Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Laminær strømning-baserte analyser undersøke leukocytter rekruttering på kulturperler vaskulære celler og tilhenger blodplater

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57009

Summary

Leukocytter samhandle ivrig med vaskulære celler og blodplater etter fartøyet veggen skade eller under betennelse. Her beskriver vi en enkel laminær strømning-baserte analysen betegner molekylære mekanismer underlie samspillet mellom leukocytter og deres cellular partnere.

Abstract

Rekruttering av leukocytter skade eller betennelse områder for skade eller skade på vev har blitt undersøkt i løpet av de siste tiårene, og har resultert i begrepet leukocytter vedheft cascade. Men nøyaktig molekylære mekanismer involvert i leukocytter rekruttering ennå ikke blitt fullt har identifisert. Siden leukocytter rekruttering fortsatt et viktig tema innen infeksjon og betennelse (auto-) immun forskning, presenterer vi en enkel laminær strømning-baserte analysen studere underliggende mekanismene vedheft, de vedheft, og Transmigration av leukocytter under venøs og arteriell regimer. I vitro analysen kan brukes å studere molekylære mekanismer underlie samspillet mellom leukocytter og deres cellular partnere i forskjellige modeller av vaskulær betennelse. Denne protokollen beskriver en laminær strømning-baserte analysen ved hjelp av en parallell-flow chamber og en invertert fase kontrast mikroskop koblet til et kamera for å studere samspillet av leukocytter og endotelceller eller blodplater, som kan visualisere og spilt inn så analysert frakoblet. Endotelceller, blodplater eller leukocytter kan være forbehandlet med hemmere eller antistoffer finne rollen bestemt molekyler under denne prosessen. Skjær forhold, dvs venøs eller arteriell skjæring stress, kan lett tilpasses av viskositet og strømningshastighet på perfused væsker og høyden på kanalen.

Introduction

Ved skade, betennelse eller infeksjon reagere leukocytter raskt til patogen - eller skader-forbundet molekylær mønster (PAMPs, DAMPs), endre til en aktivert tilstand, og flytte ut av blodstrømmen til områder av betennelse og vev skade. Evne til leukocytter å samhandle med omgivelsene cellulære og molekylære er viktig for deres fungerer som immunceller, som fremhevet av genetiske lidelser som leukocytter vedheft mangel1. Leukocytter vedheft har vært gjenstand for intens granskning i løpet av de siste tiårene, og dette har ført til begrepet leukocytter vedheft gjennomgripende i tidlig på 1990-tallet2,3. Leukocytter vedheft er initiert av selectin mediert erobringen av leukocytter til endotelet, forårsaker cellene til å rulle over vaskulær overflaten. Dette rullende kan leukocytter skanne for endotelet-bundet vandrende Stikkordene, f.eks, chemokines, som induserer aktivering av integrins. Deretter megle aktivert integrins bindingen til endothelial ligander, resulterer i fast leukocytter arrestasjon. Leukocytter kan deretter forberede til extravasate ved gjennomgang og spre, gjennomtrengende endotelial monolayer og transmigrating til underliggende vev. Det grunnleggende konseptet av kanoniske leukocytter kaskade har vært stort sett uendret siden introduksjonen, med noen mellomliggende trinn lagt4. Likevel nøyaktig molekylære mekanismer og rollene til de mange spillerne involvert i leukocytter rekruttering har ikke avklart hittil, og leukocytter rekruttering er fortsatt et viktig tema innen infeksjon, betennelser og (auto-) immun forskning.

For eksempel økt under vaskulær inflammatoriske sykdommer som aterosklerose, leukocytter rekruttering til fartøyet veggen stasjoner plakk utvikling. Ustabil aterosklerotisk plaketter kan brudd, fører til massiv aktivering av blodplater og koagulering systemet og okklusjon av fartøyet5. Dette kan resultere i alvorlig hjerte resultater som hjerteinfarkt eller hjerneslag. I tillegg endotelial denudation som det oppstår klinisk, f.eks etter stenting av en koronar, fører til en rekke interaksjoner av leukocytter og blodplater til utsatte fartøyet veggen interiøret (f.eks, matrix komponenter og glatt muskel celler) og av leukocytter med blodplater dekker vaskulære skader. Disse interaksjonene er viktig for videre utvikling av sykdommen som monocytt-Platederivert interaksjoner kan kjøre neointima formasjon6,7. I tillegg blodplater-leukocytter interaksjoner formidlet av leukocytter integrin Mac-1 (αMβ2) og blodplater GPIbα har nylig blitt identifisert som roman driverne av tromboser i mus8.

Gitt bred tilgjengelighet for mennesker og dyr blod som leukocytter og blodplater for forskning og bredt spekter av isolerte matrix molekyler og udødeliggjort linjer av leukocytter og vaskulær opprinnelse, er det mulig å simulere leukocytter samhandlingene under flyt i et laboratorium innstilling, bruker spesialdesignet flyt perfusjon kamre. Mange varianter har utviklet over de siste tiårene, alt fra vakuum-drevet til selvklebende perfusjon kamre. Alle varianter har til felles at delen immobile (f.eks, kultivert vaskulære celler eller matrix proteiner) settes sammen til en større lekkasjefri kammer utstyrt med en forhåndsdefinert kanal aktivere perfusjon av væsker over delen immobile. I tillegg aktivert fremskritt i molding teknologien utvikling av skreddersydde løsninger basert på silica polymerer9. Viskositet og strømningshastighet på perfused væsker og høyden på kanalen bestemmer hovedsakelig skjæring stress kjennetegner flyt perfusjon enhet10. I denne artikkelen presenterer vi en i vitro metoden å studere underliggende mekanismene vedheft, de vedheft og transmigration av leukocytter under venøs og arteriell regimer. Fordelen av metodene presenteres her er at de utføres med et vanlig kamera koblet fluorescens mikroskop og krever ikke en forskere å ha høy teknisk kompetanse. I vitro analysen kan manipuleres i mange måter (f.eksved å legge hemmere eller blokkerer antistoffer), og gjelder dermed i forskjellige modeller av vaskulær betennelse og lar etterforskningen av vedheft protein funksjoner eller evaluering av bestemte forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av medisinsk etiske og dyr etiske styrene av Maastricht University.

1. flyten-baserte analysen med menneskelige celler

  1. Isolering av blodplater fra menneskelig blod
    1. Tegne venøst blod i citrate (3,2%) antikoagulerende.
    2. Legg 1/15 volumet av syre Citrate druesukker (ACD: 80 mM trisodium citrate, 52 mM sitronsyre og 183 mM glukose) til blodet.
    3. Sentrifuge 350 x g uten brems i 15 min å få Platederivert rik plasma (PRP).
    4. Overføre nedbryting slik 15 mL koniske og legge 1/20 volumet av ACD.
    5. Sentrifuge 1,110 g uten brems i 15 min å få Platederivert dårlig plasma (PPP).
    6. Kast nedbryting. Klipp av slutten av Pipetter spissen (P 1000), gjør det brede bar, som hjelpemidler i forebygging av blodplater aktivisering, og nøye suspendere Platederivert pellet i samme volum som PRP i blodplater buffer pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% bovin serum albumin og 0,1% glukose). Legg 1/20 volumet av ACD og bland forsiktig.
    7. Pellets blodplater 1,110 g uten brems i 15 min.
    8. Forkast nedbryting og nøye suspendere blodplater som ovenfor i 1 mL Platederivert buffer (pH 7.5).
    9. Måle Platederivert konsentrasjonen i en 1/10 fortynning med en automatisert hematologi analyzer.
    10. Juster volumet med Platederivert buffer (pH 7.5) å oppnå antall 2 x 107/mL.
  2. Isolering av polymorfonukleære celler fra menneskelig blod (tilpasset fra Brinkmann et al. 11 )
    1. Tegne 24 mL blod i heparin (10 U/mL) som antikoagulerende.
    2. Legge til 6 mL av 1.077 g/mL tetthet polysucrose natrium diatrizoate medium (se Tabell of Materials) til en 15-mL konisk rør, og nøye lag 5-6 mL fullblod på toppen.
    3. Sentrifuge for 20 min 800 x g uten brems.
    4. Sug opp og kaste klart gulaktig topplaget og overføre den lavere rødlige fasen som inneholder granulocytter i frisk 15-mL konisk rør. Vask celler ved å legge til PBS med 2 mM EDTA til et endelig antall 14 mL og sentrifuge for 10 min 300 x g uten brems.
    5. I mellomtiden forbereder en tetthet gradert medium (f.ekspercoll, se Tabellen for materiale) fungerende løsning ved å blande 18 mL tetthet gradert medium med 2 mL 10 x PBS lagerløsning. Fortynne arbeider løsningen med PBS (1 x) å få 4,25 mL hver av 85%, 80%, 75%, 70% og 65% gradient middels løsninger.
    6. Klargjør 2 konisk rør med tetthet gradient ved lagdeling 2 mL av hver middels oppå hverandre. Start med den høyeste konsentrasjonen og fortsette i synkende rekkefølge. Merke lagene på røret med en vanntett markør.
    7. Nøye laget 2 mL av cellen suspensjon på hver av de to forberedt graderingene.
    8. Sentrifuge for 20 min 800 x g uten brems i en forsiktig balansert sentrifuge.
    9. Etter sentrifugering, fjerne det øverste laget og de fleste av 65% lag (første ring) med PBMCs, og samle inn nye rør hvit gjenværende interphases til 85% laget (andre ring, PMN).
    10. Vask celler ved å fylle opp rør med PBS 2 mM EDTA og sentrifuge for 10 min 300 x g uten brems.
    11. Fjern nedbryting og suspendere sedimented cellene (vanligvis ≥95% er PMN) i 1 mL av Hank's buffer (pH 7.45), som inneholder 10 mM Hepes og 0,2% menneskelige albumin (analysebuffer).
    12. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og suspendere cellene på 1 x 106/mL.
    13. Fortsett med fluorescerende merking og perfusjon av leukocytter (trinn 3.3).
  3. Utarbeidelse av tilhenger blodplater- og vascular celle-monolayers
    1. Celle kultur parabol forberedelse (kultivert celler)
      1. Pre coat 35 mm celle kultur retter med 1 mL av utvannet rotte hale kollagen (30 µg/mL fortynnet i PBS filtrert over filtere 0,2 µm).
      2. Inkuber i 30 min på 37 ° C, forkaste kollagen løsningen og vaske parabolen gang med PBS.
    2. Kultur av vaskulære celler i kultur retter
      1. Koble primær (f.eksHUVEC, HAoEC, HAoSMC) eller udødeliggjort vaskulære celler (f.eksEA. Hy926, SVEC) vokst til samløpet i en MT75 bolle med 1,5 mL celle avdeling løsning (f.eks, accutase). Legge til 4,5 mL av aktuelle oppblomstringen medium å nøytralisere celle avdeling løsningen å bestemme cellen konsentrasjonen med en celle teller kammer. Suspendere cellene på 0,5 x 105 celler/mL i riktig vekst medium (f.eks, komplett endothelial celle vekst medium).
      2. Legge til 2 mL celle suspensjon hver 35 mm rett. Kultur cellene i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO2 til samløpet (tar 24-48 timer, avhengig av hvilken celle).
    3. Glass dekkglassvæske forberedelse (tilhenger blodplater)
      1. Fordype glass dekkglassvæske i HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Skyll dekkglassvæske 2 ganger i ultrapure vann.
      3. Tørr dekkglassvæske under N2.
      4. Pre pels glass dekkglassvæske med 100 µL, i henhold til plasseringen av kanalen av perfusjon Mysteriekammeret utvannet rotte hale kollagen skriver jeg (30 µg/mL fortynnet i PBS filtrert over filtere 0,2 µm).
      5. Inkuber i 30 min på RT forkaste kollagen løsningen og vask dekkglassvæske 3 x med PBS.
      6. Blokkere kollagen belagt dekkglassvæske med 1% BSA i HEPES 0,5 h på RT.
      7. Vask og tørk dekkglassvæske og montere den i perfusjon kammeret. Isolere blodplater fra menneskelige eller musen blod som beskrevet i trinn 1.1 eller 2.1, henholdsvis.
    4. Immobilisering av blodplater
      1. Legg 70 µL av en 2 x 107/mL Platederivert suspensjon per kanal, og ruge 1.5 h 37 ° C og 5% CO2.
      2. Nøye erstatte ikke-tilhenger blodplater blokkerer løsning (5% BSA i HEPES) for minst 30 min på RT. Fortsett med fluorescerende merking og perfusjon av leukocytter (trinn 3.3).
    5. Stimulering av vascular celle monolayer
      1. Stimulere vaskulære celler ved å erstatte media med fersk mediet som inneholder 10 ng/mL tumor nekrose faktor î± (TNFα) 4 h 37 ° C og 5% CO2.

2. flyten-baserte analysen med Murine celler

  1. Isolering av blodplater fra musen blod
    1. Trekke blod av cardiac punktering bruker en 21 G nål (~ 1 mL) fra anesthetized (ketamin 80 mg/kg og medetomidine 0,3 mg/kg) 6-8-uke-gamle mus (C57Bl/6) i citrate (3,2%) som antikoagulerende.
    2. Legg 1/6 volumet av ACD.
    3. Sentrifuger 220 x g, middels brems for 5 min å få Platederivert rik plasma (PRP).
    4. Overføre nedbryting (~ 600 µL) pluss 1/3 av røde blodlegemer til en ny tube
    5. Sentrifuge 95 x g uten brems for 6 min.
    6. Overføre nedbryting (PRP) og måle Platederivert konsentrasjonen i en 1/10 fortynning i Tyrode's buffer (TH buffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0.42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1% bovin serum albumin og 0,1% glukose) med en automatisert hematologi analyzer.
    7. Vask blodplater ved å legge til 1/25 volumet av ACD + 0,1 U/mL apyrase, og sentrifuge 2,870 g, middels brems i 2 minutter.
    8. Forkast nedbryting og 600 µL TH buffer, 1/10 volumet av ACD og 0,1 U/mL apyrase. Avskåret Pipetter spissen (P 1000), bar gjør det brede, som hjelpemidler i forebygging av blodplater aktivisering, og forsiktig suspendere pellet.
    9. Sentrifuger 2,870 g, middels brems i 2 minutter
    10. Forkast nedbryting og forsiktig suspendere blodplater TH buffer.
    11. Juster volumet med TH buffer for å oppnå antall 2 x 107/mL.
  2. Utarbeidelse av tilhenger Platederivert monolayers
    1. Forberede glass dekkglassvæske (tilhenger blodplater) som 1.3.3.
  3. Immobilisering av blodplater
    1. Legg 100 µL av en 2 x 107/mL Platederivert suspensjon per kanal, og ruge 1.5 h 37 ° C og 5% CO2.
    2. Nøye erstatte ikke-tilhenger blodplater blokkerer løsning (5% BSA i HEPES) for minst 30 min på RT. Fortsett med fluorescerende merking og perfusjon av leukocytter (trinn 3.3)
  4. Stimulering av musen Platederivert monolayer
    1. Før perfusjon av leukocytter (trinn 3.3), stimulere blodplater av perfusjon av trombin (0,5 nM) i HHHSA buffer for 3 min på 37 ° C.

3. fluorescerende merking og perfusjon av leukocytter (PMN eller THP-1 for mennesker og RAW264.7 eller hovedknappen på musen monocytter for Murine flyt-baserte analysen)

  1. Fluorescerende merking
    1. Etiketten leukocytter (1 x 106/mL) med celle-permeant grønne fluorescerende nukleinsyre flekken (1 µM). Inkuber celler for 30 min på 37 ° C.
    2. Vask cellene med PBS med sentrifugering 300 x g i 5 min, og suspendere cellene til en konsentrasjon på 0,5 x 106 celler/mL (5 mL per testvilkår, avhengig av flyt) i analysebuffer.
  2. Flow chamber analysen forberedelse
    1. Forkaste celle kultur mediet parabolen leukocytter vedheft på en celle monolayer, og montere den i flyt kammeret. Koble slangen til sprøyten. Leukocytter vedheft på immobilisert blodplater, koble mikro lysbildet til sprøyten. Forvarm et vannbad til 37 ° C.
    2. Ta en perfusjonsmåling sprøyte (50 mL), installere sprøyte på sprøyten holderen og sett pumpen på trekke modus. Angi pumpe volumet til 0 mL, og angi diameteren til 26.70 mm for 50 mL sprøyte.
    3. Koble en albue luer kontakten til den ene enden av slangen. Plasser en luer lås kopling til sprøyten og koble slangen med den vinkel luer til luer lås kabelendene. Koble den kostnadsfri presisjonsrør enden til flow chamber.
  3. Leukocytter perfusjon og heft
    1. Forkaste celle kultur mediet parabolen leukocytter vedheft på en celle monolayer, og montere den i flyt kammeret. Koble slangen til sprøyten. Leukocytter vedheft på immobilisert blodplater, koble mikro lysbildet til sprøyten.
    2. Leukocytter perfusjon og vedheft over en vaskulær- eller blodplater monolayer, plasser den andre settes inn i et 50 mL konisk rør som inneholder analysebuffer og fylle slangen med 1 mL Pipetter, så presse slangen og koble den til en flyt kammer.
    3. Før leukocytter perfusjon, legge 3 mM CaCl2 og 2 mM MgCl2 til celle suspensjon og ruge i 5 min på 37 ° C.
    4. Perfuse analysebuffer før perfusjon av celler å fjerne mulig fra kammeret og rør.
    5. Lukk tube ender ved å klemme dem tett og Skru slangen analysebuffer til celle suspensjon, hindrer luftbobler i blir fanget. Perfuse celler med riktige flyten hastighet/skjæring stress før de første cellene kommer.
    6. Perfuse celler med riktige flyten hastighet/skjæring stress i 2 minutter, og ta minst 6 bilder mellom 2-6 min av rullende og tilhenger celler med en invertert fase kontrast/fluorescens mikroskopet (f.eksEVOS-FL) 100 X forstørrelse koblet en digital CCD eller CMOS kameraet.
      Merk: Flow rate/skjæring stress avhenger av flow chamber dimensjoner og viskositet av perfusate. For perfusjon kammer brukes her (se Tabell for materiale):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: skjæring stress (1 dyn/cm2)
      Η: viskositet (0.015 dyn * s/cm2)
      Φ: Flow rate (0.67 mL/min)
  4. De leukocytter vedheft
    1. For de-adhesion, bytte rør fra cellen suspensjon å analysebuffer ved å klemme slangen, hindrer luftbobler i å bli fanget.
    2. Koble celler av perfusjon med analysebuffer med en passende flow rate/skjæring stress (se 3.3.7 Merk).
  5. Leukocytter transmigration
    1. For leukocytter transmigration, perfuse leukocytter (trinn 3) til en tilstrekkelig mengde leukocytter følge (~ 50 celler/vise felt).
    2. Erstatt leukocytter suspensjon med analysebuffer.
    3. Registrere transmigrating celler av tidsforløp hver 10-15 s i 30-60 minutter på 37 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å studere endothelial-leukocytter vedheft, var fluorescently merket THP-1 celler perfused over en TNFα - eller ikke-stimulert endotelial monolayer i 2 minutter på 3 Dyn/cm2. Totalt antall tilhenger monocytic celler ble bestemt etter 2 min av perfusjon av fange 6 uavhengige felt over en periode på 2-6 min. Tilhenger cellene kvantifisert i minst 6 bilder tatt med en invertert fase kontrast/fluorescens mikroskopet (f.eksEVOS-FL) 10 X forstørrelse er koblet til et digitalkamera CCD eller CMOS og gjennomsnittet ble uttrykt som tilhenger celler / mm2. På endothelial stimulering med TNFα, THP-1 arrestasjonen betydelig økt sammenlignet med unstimulated endotelet. Representant micrographs og måling av fast tilhenger THP-1 til ikke - eller TNFα-stimulert endotelceller vises i figur 1. Blodplater-leukocytter vedheft ble vurdert av perfusjon av fluorescently merket nøytrofile over en FELLE-6 - eller ikke-stimulert Platederivert monolayer i 2 minutter på 1 Dyn/cm2. Tilhenger nøytrofile kvantifisert som nevnt ovenfor. FELLE-6 stimulering betydelig økt vedheft av nøytrofile i forhold til unstimulated blodplater. Representant videoer og kvantifisering av fast tilhenger nøytrofile til ikke - eller FELLE-6-stimulert Platederivert monolayer vises i figur 1B.

Figure 1
Figur 1 : Endothelial - og blodplater-leukocytter vedheft under strømningsforhold. Kvantifisering og representant micrographs av vedheft av menneskelige monocytic celler (THP-1) til endotelceller (HUVEC) seeded kollagen-belagt kultur retter under strømningsforhold, med eller uten TNFα Aktivisering (10 ng/mL) (A). Kvantifisering og representant micrographs av vedheft av menneskelig nøytrofile menneskelige blodplater immobilisert på kollagen-belagt glass lysbilder under strømningsforhold, uten eller med FELLE-6 Aktivisering (50 µM) (B). P-verdier ble beregnet ved kortet t-test (n = 3; mener ± SD). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dessuten, denne analysen kan gjennomføres for å studere rollen som vedheft molekyler, som Platederivert junctional vedheft molekyl (JAM-A). Vedheft av RAW264.7 musen monocytt/macrophage å en blodplater-monolayer fra JAM-A (trJAM-A+/ +) og SYLTETØY-A-mangelfull (trJAM-A- / -) mus ble vurdert i våre tidligere studie7. Som observert deri, økt Platederivert JAM-A-mangel vedheft av musen monocytter til blodplater monolayer sammenlignet med vill type mus (figur 2A-B). Alternativt kan hovedknappen på musen nøytrofile være isolert fra mus som beskrevet12.

For å studere underliggende mekanismer, som vedheft molekyler involvert i blodplater-leukocytter interaksjoner, kan bestemte overflate reseptorer blokkeres. I den nevnte studien redusert blokkering av blodplater GPIbα og leukocytter αMβ2 betydelig monocytt vedheft, identifisere en rolle for GPIbα-αMβ2 aksen i rekrutteringen økt monocyte til JAM-A- / - blodplater (figur 2A-B). Videre kan celle avdeling eksperimenter utføres for å undersøke skjæring stress avhengighet av blodplater-leukocytter interaksjoner. For måling av flyt-avhengige avdeling av monocytter økt skjæring stress gradvis fra 0 til 20 dynes/cm2. I denne studien vedheft av RAW264.7 celler av JAM-A- / - blodplater var mer motstandsdyktig mot skjæring stress forhold til JAM-A+/ + blodplater (figur 2C).

Figure 2
Figur 2 : JAM-A-mangel fremmer flyt-resistente monocytic celleadhesjon. Vedheft av musen monocytt/macrophage RAW264.7 celler til blodplater fra JAM-A+/ + og SYLTETØY-A- / - mus immobilisert på kollagen-belagt glass lysbilder under strømningsforhold, med eller uten trombin aktivering (IIa, 0,5 nM) i nærvær av angitt hemmere (A). Representant micrographs av musen monocytt/macrophage RAW264.7 celler tilhenger til JAM-A+/ + og SYLTETØY-A- / - blodplater etter behandling med isotype kontroll eller anti-GPIbα antistoffer (B). Celle vedheft uttrykt som prosent av opprinnelig tilhenger celler under gradvis økt skjæring stress (Dyn/cm2) på immobilisert blodplater etter trombin aktivering (IIa, 0,5 nM). P-verdier ble beregnet ved VARIANSANALYSE med Tukeys post test (n = 3-5, mener ± SEM). Skala bar = 100 µm. Dette tallet har blitt endret fra Zhao et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Lengre tid (30-60 minutter) enkelt felt etter leukocytter perfusjon og vedheft lar studiet av leukocytter gjennomgang og spre atferd og siste transmigration over endothelial laget. I denne studien har vi analysert transmigration av primære menneskelige monocytter (isolert med monocytt isolering kit, i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet13) over et endothelial lag. Som presentert i Figur 3følgende fast arrestasjonen til endotelet, forberede monocytter extravasate ved gjennomgang og spre til foretrukket sted for transmigration er nådd. Deretter trenge monocytter endothelial celle barrieren ved para- eller transcellular-overføring. Transmigrating celler ble definert som celler som sprer seg over endotelceller, utvide deres pseudopodia og passerer gjennom endothelial barriere, og dermed redusere lysstyrken.

Movie 1
Figur 3: In vitro transmigration av primære monocytter over en endotelial monolayer. Monocytt gjennomgang og spre og siste transmigration over endotelet ble spilt hver 15 s 30 min. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne i vitro analysen er en enkel metode å undersøke underliggende mekanismene av leukocytter rekruttering under vaskulær betennelse, men det er noen kritiske punkter skal noteres. Det første kravet for å kunne utføre denne analysen er perfusjon av leukocytter over en intakt og confluent vaskulære eller blodplater monolayer. Dette kan oppnås ved tidligere belegg av overflater med kollagen type jeg. Vanligvis når du arbeider med primære vaskulære celler, er det viktig å forsiktig koble celler ved hjelp av den anbefalte collagenase inneholder avdeling løsningen (se Tabell for materiale), som er mindre strenge, men så effektiv som trypsin. For Platederivert monolayers er det viktig å vaske forsiktig blodplater under isolasjon å hindre Platederivert aktivisering og aggregering.

En annen kritisk vurdering er å opprettholde kontinuitet pumpen uttak modus brukes for perfusjon, siden en diskontinuitet fører til forstyrret rate og skjær strømningsforhold. Dermed resulterer dette i unøyaktighet av faktiske skjæring stress og, senere, til feiltolkning av fysiologisk skjær-avhengige prosesser. Dette kan forebygges ved regelmessig vedlikehold av pumpen. Dessuten avgjørende for kontinuitet under perfusjon er bruk av en fersk sprøyte for hver eksperimentet. Siden tekstur av gummi i sprøyten endringene med økende og tid mellom eksperimenter, hindrer en kontinuerlig tilbaketrekning.

En videre kritiske trinnet er forebygging av luft bli fanget under perfusjon av leukocytter, siden luften vil senere løsrive celler fra overflaten og endre skjær forhold. Dette kan forebygges ved å rense alle rør før bruk med ultra rent vann og deretter med analysebuffer. Også når du kobler slangen fra analysebuffer i cellen suspensjon eller fra en tilstand til en annen, er det viktig å opprettholde flytende grensesnitt under tilkoblingen. Dette kan oppnås ved å klemme slangen eller ikke endre de flytende nivåene i rør. Videre bør væske volumet av perfusate alltid være tilstrekkelig til å hindre nivået falle under rør slutten, og dermed luft blir tatt opp i systemet.

En mulig begrensning av denne analysen kan være bruk av kultivert celler som vedlikeholdes i en kunstig miljø, dvs kultivert på plast underlag omgitt av et medium som ikke nøyaktig modell i vivo staten. Selv om physiochemical og fysiologiske miljø kan nettopp kontrolleres, har kultivert celler en rask vekst, noe som øker genetisk variasjon og dermed heterogenitet av celler i en populasjon. Dessuten på vaskulær- eller blodplater monolayer består av en enkelt celle type bare. Spesielt når undersøke endothelial-leukocytter interaksjoner, dvs., transmigration av leukocytter over endothelial celle barrieren, fysiologisk relevante rollen av underliggende endothelial celle kjelleren membranen og pericytes kan ikke tas i betraktning. Alternativt kan det være interessant å skape en flercellet miljø ved å implementere 3D-celle dyrking teknikker i denne analysen.

For å oppsummere, Hensyntatt disse punktene, laminær strømning-baserte analysen kan effektivt brukes i ulike modeller av vaskulær betennelse. Spesielt kan det enkelt endres til adressen spesifikk forskning spørsmål, dvs justering av skjæring stress ved å enten variere inntakets perfusate, den flytende viskositeten, eller kanal høyde og bredde. Spesielt er sistnevnte viktig siden endringene i flow chamber dimensjoner reduserer væske volum eller nødvendig. Videre, ulike fluorescens merking av leukocytter eller bestemte molekyler av vaskulær Platederivert monolayers kan også brukes til å studere celle-celle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Martin M. Schmitt og linjen Fraemohs. Dette arbeidet ble støttet av Nederland grunnlaget for vitenskapelig forskning (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner stiftelse for blodoverføring forskning (LSBR Nr. 1638) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) til R.R.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 134 leukocytter vedheft cascade remodeling vaskulære betennelse blodplater integrins selectins chemokines junctional vedheft molekyl
Laminær strømning-baserte analyser undersøke leukocytter rekruttering på kulturperler vaskulære celler og tilhenger blodplater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vajen, T., Heinzmann, A. C. A.,More

Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter