Summary
혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.
Abstract
부상이 나 염증 부상 또는 조직 손상의 사이트에 따라 백혈구의 채용 최근 수십 년 동안 조사 되 고 백혈구 접착 폭포의 개념에 결과 있다. 그러나, 정확한 분자 메커니즘 백혈구 신규 모집에 참여 하지 아직 완전히 확인 되었습니다. 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동) 면역 연구 분야에서 중요 한 주제를 유지, 이후 우리 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 간단한 층 플로우 기반 분석 결과 제시 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생. 생체 외에서 분석 결과 백혈구와 혈관 염증의 다른 모델에서 세포 파트너 간의 상호 작용을 기초 분자 메커니즘 연구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 설명 층 플로우 기반 분석 결과 사용 하 여 병렬 흐름 챔버는 거꾸로 단계 대조 현미경 카메라에 연결 된 백혈구 내 피 세포 및 혈소판, 시각 다음 기록 될 수 있는 상호 작용을 공부 하 오프 라인 분석. 내 피 세포, 혈소판, 또는 백혈구 억제제 또는이 프로세스 동안 특정 분자의 역할을 결정 하는 항 체와 pretreated 될 수 있습니다. 전단 조건, 즉 동맥 또는 정 맥 전단 응력, 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 의해 쉽게 적응 될 수 있다.
Introduction
부상, 염증, 또는 감염, 백혈구 신속 하 게 응답에 병원 체 또는 손상-관련 된 분자 패턴 (PAMPs, DAMPs)는 활성화 상태로 변경 하 고 혈 류 염증과 조직 손상의 사이트로 이동 합니다. 백혈구의 능력을 그들의 세포질이 고 분자 환경 상호 작용 하는 그들의 올바른 기능에 필수적 면역 세포, 백혈구 접착 결핍증1등 유전 질환에 의해 강조입니다. 백혈구 접착은 지난 수 십년 동안 강렬한 수 사의 대상이 되고있다 그리고 이것은 초기 1990 년대2,3백혈구 접착 폭포의 개념 귀착되. 백혈구 접착 일으키는 혈관 표면 롤오버 셀 피에 백혈구의 selectin-중재 캡처로 시작 됩니다. 이 압 연 백혈구를 endothelium 바인딩된 철새 신호, 예를 들면, 발산, integrins의 활성화를 유도 대 한 검색을 수 있습니다. 그 후, 활성화 integrins 회사 백혈구 체포 결과 내 피 ligands 바인딩 중재. 백혈구 수 있습니다 이후 크롤링 및 확산, 내 피 단층을 관통 하 고 기본 조직으로 transmigrating 하기 전에 extravasate를 준비 합니다. 정식 백혈구 캐스케이드의 기본 개념은 그것의 소개부터 크게 불변에 남아 있었다, 몇몇 중간 단계 추가4. 그럼에도 불구 하 고, 정확한 분자 메커니즘 및 백혈구 신규 모집에서 포함 된 많은 선수의 역할을가지고 하지 명확히 지금까지, 그리고 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동-) 면역 분야에서 중요 한 주제에 남아 있다 연구입니다.
예를 들어 동맥 경화 같은 혈관 염증 성 질병, 중 혈관 벽 드라이브 패 개발에 백혈구 신규 모집 증가. 불안정 한 동맥 경 화성 플 라크 파열 수, 혈소판 및 응고 시스템의 대규모 활성화 하 고 그 후 선박5의 폐색을 선도 합니다. 이 심근 경색 이나 뇌졸중 등 심각한 심장 혈관 결과 발생할 수 있습니다. 또한, 백혈구 및 혈소판 (예를 들어, 매트릭스 구성 요소와 부드러운 노출된 혈관 벽 내부에의 상호 작용의 수많은 연결 예: 관상 동맥의 stenting 후 그것으로 내 피 노출 발생 임상, 근육 세포)와 혈소판 혈관 상해 취재와 백혈구의. 이러한 상호 작용은 monocyte 혈소판 상호 작용 neointima 형성6,7드라이브 수 있습니다 질병의 추가 개발을 위한 중요 합니다. 또한, 혈소판-백혈구 상호 작용 백혈구 integrin 맥-1 (αMβ2)에 의해 중재 및 혈소판 GPIbα 최근 쥐8혈전 증의 새로운 드라이버 확인 되었습니다.
연구, 그리고 고립 된 매트릭스 분자의 광범위 한 스펙트럼, 불멸 하 게 세포 백혈구와 혈관 근원의 라인에 대 한 백혈구 및 혈소판의 원천으로 인간과 동물성 혈액의 넓은 가용성을 감안할 때, 그것은 백혈구를 시뮬레이션 가능 설정, 특별히 설계 된 흐름 관류 챔버를 사용 하 여 실험실에서 흐름에서의 상호 작용 많은 변종 접착 관류 챔버 진공 기반에서 지난 수 십년 동안 설계 되었습니다. 모든 이체는 공통점이 움직이지 부분 (예를 들어, 교양된 혈관 세포 또는 매트릭스 단백질)으로 더 큰 누출 방지 챔버를 움직이지 부분에 체액의 관류를 사용 하는 미리 정의 된 채널을 갖춘 조립. 또한, 성형 기술 진보 실리 카 폴리머9기반 맞춤 솔루션의 개발을 사용할 수 있습니다. 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 주로 흐름 관류 장치10의 전단 응력 특성을 결정합니다. 이 문서에서는, 우리는 생체 외에서 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 방법 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생 제시. 여기에 제시 된 방법의 장점은 그들은 일반적인 카메라 연결 된 형광 현미경을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 높은 기술 능력을 보유 하는 경험을 필요 하지 않습니다. 생체 외에서 시험 (예를 들어, 추가 억제제 또는 항 체를 차단 하 여), 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다 따라서 혈관 염증의 다른 모델에 적용 그리고 접착의 조사 단백질 기능을 허용 또는 특정 화합물의 평가입니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 의료 윤리 및 동물 윤리 보드의 마스트리히트 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 플로우 기반 분석 결과 인간 세포와
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인간의 혈액에서 혈소판의 분리
- 응고 제 시트르산 (3.2%)에서 정 맥 혈액을 그립니다.
- 1/15 양의 산 시트르산 포도 당 추가 (ACD: 80mm trisodium 시트르산, 52 m m 구 연산 및 183 mM 포도 당) 피를.
- 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 15 분 동안 브레이크 없이 350 x g에서 원심.
- 15 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 ACD의 1/20 볼륨을 추가 합니다.
- 혈소판 가난한 플라스마 (PPP)를 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 원심.
- 폐기는 상쾌한. 피펫으로 팁 (P 1000)의 끝을 잘라, 그것 넓은 구멍, 혈소판 활성화의 예방에는 에이즈 그리고 신중 하 게 혈소판 버퍼 ph 6.6 PRP와 동일한 볼륨에 혈소판 펠 릿을 일시 중단 (PB: 136 m m NaCl, 10 mM Hepes 2.7 m m KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.1% 포도 당). ACD의 20 분의 1 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
- 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 혈소판 작은
- 삭제는 상쾌한 고 신중 하 게 위에 혈소판 1 mL 혈소판 버퍼 (pH 7.5) 일시 중단.
- 자동된 혈액학 분석기 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 합니다.
- 2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 혈소판 버퍼 (pH 7.5)로 볼륨을 조정 합니다.
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(Brinkmann 외. 에서 적응 하는 인간의 혈액에서 polymorphonuclear 세포의 고립 11 )
- 헤 파 린 (10 U/mL)로 응고 제 24 mL의 혈액을 그립니다.
- 1.077 g/mL 밀도 polysucrose 나트륨 diatrizoate 매체의 6 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 신중 하 게 위에 레이어 5-6 mL 전 혈을.
- 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 발음 하 고 명확한 노란 가기 레이어를 삭제 낮은 붉은 단계 granulocytes 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된 전송. 2 mM EDTA 14 mL, 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기의 최종 볼륨을 포함 하는 PBS를 추가 하 여 셀을 씻어.
- 한편, 밀도 그라데이션 중간 준비 (예를 들어, percoll, 재료의 표참조) 2 mL PBS 재고 솔루션 x 10와 18 mL 밀도 그라데이션 매체를 혼합 하 여 작업 솔루션. PBS이 작업 솔루션을 희석 (1x) 85%, 80%, 75%, 70%, 그리고 65% 그라데이션 중간 솔루션 4.25 mL를.
- 서로 모든 중간 비율의 2 개 mL를 레이어 링 하 여 밀도 그라데이션으로 2 원뿔 튜브를 준비 합니다. 가장 높은 농도 함께 시작 하 고 감소 하는 순서에서 계속. 튜브에 레이어 방수 표시와 함께 표시 합니다.
- 신중 하 게 각 두 준비 그라디언트에 세포 현 탁 액의 2 mL 레이어.
- 신중 하 게 균형된 원심 분리기에서 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 원심, 후 상위 계층 및 65%의 대부분을 제거 레이어 (첫 번째 링) PBMCs, 그리고 interphases 85% 계층까지 남은 화이트 새로운 튜브에 수집 (두번째 반지, PMN).
- PBS 2 m m EDTA, 튜브 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기를 작성 하 여 세포를 씻어.
- 상쾌한을 제거 하 고 행 크의 버퍼 (pH 7.45), 포함 10 mM Hepes 및 0.2% 인간의 알 부 민 (분석 결과 버퍼)의 1 mL에 sedimented 셀 (일반적으로 ≥95 %는 PMN) 일시 중단.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 1 x 106/mL에서 일시 중단.
- 형광 라벨 및 관류 백혈구 (단계 3.3)의 계속.
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준비의 부착 혈소판-혈관 세포-monolayers
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세포 배양 접시 준비 (경작된 한 세포)
- 미리 희석된 쥐 꼬리 콜라겐 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)의 1 mL와 함께 35 mm 셀 문화 요리 코트.
- 37 ° C에서 30 분 동안 incubate 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고, 한 번 PBS 가진 접시를 세척.
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문화 요리에서 혈관 세포의 문화
- 주 (예를 들어, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) 또는 (예를 들어, EA 불멸 하 게 혈관 세포 분리. Hy926, SVEC) 1.5 mL 셀 분리 솔루션 (예를 들어, accutase) T75 플라스 크에 합류를 성장. 세포 분리 솔루션 무력화 챔버 계산 셀 셀 농도 결정 하는 적절 한 성장 매체의 4.5 mL를 추가 합니다. 적절 한 성장 매체 (예를 들면, 완전 한 내 피 세포 성장 매체)에 105 셀/mL x 0.5에서 세포를 일시 중단 합니다.
- 각 35 mm 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가 합니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 셀 (셀 유형에 따라 24-48 h 복용) 합류까지 문화.
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유리 coverslip 준비 (혈소판 부착)
- HCl EtOH에 한 번 유리 coverslip 담가 (1.2 M / 50 %v / v).
- 초순에 2 번 coverslip 린스.
- N2coverslip 건조.
- 사전 코트 유리 coverslip 희석된 쥐 꼬리 콜라겐의 관류 챔버의 채널의 위치에 따라 100 µ L와 난 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)을 입력 합니다.
- RT에서 30 분 동안 품 어 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 씻어 coverslip 3 x PBS.
- 실시간에서 0.5 h HEPES에 1 %BSA 콜라겐 코팅 coverslip 차단
- 세척 하 고 건조는 coverslip 관류 챔버에 탑재. 격리에서 인간 혈소판 또는 각각 1.1 또는 2.1, 단계에 설명 된 대로 마우스 피.
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혈소판의 동원 정지
- 채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 70 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.
- 신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판 대체.
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혈관 세포 단층의 자극
- 37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 신선한 미디어 10 ng/mL 종양 괴 사 인자 α (TNFα)를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 혈관 세포를 자극.
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세포 배양 접시 준비 (경작된 한 세포)
2. 플로우 기반 분석 Murine 셀
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마우스의 혈액에서 혈소판의 분리
- 심장 빵 꾸에서 21 G 바늘 (~ 1 mL)을 사용 하 여 그리기 피 취 (마 취 제 80 mg/kg 및 medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 주-오래 된 마우스 (C57Bl/6)로 응고 제 시트르산 (3.2%)에서.
- ACD의 1/6 볼륨을 추가 합니다.
- 220 x g에서 원심 분리기, 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 5 분 동안 중간 브레이크.
- 새로운 튜브에 적혈구의 1/3 플러스 상쾌한 (~ 600 µ L)를 전송
- 6 분 브레이크 없이 95 x g에서 원심.
- 상쾌한 (PRP)을 전송 하 고 Tyrode의 버퍼에 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 (TH 버퍼: 136 m NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 m m KCl, 0.42 m NaH2포4m m * H2O 2 m m MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민, 0.1% 포도 당) 자동된 혈액학 분석기.
- ACD + 0.1 U/mL apyrase의 1/25 볼륨을 추가 하 여는 혈소판을 세척 하 고 2,870 g, 2 분 동안 중간 브레이크에서 원심.
- 삭제는 상쾌한 고 600 µ L TH 버퍼, ACD의 1/10 볼륨 및 0.1 U/mL apyrase를 추가 합니다. 피펫으로 팁 (P 1000)를 잘라 넓은 만드는 보어, 혈소판 활성화의 예방에서 원조 하 고 부드럽게 펠 릿을 일시 중단.
- 2,870 g에서 원심 분리기, 2 분 동안 중간 브레이크
- 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 일 버퍼에는 혈소판을 일시 중단.
- 2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 일 버퍼와 볼륨을 조정 합니다.
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혈소판 부착 monolayers의 준비
- 1.3.3 당 유리 coverslip (부착 혈소판)를 준비 합니다.
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혈소판의 동원 정지
- 채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.
- 신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판을 바꿉니다
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마우스 혈소판 단층의 자극
- 백혈구 (단계 3.3)의 관류, 전에 트 롬 빈의 관류에 의해는 혈소판을 자극 (0.5 nM) 37 ° c.에 3 분 동안 HHHSA 버퍼에
3. 형광 라벨 및 백혈구 (PMN 또는 인간과 RAW264.7 THP-1 또는 Murine 플로우 기반 분석 결과 대 한 기본 마우스 Monocytes)의 관류
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형광 라벨
- 셀 permeant 녹색 형광 핵 산 얼룩 (1 µ M) 백혈구 (1 x 106/mL) 레이블을. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어
- 5 분, 300 x g에서 원심 분리 하 여 PBS 가진 세포를 세척 하 고 0.5 x 106 셀/mL (5 mL 당 유량에 따라 테스트 조건) 분석 결과 버퍼에서의 농도에 세포를 중단.
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흐름 챔버 시험 준비
- 셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다. 미리 따뜻한 물 목욕 37 ° c
- 받아 관류 주사기 (50 mL), 설치 주사기 주사기 홀더, 및 세트에 펌프 철회 모드. 0 ml, 펌프 볼륨을 설정 하 고 50 mL 주사기 26.70 m m 직경 설정.
- 튜브의 한쪽 끝을 팔꿈치 luer 커넥터를 연결 합니다. 주사기에 luer 잠금 커플러 놓고 luer 잠금 커플러를 팔꿈치 luer 커넥터와 튜브를 연결 합니다. 흐름 약 실에 무료 튜브 끝을 연결 합니다.
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백혈구 관류 및 접착
- 셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다.
- 백혈구 관류와 접착에는 혈관에 대 한-또는 혈소판 단층, 분석 결과 버퍼 채우기 1 mL 피펫으로와 튜브를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 두 번째 튜브 다음 놓고, 튜브를 집어넣은 흐름 챔버에 연결.
- 백혈구 관류, 이전 세포 현 탁 액을 3mm CaCl2 와 2 mM MgCl2 를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
- 챔버와 튜브에서 가능한 공기를 제거 하는 셀의 관류 사전 분석 결과 버퍼 perfuse
- 꽉 그들을 당기고 하 여 튜브 끝을 닫고 갇혀에서 기포를 방지 세포 현 탁 액을 분석 결과 버퍼에서 튜브를 전환 합니다. 첫 번째 셀 도착할 때까지 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀을 perfuse.
- 2 분에 대 한 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀 perfuse 및 (예를 들어, EVOS FL) 거꾸로 위상 대비/형광 현미경으로 압 연 및 부착 세포의 2-6 분 사이 6 사진을 캡처할 100 배 확대를 사용 하 여 연결 에 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라.
참고: 흐름 속도/전단 응력 흐름 챔버 크기와 perfusate의 점도에 따라 달라 집니다. 여기에서 사용 하는 관류 챔버에 대 한 ( 재료의 표참조):
Τη= *Φ 97.1*
Τ: 전단 응력 (1 dyn/cm2)
Η: 점성 (0.015 dyn * s/cm2)
Φ: 유량 (0.67 mL/min)
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백혈구 드 접착
- De-adhesion에서 덫을 놓아 되 고 기포를 방지 튜브를 압박 하 여 분석 결과 버퍼에 셀 서 스 펜 션에서 튜브를 전환 합니다.
- 세포 관류 적절 한 흐름 속도/전단 응력 (참조 3.3.7 참고) 분석 결과 버퍼와 분리 합니다.
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백혈구 환생
- 백혈구 환생에 대 한 백혈구 (3 단계) perfuse는 적절 한 양의 백혈구 준수 (~ 50 셀/보기 분야) 때까지.
- 분석 결과 버퍼에 백혈구 정지를 바꿉니다.
- 시간 경과 의해 37 ° c.에 30-60 분 마다 10-15 s transmigrating 셀을 기록
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Representative Results
공부 하 고 내 피 백혈구 접착, 붙일 레이블된 THP-1 셀 했다 3 다 인/c m2에서 2 분에 대 한 TNFα 또는 비 자극 하는 내 피 단층 위에 끼얹는다. 부착 monocytic 세포의 총 수는 2-6 분 동안 6 독립 필드를 캡처하여 관류의 2 분 후 결정 되었다. 부착 세포 6 사진 거꾸로 위상 대비/형광 현미경 (예를 들어, EVOS FL)으로 캡처한 계량 했다 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라에 연결 된 10 배 확대를 사용 하 고 평균 부착 세포로 표현 되었다 / mm2. TNFα와 내 피 자극 시 THP 1 체포 크게 unstimulated endothelium에 비해 증가. 대표 현미경과의 정량화 단단히 부착 THP-1 비-또는 TNFα-자극 내 피 세포를 그림 1에 표시 됩니다. 혈소판-백혈구 접착 1 다 인/c m2에서 2 분 트랩 6 또는 비 자극 혈소판 단층에 붙일 레이블된 호 중구의 재 관류에 의해 평가 했다 있습니다. 위에서 언급 한 대로 부착 neutrophils 정량 했다. 트랩 6 자극은 크게 unstimulated 혈소판 상대적 호 중구의 접착을 증가 했다. 대표적인 비디오 및 비-또는 트랩-6-자극 혈소판 단층에 단단히 부착 호 중구의 정량화는 그림 1B에 제공 됩니다.
그림 1 : 흐름 조건 내 피-고 혈소판-백혈구 접착. 내 피 세포 (HUVEC)에 인간 monocytic 셀 (THP-1)의 접착의 정량화 및 대표 현미경 흐름 조건, 또는 TNFα 활성화 (10 ng/mL) 없이 콜라겐 코팅 문화 요리에 시드 (A). 인간의 호 중구 흐름 조건 콜라겐 코팅 유리 슬라이드에 움직일 수 없이 인간 혈소판 또는 트랩 6 활성화 (50 µ M)의 접착의 정량화 및 대표 현미경 사진 (B). P 값은 짝이 없는 t-검정에 의해 계산 되었다 (n = 3; ± SD를 의미). 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
또한,이 분석 결과 접착 분자, 혈소판 접합 접착 분자 (잼 A) 등의 역할을 연구 하기 구현할 수 있습니다. RAW264.7 마우스 monocyte/대 식 세포 혈소판 단층에 잼 A에서의 접착 (trJAM A+ +) (trJAM-A-/-) 잼-A-결핍 쥐 우리의 이전 연구7에 평가 했다. 거기에 관찰, 혈소판 잼 A 결핍 야생 타입 마우스 (그림 2A-B)에 비해 혈소판 단층을 마우스 monocytes의 접착 력 증가. 또는, 기본 마우스 neutrophils 설명12마우스에서 격리 될 수 있습니다.
혈소판-백혈구 상호 작용에 관련 된 접착 분자 같은 기본 메커니즘 연구를 특정 표면 수용 체를 차단할 수 있습니다. 앞서 언급 한 연구에서 잼 A-/-을 증가 monocyte 모집에 GPIbα-αMβ2 축에 대 한 역할을 식별 하는 monocyte 접착 감소 크게 GPIbα 혈소판 및 백혈구 αMβ2 의 차단 혈소판 (그림 2A-B). 또한, 세포 분리 실험 혈소판-백혈구 상호 작용의 전단 응력 의존 조사를 수행할 수 있습니다. Monocytes의 흐름-종속 초연의 측정에 대 한 전단 응력 증분 20 다 인/c m2를 0에서 증가 되었다. 이 연구에서 잼-A-/- 혈소판에 RAW264.7 세포의 접착 전단 잼 A에 비해 스트레스에 더 저항 했다+ + 혈소판 (그림 2C).
그림 2 : 잼-A-결핍 흐름 저항 monocytic 세포 접착 증진. 잼-A에서 혈소판을 마우스 monocyte/대 식 RAW264.7 세포의 접착 세포+ + 및 흐름 조건, 또는 트 롬 빈의 활성화 없이 콜라겐 코팅 유리 슬라이드에 움직일 잼-A-/- 생쥐 (IIa, 0.5 nM)의 존재 표시 된 저 해제 (A) 마우스 monocyte/macrophage RAW264.7의 대표적인 현미경 세포 잼 a 점착+ + 및 제어 또는 안티-GPIbα 항 체 isotype (B) 치료 후 잼-A-/- 혈소판. 세포 접착 고정된 혈소판에서 트 롬 빈의 활성화 후 증분 증가 전단 응력 (다 인/cm2)에서 처음 부착 세포의 백분율로 표시 (IIa, 0.5 nM). P 값 Tukey의 테스트 후과 ANOVA에 의해 계산 되었다 (n = 3-5; ± SEM을 의미). 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림에서 Zhao 그 외 수정 되었습니다. 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
단일 필드 백혈구 관류 및 접착의 장기간된 녹화 시간 (30-60 분) 백혈구 크롤링 및 내 피 층에 걸쳐 동작 및 최종 환생 확산의 연구를 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 내 피 계층에 걸쳐 기본 인간 monocytes (monocyte 격리 키트 설명13제조업체의 지침에 따라 절연)의 환생을 분석 했습니다. 그림 3다음 회사 체포 endothelium, 제시 monocytes 크롤링 및 환생에 대 한 선호 하는 사이트에이 때까지 확산 하 여 extravasate을 준비 합니다. 그 후, monocytes 침투 내 피 세포 장벽을 파라 또는 transcellular 마이그레이션에 의해. Transmigrating 세포는 내 피 세포에 그들의 pseudopodia를 확장 하 고 그들의 밝기를 낮추면 내 피 방 벽을 통과 하 여 밖으로 확산 하는 셀으로 정의 되었다.
그림 3: 생체 외에서 내 피 단층에 걸쳐 기본 monocytes의 환생. Monocyte 크롤링 및 확산 및 마지막 환생 endothelium에 걸쳐 기록 했다 매 15 30 분 에 대 한 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 생체 외에서 분석 결과 혈관 염증, 동안 백혈구 신규 모집의 기본 메커니즘을 조사 하는 간단한 방법 이지만 지적을 몇 가지 중요 한 포인트는. 이 분석 결과 성공적으로 수행 하기 위한 첫 번째 요구 사항은 백혈구는 그대로 고 confluent 혈관 또는 혈소판 단층의 살포 이다. 이 사전 코팅 콜라겐 유형 표면의 난에 의해 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 주요 혈관 세포를 작업할 때 그것은 부드럽게 권장된 콜라 포함 된 분리 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리 하는 것이 중요 (참조 테이블의 자료), 덜 엄격한입니다, 하지만 효과적 트립 신으로. 혈소판 monolayers에 대 한 혈소판 활성화 및 집계를 방지 하기 위해 절연 동안 혈소판을 부드럽게 씻어 중요 하다.
또 다른 중요 한 고려 사항은 펌프의 연속성을 유지 하 고 있다 철수 모드는 불연속성을 리드 이후는 관류에 대 한 사용 방해 흐름 속도 전단 조건. 따라서, 부정확 실제 전단 응력의 하 고, 그 후, 순수 전단 종속 프로세스의 오해를 발생합니다. 이 펌프의 정기적인 유지 관리에 의해 막을 수 있습니다. 또한, 관류 동안 연속성에 대 한 중요 한 모든 실험에 대 한 신선한 주사기의 사용이 이다. 사용과 실험 사이 시간 증가 함께 주사기 변경 내에서 고무의 질감, 이후 지속적인 철수를 방지 합니다.
더 중요 한 단계 이후 공기 표면에서 세포를 떼어낼 이후에 되며 전단 조건을 변경할 백혈구의 재 관류 동안 갇혀 되 고 공기의 예방입니다. 이것은 매우 순수한 물으로 그리고 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 모든 튜브 사전 rinsing 하 여 방지할 수 있습니다. 또한, 분석 결과 버퍼 세포 현 탁 액, 또는 다른 한 상태에서 튜브를 연결할 때 연결 하는 동안 액체 인터페이스를 유지 하기 위해 중요 하다. 이 튜브를 당기고 또는 하지 튜브 내의 액체 레벨을 변경 하 여 얻을 수 있습니다. 또한,는 perfusate의 유체 볼륨 항상 튜브 끝 아래 떨어지는 수준을 방지 하 고, 따라서, 시스템에 채택 되 고 공기에 충분 해야 한다.
이 분석 결과의 가능한 제한 즉, vivo에서 상태를 정확 하 게 모델링 하지 않는 매체에 의해 포위 하는 플라스틱 표면에 경작 인공 환경에서 유지 되는 배양된 세포의 사용을 수 있습니다. Physiochemical 및 생리 적인 환경을 정확 하 게 제어할 수 있습니다, 비록 교양된 세포 유전 변이 따라서 인구 내의 셀의이 급속 한 성장 속도를 있다. 또한,는 혈관-또는 혈소판 단층만 단일 셀 형식의 구성 됩니다. 특히, 내 피 세포 장벽을, 기본 내 피 세포 지하실 막 그리고 pericytes의 순수 관련 역할 내 피 백혈구 상호 작용, 즉, 백혈구의 환생을 조사할 때 계정에 반입할 수 없습니다. 또는 그것은이 분석 결과에서 3D 셀 자란 기법을 구현 하 여 다세포 환경 만들 재미 있을 수도 있습니다.
요약 하면, 이러한 점을 고려해 서, 층 류 기반 분석 결과 효율적으로 적용할 수 혈관 염증의 다른 모델에. 특히, 그것은 수정할 수 있습니다 쉽게 주소 특정 연구 질문, 즉 전단 응력의 조정에서 perfusate, 액체의 점도, 또는 채널 높이 너비의 흐름 속도 변화 하 여. 특히, 후자는 중요성의 변화 흐름 챔버 크기에서 감소 시켜 유체 볼륨 또는 셀 필요입니다. 또한, 다른 형광 라벨 백혈구, 또는 혈관의 특정 분자의 또는 혈소판 monolayers 세포 세포 상호 작용을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 박사 마틴 M. 슈미트와 선 Fraemohs 감사합니다. 이 작품 (ZonMW VIDI 016.126.358, 혈액 수혈 연구 (LSBR Nr. 1638) Landsteiner 재단 및 도이치 가운데 (SFB1123/A2) R.R.K.에 게 수 여 과학적인 연구를 위한 네덜란드 기초에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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