Summary
Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.
Abstract
Die Rekrutierung von Leukozyten nach Verletzung oder Entzündung zu Websites von Verletzungen oder Gewebeschäden wurde in den letzten Jahrzehnten untersucht und führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade. Die genauen molekularen Mechanismen bei der Rekrutierung von Leukozyten haben jedoch noch nicht vollständig geklärt. Da Leukozyten Rekrutierung ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung bleibt, präsentieren wir einen einfachen Laminar-Flow-based Assay zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Haftung und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der in-vitro- Test kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu studieren, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt eine Laminar-Flow-based Assays mit Parallel Strömungsraum und einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit einer Kamera verbunden, untersuchen die Wechselwirkungen der Leukozyten und Endothelzellen oder Thrombozyten, die visualisiert und dann aufgezeichnet werden können offline analysiert. Endothelzellen, Thrombozyten und Leukozyten können mit Inhibitoren oder Antikörper gegen die Rolle bestimmter Moleküle während dieses Prozesses bestimmen vorbehandelt werden. Scher Bedingungen, d.h. arterielle oder venöse Schubspannung, können leicht durch die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals angepasst werden.
Introduction
Bei Verletzungen, Entzündungen oder Infektionen reagieren Leukozyten schnell auf Erreger - oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (PAMPs, DAMPs), in einem aktivierten Zustand ändern und bewegen aus der Blutbahn zu Stätten der Entzündungen und Gewebeschäden. Die Fähigkeit der Leukozyten zur Interaktion mit ihrer zellulären und molekularen Umgebung unbedingt für ihr korrektes funktionieren wie Immunzellen, wie durch genetische Störungen wie Leukozyten Adhäsion Mangel1hervorgehoben. Leukozyten Adhäsion ist Gegenstand intensiver Untersuchung während der vergangenen Jahrzehnte und dies führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade in den frühen 1990er Jahren2,3. Leukozyten Adhäsion wird durch die selektin-vermittelte Aufnahme von Leukozyten des Endothels verursacht die Zellen die Fortschreibung der vaskulären Oberfläche initiiert. Diese Rollen kann Leukozyten Scannen für Endothel-gebundenen wandernden Hinweise, z. B., Chemokine, die die Aktivierung der Integrine zu induzieren. Anschließend vermitteln die aktivierten Integrine die Bindung an Endothelzellen Liganden, wodurch feste Leukozyten Verhaftung. Leukozyten können anschließend bereiten Sie Leber durch kriechen und verbreiten, vor dem Eindringen in die Endothelzellen Monolage und einen in das darunter liegende Gewebe. Das Grundkonzept der kanonischen Leukozyten Kaskade hat seit seiner Einführung weitgehend unverändert, mit einigen Zwischenschritten hinzugefügt4. Dennoch, die genauen molekularen Mechanismen und die Rollen der viele Akteure in der Rekrutierung von Leukozyten nicht geklärt so weit und Leukozyten Einstellung bleibt ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung.
Beispielsweise erhöht während der entzündlichen Gefäßerkrankungen wie Arteriosklerose, Leukozyten Rekrutierung in die Behälter Wand Laufwerke Plaque Entwicklung. Instabile arteriosklerotische Plaques könnte platzen, zu einer massiven Aktivierung von Blutplättchen und das Gerinnungssystem und anschließend zur Okklusion des Schiffes5führt. Dies kann zu schweren Herz-Kreislauf-Ergebnisse wie Herzinfarkt oder Schlaganfall führen. Endotheliale Denudation als es tritt klinisch, z.B. nach Stentimplantation einer Koronararterie führt zusätzlich zu einer Vielzahl von Interaktionen von Leukozyten und Thrombozyten, die exponierten Schiff wandinnenseite (z.B.Matrix Komponenten und glatt Muskel-Zellen) und der Leukozyten mit Thrombozyten deckt der gefäßverletzung. Diese Interaktionen sind wichtig für die weitere Entwicklung der Krankheit wie Monocyte-Thrombozyten Interaktionen Neointima Bildung6,7fahren könnte. Darüber hinaus Thrombozyten-Leukozyten Interaktion vermittelt durch Leukozyten Integrin Mac-1 (αMβ2) und Thrombozyten GPIbα vor kurzem als neue Treiber von Thrombosen in Mäusen8eingestuft wurden.
Angesichts die breite Verfügbarkeit von Mensch und Tier Blut als eine Quelle von Leukozyten und Thrombozyten für Forschung und das breite Spektrum der isolierten Matrix Moleküle und immortalisierte Zelllinien von Leukozyten und vaskulären Ursprungs ist es machbar, Leukozyten zu simulieren Interaktionen unter fließen in ein Labor einrichten, mit speziell entwickelten Fluss Perfusion Kammern. Viele Varianten wurden in den vergangenen Jahrzehnten, von Vakuum-getrieben bis hin zu selbstklebenden Perfusion Kammern entwickelt. Alle Varianten haben gemein, die der unbewegliche Teil (z.B., kultivierten vaskuläre Zellen oder matrixproteine) in eine größere auslaufsichere Kammer ausgestattet mit einem vorab definierten Kanal ermöglicht Perfusion von Flüssigkeiten über den unbeweglichen Teil montiert ist. Darüber hinaus ermöglichte Fortschritte in molding Technologie die Entwicklung von maßgeschneiderten Lösungen auf Basis von Kieselsäure Polymere9. Die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals bestimmen vor allem die Scherspannung Eigenschaften der Strömung Perfusion Gerät10. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Adhäsion und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der Vorteil der hier vorgestellten Methoden ist, dass sie mit einem gemeinsamen Kamera angeschlossen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden können, und erfordern keine Experimentatoren, hohe technische Qualifikation besitzen. Der in-vitro- Test kann in vielerlei Hinsicht (z. B.durch Hinzufügen von Inhibitoren oder blockieren Antikörper), manipuliert werden und gilt somit in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung und ermöglicht die Untersuchung der Adhäsion Proteinfunktionen oder die Bewertung der spezifischen Verbindungen.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der medizinischen Ethik und Tier ethischen Gremien der Universität Maastricht genehmigt.
(1) Flow-Based Assays mit menschlichen Zellen
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Isolierung von Thrombozyten aus menschlichem Blut
- Zeichnen Sie venöses Blut in Antikoagulanz Citrat (3,2 %).
- Volumen 1/15 der Acid Citrat Dextrose (ACD: 80 mM Trinatrium Citrat, 52 mM Zitronensäure und 183 mM Glukose) ins Blut.
- Zentrifugieren Sie bei 350 X g ohne Bremse für 15 min, Platelet rich Plasma (PRP) zu erhalten.
- Übertragen Sie den überstand auf eine 15 mL konische Rohr und fügen Sie 1/20-bändige von ACD.
- Zentrifugieren Sie bei 1.110 g ohne Bremse für 15 min, Thrombozyten Armen Plasma (PPP) zu erhalten.
- Verwerfen Sie den überstand. Schneiden Sie das Ende der pipettieren Spitze (P-1000), breite Bohrung, welche Hilfsmittel bei der Prävention von Thrombozyten Aktivierung und sorgfältig aussetzen der Thrombozyten Pellet in das gleiche Volumen wie PRP Platelet Puffer pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, MgCl22 mM, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Glukose). 1/20-bändige von ACD hinzufügen und vorsichtig mischen.
- Pellet-die Thrombozyten bei 1.110 g ohne Bremse für 15 Minuten.
- Den überstand verwerfen und sorgfältig aussetzen der Thrombozyten als oben in 1 mL Thrombozyten Puffer (pH 7,5).
- Messen Sie die Thrombozyten Konzentration in einer Verdünnung von 1/10 mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator.
- Stellen Sie die Lautstärke mit Thrombozyten-Puffer (pH 7,5), eine Anzahl von 2 x 107/mL zu erreichen.
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Isolation von polymorphkernigen Zellen aus menschlichem Blut (adaptiert von Brinkmann Et al. ( 11 )
- Ziehen Sie 24 mL Blut in Heparin (10 U/mL) als Antikoagulans.
- 6 mL 1,077 g/mL Dichte Polysucrose-Natrium Diatrizoate Medium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien), eine 15 mL konische Rohr und sorgfältig Schicht 5-6 mL Vollblut an der Spitze.
- Zentrifuge für 20 min bei 800 X g ohne Bremse.
- Aspirieren Sie und verwerfen Sie die klare gelbliche oberste Schicht und übertragen Sie die untere rötliche Phase mit Granulozyten in frischen 15 mL konische Röhrchen zu. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von PBS mit 2 mM EDTA zu einem Endvolumen von 14 mL und Zentrifuge für 10 min bei 300 X g ohne Bremse.
- In der Zwischenzeit bereiten ein Dichte-Gradienten-Medium (z. B.Percoll, siehe Tabelle of Materials) funktionierende Lösung durch Mischen von 18 mL-Dichte-Gradienten-Medium mit 2 mL 10 x PBS-Stammlösung. Diese funktionierende Lösung mit PBS verdünnen (1 X), 4,25 mL jeweils 85 %, 80 %, 75 %, 70 % und 65 % Steigung mittlere Lösungen zu erhalten.
- Bereiten Sie 2 konische Rohre mit der dichtegradient durch 2 mL jeden mittlerer Prozentsatz übereinander Schichten. Mit der höchsten Konzentration beginnen und weiter in absteigender Reihenfolge. Markieren Sie die Schichten auf dem Rohr mit einer wasserdicht-Markierung.
- Sorgfältig Schicht 2 mL Zellsuspensionen auf jede der beiden vorbereiteten Gradienten.
- Zentrifuge für 20 min bei 800 X g ohne Bremse in einer sorgfältig ausbalancierten Zentrifuge.
- Nach Zentrifugation, entfernen Sie die obere Schicht und den Großteil der 65 % layer (erste Ring) mit PBMCs und sammeln Sie in neue Schläuche die weißen noch Grenzschichten bis 85 %-Schicht (zweiter ring, PMN).
- Waschen Sie Zellen durch Auffüllen der Rohre mit PBS 2 mM EDTA und Zentrifuge für 10 min bei 300 X g ohne Bremse.
- Den überstand zu entfernen und die sedimentierten Zellen (in der Regel sind ≥95 % PMN) in 1 mL Hanks Puffer (pH 7,45), mit 10 mM Hepes und 0,2 % Humanalbumin (testpuffer) aussetzen.
- Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und Zellen auf 1 x 106/mL auszusetzen.
- Fahren Sie mit fluoreszierenden Etikettier- und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3).
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Vorbereitung der adhärenten Thrombozyten- und vaskuläre Zelle-Monolagen
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Zell-Kultur Gericht Vorbereitung (kultivierten Zellen)
- Pre-Mantel die 35 mm Zelle Kultur Gerichte mit 1 mL verdünnter Ratte Schweif Kollagen (30 µg/mL verdünnt mit PBS-Puffer über einen 0,2 µm-Filter gefiltert).
- 30 min bei 37 ° C inkubieren, die Kollagen-Lösung zu verwerfen und das Gericht einmal mit PBS waschen.
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Kultur der vaskulären Zellen in Kultur Gerichte
- Lösen von primären (z. B.HUVECS, HAoEC, HAoSMC) oder verewigt vaskuläre Zellen (z.B.EA. Hy926, SVEC) bis Mündung in einem T75 Kolben mit 1,5 mL Zelle Ablösung Lösung (z.B., Accutase) angebaut. Hinzugeben Sie 4,5 mL geeigneten Wachstumsmedium zu neutralisieren die Zelle Ablösung Lösung und bestimmen die Zellkonzentration mit einer Zelle zählen Kammer. Die Zellen bei 0,5 x 105 Zellen/mL in geeigneten Wachstumsmedium (z.B. komplette Endothelzellen Wachstumsmedium) aussetzen.
- Jedes Gericht 35 mm 2 mL Zellsuspension hinzufügen. Die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 bis zum Zusammenfluss (unter 24 – 48 h, je nach Zelltyp) Kultur.
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Deckglas Glasbearbeitung (adhärenten Thrombozyten)
- Tauchen Sie die Glas-Deckglas einmal in HCl-EtOH (1,2 M / 50 % V/V).
- Spülen Sie das Deckglas 2mal in Reinstwasser.
- Trocknen Sie das Deckglas unter N2.
- Pre-Mantel der Glas-Deckglas mit 100 µL, entsprechend der Position des Kanals der Perfusion Kammer des verdünnten Ratte Schweif Kollagen Typ I (30 µg/mL verdünnt mit PBS-Puffer über einen 0,2 µm-Filter gefiltert).
- 30 min bei RT inkubieren, entsorgen Sie die Kollagen-Lösung und waschen das Deckglas 3 X mit PBS.
- Block das Deckglas Kollagen beschichtet mit 1 % BSA in HEPES für 0,5 h bei RT
- Waschen Sie und trocknen Sie das Deckglas und montieren Sie ihn in die Perfusion Kammer. Thrombozyten aus menschlichen oder Maus Blut wie in Schritt 1.1 oder 2.1, bzw. zu isolieren.
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Immobilisierung von Thrombozyten
- Fügen Sie 70 µL einer 2 x 107/mL Thrombozyten Suspension pro Kanal und inkubieren Sie für 1,5 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie sorgfältig nicht adhärenten Thrombozyten durch blockierende Lösung (5 % BSA in HEPES) für mindestens 30 min bei RT weiter mit fluoreszierenden Kennzeichnung und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3).
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Stimulation der vaskulären Zelle Monoschicht
- Stimulieren Sie die vaskulären Zellen durch Austauschen der Medien mit frischem Medium mit 10 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF) 4 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
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Zell-Kultur Gericht Vorbereitung (kultivierten Zellen)
(2) Flow-based Assays mit murinen Zellen
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Isolierung von Thrombozyten aus Maus Blut
- Zeichnen Blut durch Herzpunktion mit Hilfe einer Nadel 21 G (~ 1 mL) von betäubt (Ketamin 80 mg/kg und Medetomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 Wochen-alte Mäuse (C57Bl/6) in (3,2 %) Citrat als Antikoagulans.
- Fügen Sie 1/6 Volumen von ACD.
- Zentrifuge bei 220 X g, mittlere Bremse für 5 min, Platelet rich Plasma (PRP) zu erhalten.
- Den überstand (~ 600 µL) plus 1/3 der roten Blutkörperchen zu übertragen, zu einem neuen Schlauch
- 95 X g ohne Bremse für 6 min zentrifugieren.
- Den überstand (PRP) zu übertragen und die Thrombozyten Konzentration in einer Verdünnung von 1/10 in Tyrode Puffer Messen (TH Puffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Glukose) mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator.
- Waschen Sie die Thrombozyten durch Hinzufügen von 1/25 Volumen von ACD + 0,1 U/mL Apyrase und 2.870 g, mittlere Bremse für 2 min zentrifugieren.
- Den überstand verwerfen und 600 µL TH Puffer, 1/10-bändige von ACD und 0,1 U/mL Apyrase hinzufügen. Schneiden Sie die pipettieren Spitze (P-1000), trug breit zu machen, hilft bei der Verhinderung von Thrombozyten Aktivierung und sanft auszusetzen das Pellet.
- Zentrifuge auf 2.870 g, mittlere Bremse für 2 min
- Den überstand verwerfen und sanft aussetzen der Thrombozyten in TH Puffer.
- Stellen Sie die Lautstärke mit TH-Puffer, eine Anzahl von 2 x 107/mL zu erreichen.
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Vorbereitung der adhärenten Thrombozyten Monoschichten
- Glas-Deckglas (adhärenten Thrombozyten) gemäß 1.3.3 vorzubereiten.
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Immobilisierung von Thrombozyten
- Fügen Sie 100 µL einer 2 x 107/mL Thrombozyten Suspension pro Kanal und inkubieren Sie für 1,5 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie sorgfältig nicht adhärenten Thrombozyten durch blockierende Lösung (5 % BSA in HEPES) für mindestens 30 min bei RT weiter mit fluoreszierenden Kennzeichnung und Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3)
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Stimulation der Maus Thrombozyten Monoschicht
- Vor Perfusion der Leukozyten (Schritt 3.3), stimulieren die Thrombozyten durch Perfusion von Thrombin (0,5 nM) in HHHSA Puffer für 3 min bei 37 ° C.
(3) fluoreszierende Etikettier- und Perfusion der Leukozyten (PMN oder THP-1 für Menschen- und RAW264.7 oder primäre Maustaste Monozyten für Murine Flow-Based Assay)
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Fluoreszierende Kennzeichnung
- Beschriften Sie die Leukozyten (1 x 106/mL) mit der Zelle-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Nukleinsäure-Fleck (1 µM). Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° c
- Waschen mit PBS-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min, und Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL (5 mL pro Testbedingung, abhängig vom Volumenstrom) in testpuffer auszusetzen.
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Flow Kammer-Test Vorbereitung
- Verwerfen Sie für Leukozyten Adhäsion auf eine Zelle Monolage Zellkulturmedium aus der Schale zu, und setzen Sie es in die Kammer fließen. Schlauch an der Spritze anschließen. Verbinden Sie für Leukozyten Adhäsion auf immobilisierte Thrombozyten die Mikro Folie an der Spritze. Ein Wasserbad auf 37 ° c Vorwärmen
- Nehmen Sie eine Perfusion Spritze (50 mL), Install Spritze auf die Spritze Halter, und die Pumpe auf zurückzutreten Modus. Stellen Sie die Pumpe Lautstärke auf 0 mL, und geben Sie den Durchmesser 26,70 mm für die 50 mL-Spritze.
- Verbinden Sie einen Ellenbogen Luer-Anschluss an einem Ende des Schlauches. Legen Sie ein Luer-Lock-Koppler an der Spritze und verbinden Sie den Schlauch mit dem Ellenbogen Luer-Anschluss an der Luer-Lock-Koppler. Schließen Sie das kostenlose Schläuche an den Strömungsraum.
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Leukozyten-Perfusion und Haftung
- Verwerfen Sie für Leukozyten Adhäsion auf eine Zelle Monolage Zellkulturmedium aus der Schale zu, und setzen Sie es in die Kammer fließen. Schlauch an der Spritze anschließen. Verbinden Sie für Leukozyten Adhäsion auf immobilisierte Thrombozyten die Mikro Folie an der Spritze.
- Für Leukozyten Perfusion und Haftung über einen Kreislauf- oder Thrombozyten Monolage, legen Sie den zweiten Schlauch in ein 50 mL konische Röhrchen mit testpuffer und Füllung tubing mit 1 mL pipettieren, dann drücken Sie den Schlauch und schließen sie eine Strömungsraum.
- Vor der Leukozyten Perfusion der Zellsuspension 3 mM CaCl2 und 2 mM MgCl2 hinzufügen und 5 min bei 37 ° c inkubieren
- Perfundieren Sie testpuffer vor Perfusion der Zellen möglich Luft aus der Kammer und Schläuche zu entfernen.
- Rohrenden in unmittelbarer Nähe drückte sie fest und wechseln Schläuche von testpuffer Zellsuspension, verhindern, dass Luftblasen gefangen. Durchspülen Sie Zellen mit geeigneten Flow Rate/Scherbeanspruchung, bis die ersten Zellen kommen.
- Zellen mit geeigneten Flow Rate/Schubspannung für 2 min durchspülen und mindestens 6 Aufnahmen zwischen 2 – 6 min von Roll- und adhärente Zellen mit einer invertierten Phase Kontrast/Fluoreszenzmikroskop (z.B.EVOS-FL) verbunden mit 100 X Vergrößerung CCD- oder CMOS-Digitalkamera.
Hinweis: Flow Rate/Scherbeanspruchung hängt Fluss Kammer Abmessungen und Viskosität des Perfusat. Perfusion Kammer hier verwendet (siehe Tabelle der Materialien):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: Schubspannung (1 dyn/cm2)
Η: Viskosität (0,015 dyn * s/cm2)
Φ: Durchfluss (0,67 mL/min)
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De-Adhäsion von Leukozyten
- Für De-adhesion wechseln Sie Schläuche von Zellsuspension testpuffer durch zusammendrücken der Schläuche verhindern, dass Luftblasen eingeschlossen.
- Zellen durch Perfusion mit testpuffer mit eine entsprechende Flow Rate/Scherbeanspruchung (siehe 3.3.7 Hinweis) abnehmen.
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Leukozyten Seelenwanderung
- Für Leukozyten Seelenwanderung perfundieren Leukozyten (Schritt 3) bis eine ausreichende Menge der Leukozyten halten (~ 50 Zellen/Sichtfeld).
- Leukozyten-Aufhängung mit testpuffer zu ersetzen.
- Zeichnen Sie fortziehenden Zellen durch Zeitraffer alle 10 – 15 s für 30 – 60 min bei 37 ° C auf.
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Representative Results
Um endotheliale Leukozyten Adhäsion zu untersuchen, wurden eindringmittel beschriftete THP-1-Zellen über eine TNF - oder nicht-stimulierten Endothelzellen Monolage für 2 min bei 3 dyn/cm2durchblutet. Die Gesamtzahl der anhaftende monozytären Zellen wurde nach 2 min der Perfusion durch die Erfassung von 6 unabhängige Felder über einen Zeitraum von 2 bis 6 min ermittelt. Adhärenten Zellen wurden in mindestens 6 Bilder eingefangen mit einer invertierten Phase Kontrast/Fluoreszenzmikroskop (z.B.EVOS-FL) quantifiziert mit 10-facher Vergrößerung an einer digitalen CCD oder CMOS-Kamera angeschlossen und im Durchschnitt war als adhärente Zellen / mm2. Auf Endothelzellen Stimulation mit TNF THP-1 Festnahme deutlich erhöht im Vergleich zu unstimulierte Endothel. Repräsentative mikrographen und die Quantifizierung der fest Anhänger THP-1 nicht - oder TNF-stimulierten Endothelzellen in Abbildung 1dargestellt. Thrombozyten-Leukozyten Adhäsion wurde von Perfusion der Gewebekulturen beschrifteten Neutrophilen über eine TRAP-6 - oder nicht-stimulierten Plättchen Monolage für 2 Minuten bei 1 dyn/cm2bewertet. Anhaftende Neutrophilen wurden quantifiziert, wie oben erwähnt. TRAP-6 Stimulation deutlich erhöht die Haftung der Neutrophilen im Vergleich zu unstimulierte Thrombozyten. Repräsentative Videos und die Quantifizierung der fest anhaftende Neutrophilen zu nicht - oder TRAP-6-stimulierten Plättchen Monolage ist in Abbildung 1Bpräsentiert.
Abbildung 1 : Endothelzellen und Thrombozyten-Leukozyten Adhäsion unter Strömungsbedingungen. Quantifizierung und Vertreter mikrographen der Adhäsion der humanen monozytären Zellen (THP-1), Endothelzellen (HUVECS) ausgesät auf Kollagen-beschichtete Kultur Gerichte unter Strömungsbedingungen, mit oder ohne TNF Aktivierung (10 ng/mL) (A). Quantifizierung und Vertreter mikrographen der Adhäsion der menschlichen Neutrophilen zu menschlichen Thrombozyten immobilisiert auf Kollagen-beschichtete Objektträger unter Strömungsbedingungen, ohne oder mit TRAP-6 Aktivierung (50 µM) (B). P-Werte wurden berechnet, indem der ungepaarten t-Test (n = 3; mittlere ± SD). Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Darüber hinaus kann dieser Test zur Untersuchung der Rolle von Adhäsionsmoleküle, wie zum Beispiel Thrombozyten Knoten Adhäsionsmolekül (JAM-A) implementiert werden. Die Haftung der RAW264.7 Maus Monocyte/Makrophagen, ein Plättchen Monolage von JAM-A (TrJAM-A+ / +) und JAM-A-Mangel (TrJAM-A- / -) Mäuse in unserem ehemaligen Studie7bewertet wurde. Wie darin beobachtet, erhöht Thrombozyten JAM-A-Mangel die Haftung der Maus Monozyten, die Thrombozyten monomolekularen Film im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (Abbildung 2A-B). Alternativ können primäre Maustaste neutrophile als beschrieben12von Mäusen isoliert werden.
Zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen, wie z. B. Adhäsionsmoleküle Thrombozyten-Leukozyten Interaktionen beteiligt können spezifische Oberfläche Rezeptoren blockiert werden. In der oben genannten Studie verringert Sperrung des GPIbα Thrombozyten und Leukozyten αMβ2 deutlich Monocyte Adhäsion, Identifizierung eine Rolle für die GPIbα-αMβ2 Achse bei der erhöhten Monocyte-Rekrutierung, JAM-A-- / - Plättchen (Abbildung 2A-B). Darüber hinaus können Zelle Ablösung Experimente durchgeführt werden, um Scherbeanspruchung Abhängigkeit von Thrombozyten-Leukozyten-Interaktionen zu untersuchen. Für die Messung von Flow-abhängige Ablösung der Monozyten stieg Schubspannung inkrementell von 0 auf 20 Dynes/cm2. In dieser Studie wurde die Haftung der RAW264.7 Zellen auf JAM-A- / - Thrombozyten widerstandsfähiger gegen Stress im Vergleich zu JAM-A Scheren+ / + Thrombozyten (Abbildung 2C).
Abbildung 2 : JAM-A-Mangel fördert Fluss-resistente monozytären Zelladhäsion. Haftung der Maus Monocyte/Makrophagen RAW264.7 Zellen, Blutplättchen von JAM-A+ / + und JAM-A- / - Mäusen immobilisiert auf Kollagen-beschichtete Objektträger unter Strömungsbedingungen, mit oder ohne Aktivierung von Thrombin (IIa, 0,5 nM) in Anwesenheit von angegebenen Inhibitoren (A). Repräsentative mikrographen Maus Monocyte/Makrophagen RAW264.7 Zellen anhaftende JAM-a+ / + und JAM-A- / - Thrombozyten nach einer Behandlung mit Isotype Kontrolle oder Anti-GPIbα Antikörper (B). Zell-Adhäsion, ausgedrückt als Prozentsatz der ursprünglich adhärente Zellen unter schrittweise erhöhte Schubspannung (dyn/cm2) auf immobilisierte Thrombozyten nach Thrombin-Aktivierung (IIa, 0,5 nM). P-Werte wurden berechnet, indem die ANOVA mit Tukey Post-Test (n = 3-5; mittlere ± SEM). Maßstabsleiste = 100 µm. Diese Zahl wurde von Zhao Et Al. modifiziert 7 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die längere Aufnahmezeit (30 – 60 min) der einzelnen Felder nach Leukozyten Perfusion und Adhäsion ermöglicht die Untersuchung der Leukozyten Krabbeln und Verhalten und endgültige Transmigration auf die endotheliale Schicht verteilen. Im Rahmen dieser Studie haben wir die Seelenwanderung primären menschlichen Monozyten (isoliert mit der Monocyte-isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers wie beschrieben13) über eine endotheliale Schicht analysiert. Wie in Abbildung 3, folgenden festen Verhaftung des Endothels präsentiert bereiten Monozyten Leber durch kriechen und die Verbreitung der bevorzugte Ort für Seelenwanderung erreicht ist. Danach dringen Monozyten der Endothelzellen Barriere entweder durch para- oder transzelluläre Migration. Fortziehenden Zellen wurden als Zellen definiert, die auf Endothelzellen, verteilt durch die Erweiterung ihrer Pseudopodien und durchqueren die endotheliale Barriere, damit ihre Helligkeit verringern.
Abbildung 3: In-vitro- Transmigration von primären Monozyten über eine endotheliale Monolage. Monocyte kriechen und sich ausbreitenden und letzte Seelenwanderung über das Endothel verzeichnete alle 15 s für 30 min. Klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Dieser in-vitro- Test ist eine einfache Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während einer vaskulären Entzündung untersuchen, aber es gibt einige kritische Punkte zu beachten. Die erste Voraussetzung für die Durchführung von dieser Test erfolgreich ist die Perfusion der Leukozyten über ein intaktes und konfluierende Gefäß- oder Thrombozyten monomolekularen Film. Dies kann erreicht werden durch die vorherige Beschichtung der Oberflächen mit Kollagen Typ ich. Im Allgemeinen bei der Arbeit mit primären vaskulären Zellen ist es wichtig, die Zellen mit der empfohlenen Kollagenase-haltigen Ablösung Lösung vorsichtig lösen (siehe die Tabelle der Materialien), die weniger streng, aber genauso wirksam wie Trypsin. Für die Thrombozyten Monolagen ist es wichtig, vorsichtig waschen Thrombozyten während Isolierung, Thrombozyten Aktivierung und Aggregation zu verhindern.
Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Kontinuität der Pumpe Rückzug Modus für die Durchblutung, da eine Diskontinuität führt zu Rate und Scherung Strömungsverhältnisse gestört. So führt dies zu Ungenauigkeit der tatsächlichen Schubspannung und in der Folge zu Fehlinterpretationen der physiologisch Scherung-abhängige Prozesse. Dies kann durch regelmäßige Wartung der Pumpe verhindert werden. Darüber hinaus ist entscheidend für die Kontinuität während der Perfusion die Verwendung einer frischen Spritze für jedes Experiment. Seit die Textur des Gummis in der Spritze Veränderungen mit zunehmendem Gebrauch und Zeit zwischen Experimente verhindert, dass es eine kontinuierliche Auszahlung.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Vermeidung von Luft eingeschlossen während der Perfusion der Leukozyten, da Luft wird anschließend Zellen von der Oberfläche abreißen und Scherung Bedingungen zu ändern. Dies kann durch Spülen alle Schläuche vor der Verwendung mit Reinstwasser und dann mit testpuffer verhindert werden. Schläuche aus testpuffer zu Zellsuspension oder von einem Zustand zum anderen verbinden, ist es auch wichtig, flüssige Schnittstellen während der Verbindung zu erhalten. Dies kann erreicht werden durch zusammendrücken des Schlauchs oder von flüssigkeitsständen im Schlauch nicht zu verändern. Weiter, sollte das Flüssigkeitsvolumen der Perfusat immer ausreichen, um zu verhindern, dass das Niveau unterschreiten die Schlauch-Ende und somit Luft in das System aufgegriffen wird.
Eine mögliche Einschränkung des Assays möglicherweise die Verwendung von kultivierten Zellen, die in einer künstlichen Umgebung verwaltet werden, d.h. auf einer Kunststoffoberfläche, umgeben von einem Medium, das nicht genau den Zustand in Vivo Modell kultiviert. Obwohl die physiochemischen und das physiologische Umfeld genau gesteuert werden können, haben kultivierte Zellen eine hohe Wachstumsrate, die genetische Variation und damit die Heterogenität der Zellen innerhalb einer Population erhöht. Darüber hinaus die Kreislauf- oder Thrombozyten Monolage besteht aus nur einem einzigen Zelltyp. Vor allem bei der Untersuchung von endothelialen Leukozyten Interaktionen, d. h., Transmigration von Leukozyten in den Endothelzellen Barriere, die physiologisch relevanten Rolle des zugrunde liegenden Endothelzellen Basalmembran und perizyten können nicht berücksichtigt werden. Alternativ könnte es einen mehrzelligen Umfeld zu schaffen, durch die Umsetzung von 3D-Zell Kultivierung Techniken in diesem Assay interessant sein.
Um zusammenzufassen, unter Berücksichtigung dieser Punkte Laminar-Flow-based Assays kann effizient angewendet werden in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung. Insbesondere kann leicht zu Adresse spezifische Forschungsfragen, d.h. die Anpassung der Scherspannung geändert werden durch entweder Variation der Volumenstrom der Perfusat, die flüssige Viskosität oder Kanalhöhe und Breite. Vor allem ist Letzteres von Bedeutung da Änderungen in den Fluss Kammer Abmessungen reduzieren Flüssigkeitsvolumen oder Zellen benötigt. Weitere, unterschiedliche Fluoreszenz Beschriftung der Leukozyten oder von bestimmten Molekülen der vaskulären oder Thrombozyten Monolagen können zur Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Martin M. Schmitt und Linie Fraemohs. Diese Arbeit wurde von der niederländischen Stiftung für wissenschaftliche Forschung (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) an R.R.K. vergeben unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
