresó como células adherentes / mm2. Sobre el estímulo endotelial con TNFα, THP-1 detención aumentó significativamente en comparación con endotelio sin estimular. Micrografías representativas y la cuantificación de firmemente adherente THP-1 a las células endoteliales estimuladas no o TNFα se presenta en la figura 1. Adherencia del leucocito de plaquetas fue evaluada mediante perfusión de neutrófilos fluorescencia marcadas sobre una monocapa de plaquetas trampa-6 - o no-estimulados durante 2 minutos a 1 Dina/cm2. Neutrófilos de adherentes fueron cuantificados como se mencionó anteriormente. TRAMPA 6 estimulación aumentó significativamente la adherencia de los neutrófilos en relación a las plaquetas sin estimular. Videos representativos y la cuantificación de los neutrófilos firmemente adherentes a la monocapa de plaquetas no - o trampa-6-estimulados se presenta en la figura 1B.
Figura 1 : Adherencia del leucocito endotelial y plaquetaria bajo condiciones de flujo. Micrografías de cuantificación y representante de la adherencia de las células monocytic humanas (THP-1) a las células endoteliales (HUVEC) sembradas en los platos de la cultura de colágeno recubiertas bajo condiciones de flujo, con o sin activación de TNFα (10 ng/mL) (A). Micrografías de cuantificación y representante de la adherencia de los neutrófilos humanos con plaquetas humanas inmovilizadas en portaobjetos de vidrio recubiertas de colágeno en condiciones de flujo, sin o con trampa-6 activación (50 μm) (B). Valores de P se calcularon por la prueba de t no apareada (n = 3; media ± SD). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, este análisis pueden aplicarse para estudiar el papel de las moléculas de adhesión como la molécula de adherencia junctional de plaquetas (JAM-A). La adhesión de 264.7 ratón monocito/macrófago a una monocapa de plaquetas de mermelada-A (trJAM-A+ / +) y ratones de mermelada--presentan deficiencia de A (trJAM-A- / -) fue determinada en nuestro estudio anterior7. Como se observa en ella, plaquetas JAM-A deficiencia aumentaron la adherencia de los monocitos del ratón a la monocapa de plaquetas en comparación con ratones de tipo salvaje (figura 2A-B). Alternativamente, neutrófilos primario de ratón pueden ser aislados de ratones como descrito12.
Para estudiar los mecanismos subyacentes, tales como moléculas de adhesión involucradas en la interacción de plaquetas leucocitos, se pueden bloquear receptores específicos de superficie. En el estudio ya mencionado, bloqueo de plaquetas GPIbα y leucocito αMβ2 significativamente disminuida adhesión de monocitos, identificar un papel para la GPIbα αMβ2 axis en el reclutamiento de monocitos mayor aJAM-A- / - plaquetas (figura 2A-B). Por otra parte, experimentos de separación de células pueden realizarse para investigar la dependencia de la tensión de esquileo de interacciones de plaquetas leucocitos. Para la medición de flujo dependientes separación de monocitos, tensión de esquileo se incrementó gradualmente de 0 a 20 dinas/cm2. En este estudio, fue más resistente a la cizalla estrés comparado con mermelada-A la adhesión de 264.7 células plaquetas JAM-A- / - + + las plaquetas (figura 2C).
Figura 2 : Deficiencia de mermelada A promueve la adhesión celular monocítica flujo resistente. Adhesión de monocitos/macrófagos de ratón 264.7 células plaquetas de mermelada-A+ + y JAM-A- / - ratones inmovilizadas en portaobjetos de vidrio recubiertas de colágeno en condiciones de flujo, con o sin activación de la trombina (IIa, 0,5 nM) en presencia de inhibidores de la indicada (A). Micrografías representativas de ratón monocito/macrófago 264.7 células adherentes a JAM-A+ + y JAM-A- / - plaquetas después del tratamiento con anticuerpos de isotipo control o anti-GPIbα (B). Celular adhesión expresada como porcentaje de células adherentes al principio en forma incremental mayor tensión de esquileo (Dina/cm2) en las plaquetas inmovilizadas después de la activación de la trombina (IIa, 0,5 nM). Valores de P fueron calculados por ANOVA con post-test de Tukey (n = 3-5; media ± SEM). Barra de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de Zhao et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El tiempo de grabación prolongado (30-60 min) de campos solo después de la perfusión del leucocito y adherencia permite el estudio de leucocitos arrastrándose y extendiendo el comportamiento y transmigración final a través de la capa endotelial. Dentro de este estudio, hemos analizado la transmigración de monocitos humanos primarios (aislada con el kit de aislamiento de monocitos, según las instrucciones del fabricante como descrito13) a través de una capa endotelial. Tal como se presenta en la figura 3, siguiente detención firme al endotelio, monocitos preparan extravasate arrastrándose y separándose hasta llega al sitio preferido para la transmigración. Posteriormente, monocitos penetran la barrera endotelial de la célula ya sea por migración para o transcelular. Las células transmigrating se definieron como las células que se extienden sobre las células endoteliales, extendiendo sus seudópodos y pasando a través de la barrera endotelial, disminuyendo su brillo.
Figura 3: In vitro transmigración de monocitos primarias a través de una monocapa endotelial. Transmigración de final y que se separa y rastreros de monocitos en el endotelio se registró cada 15 s durante 30 minutos haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Este ensayo en vitro es un método sencillo para investigar mecanismos subyacentes del reclutamiento de leucocitos durante la inflamación vascular, pero hay algunos puntos críticos a ser observado. El primer requisito para la realización con éxito de este ensayo es la perfusión de leucocitos en un intacto y confluentes vasculares o monocapa de plaquetas. Esto puede lograrse por capa previa de las superficies con colágeno de tipo I. En general, cuando se trabaja con las células vasculares primarias, es importante separar suavemente las células mediante la solución de separación que contienen colagenasa recomendada (véase la Tabla de materiales), que es menos riguroso, pero tan eficaz como la tripsina. Para monocapas de plaquetas, es importante lavar suavemente las plaquetas durante el aislamiento para evitar la agregación y activación plaquetaria.
Otra consideración fundamental es mantener la continuidad de la bomba de modo retirada de la perfusión, ya que provoca una discontinuidad perturbado condiciones de corte y tasa de flujo. Por lo tanto, esto produce inexactitud de esfuerzo cortante real y, posteriormente, a la interpretación de los procesos fisiológico dependiente de la corte. Esto puede prevenirse con un mantenimiento regular de la bomba. Además, fundamental para la continuidad durante la perfusión es el uso de una jeringa nueva para cada experimento. Desde la textura de la goma dentro de los cambios de la jeringa con el aumento del uso y el tiempo entre experimentos, impide una continua retirada.
Otro paso fundamental es la prevención de aire quede atrapada durante la perfusión de los leucocitos, ya que aire posteriormente se arrancan las células de la superficie y alterar las condiciones de corte. Esto puede prevenirse aclarando todas antes de tubería a utilizar con agua ultra pura y luego con tampón de ensayo. Además, al conectar el tubo de tampón de ensayo a suspensión de células, o de una condición a otra, es importante mantener interfaces líquidas durante la conexión. Esto se logra apretando el tubo o por no alterar los niveles de líquido dentro de la tubería. Además, el volumen de líquido de la solución siempre debe ser suficiente para evitar que el nivel cae por debajo del extremo de la tubería y, así, ser tomado en el sistema de aire.
Una posible limitación de este ensayo podría ser el uso de cultivos de células que se mantienen en un ambiente artificial, es decir, cultiva una superficie de plástico rodeada por un medio que no modelar con precisión el estado en vivo . Aunque la fisioquímica y entorno fisiológico pueden ser precisamente controladas, las células cultivadas tienen una tasa de crecimiento rápido, que aumenta la variabilidad genética y, por tanto, la heterogeneidad de las células dentro de una población. Por otra parte, el vascular- o monocapa de plaquetas consiste en un solo tipo de células sólo. En particular, la investigación de las interacciones leucocito endotelial, es decir, transmigración de leucocitos a través de la barrera endotelial de la célula, el papel fisiológico relevante del subyacente membrana basal de células endoteliales y pericitos no pueden ser tomadas en cuenta. Alternativamente, puede ser interesante crear un ambiente multicelular mediante la aplicación de técnicas de cultivo celular de 3D en este ensayo.
Para resumir, teniendo estos puntos en cuenta, el análisis basado en el flujo laminar se puede aplicar eficientemente en diferentes modelos de inflamación vascular. En particular, puede ser fácilmente modificado para responder preguntas específicas de investigación, es decir, el ajuste de la tensión de esquileo variando el caudal de la solución, la viscosidad del fluido, o el canal alto y ancho. Particularmente, este último es importante ya que cambios en las dimensiones de la cámara de flujo reducen el volumen de líquido o células necesarias. Adicional, diferente de la fluorescencia de etiquetado de los leucocitos, o de moléculas específicas de vascular o monocapas de plaquetas se pueden utilizar para el estudio de las interacciones célula-célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los Drs. Martín M. Schmitt y Fraemohs línea. Este trabajo fue financiado por la fundación holandesa para la investigación científica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fundación para la investigación de la transfusión de sangre (LSBR Nr. 1638) y Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) otorgado a R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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