Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

doi: 10.3791/57011 Published: June 13, 2019

Summary

نحن نصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما البشرية المستمدة من المريض xenografts عن طريق فرز الخلايا تنشيط الفلورة، وذلك باستخدام مستضد الكريات البيض البشرية-1 (HLA-1) كعلامة سلبية، ولمزيد من التحقق من صحة و توصيف هذه الخلايا HLA-1-السلبية التي تبدأ الورم.

Abstract

وقد تم دعم وجود وأهمية الخلايا التي تبدأ الورم (TICs) من خلال زيادة الأدلة خلال العقد الماضي. وقد ثبت أن هذه TICs تكون مسؤولة عن بدء الورم، وورم خبيث، ومقاومة المخدرات. ولذلك، من المهم تطوير علاج محدد يستهدف TIC بالإضافة إلى استراتيجيات العلاج الكيميائي الحالية، والتي تركز في الغالب على الجزء الأكبر من غير TICs. ومن أجل زيادة فهم الآلية الكامنة وراء الأورام الخبيثة للمراكز، فإننا نوصف طريقة لعزل وتوصيف هذه المراكز في الساركوما البشرية. هنا، نعرض بروتوكول مفصل لتوليد xenografts المستمدة من المريض (PDXs) من ساركوما الإنسان وعزل TICs عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) باستخدام مستضد الكريات البيض البشرية الفئة الأولى (HLA-1) كعلامة سلبية. أيضا، ونحن نصف كيفية توصيف وظيفيا هذه TICs، بما في ذلك إجراء بفحص تشكيل الكرة ونموذج تشكيل الورم، وللحث على التمايز على طول مسارات mesenchymal. إن عزل وتوصيف أجهزة المعالجة الشخصية PDX توفر أدلة على اكتشاف الكواشف العلاجية المستهدفة المحتملة. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يوسع نطاقه ليشمل عزل وتوصيف الـ TICs عن الأنواع الأخرى من السرطانات البشرية.

Introduction

وقد تم دعم عدم تجانس الخلايا داخل الورم من السرطانات البشرية من خلال زيادة الأدلة خلال العقد الماضي1. على غرار الأنسجة الطبيعية، تتكون أنسجة السرطان من مجموعة فرعية صغيرة من TICs (وتسمى أيضا الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر القدرة على تشكيل الورم. وفي الوقت نفسه، فإن الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية تظهر الأنماط الظاهرية المتمايزة2. هذه TICs تظهر خصائص تشبه الخلايا الجذعية، بما في ذلك التعبير عن علامة الخلايا الجذعية وقدرة كل من التجديد الذاتي وتقسيم الخلايا غير المتماثلة، وبالتالي، يمكن أن تبدأ في تشكيل ورم غير متجانس ة الخلوية3. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن TICs ليست مسؤولة فقط عن بدء الورم ولكن ترتبط أيضا مع عدوانية الورم4, الانبثاث5, ومقاومة المخدرات6. ولذلك، من المهم فهم بيولوجيا هذه البلدان، وبالتالي وضع استراتيجية علاجية محددة تستهدف هذه البلدان.

وقد استخدمت الأساليب المستندة إلى نظام المعلومات المتعلقة بالفضاء الإقليمي لتحديد TICs باستخدام علامات TICs، بما في ذلك CD133 وCD24 وCD441. يتم التعبير عن معظم هذه العلامات أيضا في الخلايا الجذعية العادية7. ومع ذلك، لا يوجد أي من هذه العلامات فقط وضع علامة على TICs. الأدوار التي تلعبها هذه الجزيئات في الأورام الخبيثة من TICs لا تزال غير واضحة. على سبيل المثال، يمكن تعطيل CD133 في كثير من الأحيان عن طريق مثيلة الحمض النووي، وبالتالي، فإن هذا التباين بين الأورام قد يجعل دقة هذه العلامات8. ALDH1 هو علامة التي تعمل أيضا للحفاظعلى الجذعية من TICs 9. يبدو أن تكون أكثر فعالية في تحديد سرطان الثدي TICs ولكن لا يزال مشكوكا فيه في أنواع الأورام الأخرى9. بعض مسارات الإشارة تلعب أدوارا هامة في بيولوجيا الخلايا الجذعية, بما في ذلك Wnt (موقع التكامل ذات الصلة wingless), TGF-β (تحويل عامل النمو بيتا), والقنفذ1. ولكن من الصعب إثبات أن هذه المسارات هي محددة TIC واستخدام نشاط هذه المسارات لعزل TICs من الأورام الأولية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علامة TIC رواية موثوق بها.

الإنسان MHC الفئة الأولى، وتسمى أيضا HLA-1، هو بروتين سطح الخلية أعرب في جميع الخلايا النووية تقريبا10. يعمل HLA-1 كمستضد يقدم جزيء يتم التعرف عليه على وجه التحديد من قبل خلايا CD8 T10. يمكن تنشيط تأثير الخلايا السامة للخلايا CD8 T عندما تقدم الخلايا السرطانية مستضد الورم بواسطة HLA-1. لذلك، عدم وجود HLA-1 على سطح الخلية من الخلايا السرطانية يمكن أن يؤدي إلى هروب المناعة من خلايا CD8 T السامة للخلايا. وقد تم وصف انخفاض تنظيم HLA-1 في أنواع مختلفة من السرطان البشري ويرتبط مع سوء التكهن، والنقيل، ومقاومة المخدرات11. لقد أظهرنا أن فقدان التعبير HLA-1 على سطح الخلية يمكن استخدامها لتحديد TICs في ساركوما، وكذلك في سرطان البروستاتا12.

هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل TICs من الساركوما البشرية PDXs من قبل FACS، وذلك باستخدام HLA-1 كعلامة سلبية، والمزيد من التحقق من صحة وتوصيف هذه HLA-1-السلبية TICs.

Protocol

جميع بروتوكولات تجارب الماوس التي تمت مناقشتها هنا تمت وفقًا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والمعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية التابعة للمركز الطبي لجبل سيناء ولجنة رعاية الحيوانات واستخدامها.

1. معالجة عينة أنسجة ساركوما، وتشكيل PDX

  1. بموجب بروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية، يكون موظفو خدمة علم الأمراض إعداد عينات ساركوما من عينات الجراحة ووضع كل عينة على الفور على الجليد في طبق بيتري 100 ملم.
  2. ضع العينة في أنبوب مخروطي بوليستيرين 15 مل مع 6 مل من معهد روزويل بارك التذكاري البارد (RPMI) 1640 ثقافة متوسطة مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات. معالجة عينة الأنسجة على الفور.
  3. (اختياري) لساركوما العظم فقط، اتبع الخطوات التالية، والتي يمكن تخطيها لساركوما الأنسجة الرخوة.
    1. قطع الأنسجة إلى 20 مم3 قطع باستخدام مشرط. نقل قطع الأنسجة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 3 مل من محلول الكولاجين (RPMI 1640 مع 1 ملغ / مل كولاجيناز).
    2. وضع الأنبوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. دوامة تماما الأنبوب، وبعد ذلك، إضافة 3 مل من RPMI 1640 تستكمل مع FBS 10٪ لتحييد نشاط الكولاجين.
    4. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 × ز في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant.
  4. العمل في خزانة السلامة البيولوجية المعقمة، ووضع عينة الأنسجة في طبق بيتري 100 ملم. إضافة 500 درجة مئوية من المعقمة 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) إلى الأنسجة. مع مشرط معقم، تُقطّع الأنسجة ميكانيكياً إلى قطع صغيرة حتى لا تكون قطعة الأنسجة المرئية أكبر من 0.1 مم.
  5. نقل تعليق الخلية 500 درجة مئوية إلى مصفاة خلية 35 ميكرومتر وجمع تعليق تصفيتها مع أنبوب البوليسترين 50 مل. وضع هذا أنبوب البوليسترين 50 مل مع تعليق الخلية على الجليد.
  6. إضافة 500 ميكرولتر أخرى من PBS إلى الأنسجة. Triturate للمرة الثانية، ونقل التعليق من خلال مصفاة الخلية، وجمعها في نفس أنبوب 50 مل.
  7. كرر هذه الخطوات (الخطوات 1.5-1.6) حتى يتم فصل مقطع الأنسجة تماماً، عادة 6x - 8x.
  8. بيليه تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه باستخدام 5 مل من الانحلال العازلة (0.15 M NH4Cl، 10 mM KHCOو 0.1 mM EDTA)، واحتضان الحل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  9. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 × ز في درجة حرارة الغرفة وإزالة العازلة انحلالي. غسل بيليه مع 5 مل من PBS. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 350 × ز وإزالة supernatant.
  10. إعادة تعليق بيليه مع 1 مل من PBS وعد رقم الخلية القابلة للحياة باستخدام مقياس الهيموكيتوماتومتر أو أي طريقة بديلة أخرى. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 1 × 107 خلايا في 200 درجة مئوية من PBS. اترك تعليق الزنزانة على الثلج.
  11. ترك مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد للسماح لها أن تذوب. إضافة 200 درجة مئوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى تعليق الخلية 200 ميكرولتر. يُمزج المزيج برفق ويُحفظ على الجليد.
  12. حقن تحت الجلد تعليق الخلية: الطابق السفلي غشاء مصفوفة (1:1) خليط في اثنين من الفئران غاما NOD scid (NSG) في جنبهم. استخدام 200 ميكرولتر لكل حقنة.
  13. مراقبة تشكيل PDX عن طريق التحقق من موقع حقن الفئران 2X في الأسبوع. إزالة xenograft الورم عندما يصل إلى 1 سم في القطر.

2. عزل الخلايا التي تبدأ الورم من قبل FACS من PDX

  1. جراحيا إزالة PDX من الفئران كما هو موضح سابقا12.
  2. قطع الورم إلى نصفين. إصلاح نصف xenograft مع 4٪ بارافورمالدهايد بين عشية وضحاها. هذا من أجل التحليل النسيجي معالجة النصف الآخر من الأنسجة كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.3-1.8) للحصول على تعليق خلية الورم.
  3. إعادة تعليق بيليه مع PBS وعد رقم الخلية القابلة للحياة.
  4. تمييع تعليق الخلية في PBS مع FBS 5٪ إلى تركيز 2 × 106 خلايا / مل. اترك تعليق الزنزانة على الثلج لمدة 30 دقيقة. وضع علامة على الأنابيب مع التحكم في النظائر والأجسام المضادة، على التوالي. لاحظ عدد الخلايا في كل أنبوب.
  5. إعداد 2X HLA-1-PE الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة مع PBS تستكمل مع 5٪ FBS (1:250). تمييع الجسم المضاد للتحكم في نوع isotype السالب بنفس الحالة. امزج تعليق الخلية من أنبوب "الأجسام المضادة" مع الأجسام المضادة المخففة (1:1) لجعل تخفيف الأجسام المضادة النهائي 1:500. خلط تعليق الخلية من أنبوب "التحكم في النظائر" مع التحكم في النظائر (1: 1). وضع تعليق الخلية على الجليد لمدة 90 دقيقة.
  6. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 × ز في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. إضافة 10 مل من PBS لغسل بيليه 2X.
  7. إضافة 4 '،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) إلى PBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. إضافة هذا الحل DAPI إلى بيليه الخلية لجعل تعليق الخلية من 107 خلايا / مل (باستخدام أرقام الخلايا من الخطوة 2.4).
  8. تصفية تعليق الخلية من خلال 35 ميكرومتر قبعات مصفاة في 12 مم × 75 مم أنابيب البوليسترين.
  9. استخدام مقياس التدفق لفرز السكان الفرعيين TIC HLA-1-سلبية6. بوابة الخلايا القابلة للحياة (DAPI-السلبية) وجمع كل من HLA-1-السلبية وإيجابية التجمعات السكانية في اثنين من أنابيب جمع 15 مل، كل تحتوي على 4 مل من RPMI 1640 ثقافة المتوسطة.

3. توصيف الخلايا التي تبدأ الورم

  1. تكوين ساروسفير
    1. جعل ساروسفير النمو المتوسطة، وذلك باستخدام ألفا-MEM خلية الثقافة المتوسطة. إضافة ملاحق لجعل التركيز النهائي من المكملات B-27 (1X), مكملات N2 (1X), عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) (20 نانوغرام /مل), وعامل نمو البشرة (EGF) (20 نانوغرام/مل) والبنسلين/العقدية (100 وحدة IU/mL). قم بتصفية الوسيط باستخدام فلتر ثقافة الخلية 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام.
    2. بيليه فرز HLA-1-السلبية وإيجابية subpopulation من الخطوة 2.9 وحساب أرقام الخلايا من كل subpopulation.
    3. تخفيف 1.5 × 106 خلايا في 15 مل من ساروسفير النمو المتوسطة لجعل تخفيف الخلية من 1 × 105 خلايا / مل.
    4. تمييع الخلايا بشكل تسلسلي مع نمو ساروسفير الطازجة المتوسطة لجعل 15مل من كل تخفيف الخلية من 10 4، 10و 102 الخلايا / مل. ثم، قم بإعداد أربعة لوحات ثقافة الخلايا ذات الدقة المنخفضة جدًا 96 بئرًا، كل منها لتخفيف الخلية.
    5. نقل 100 درجة مئوية من تعليق الخلية من 105 خلايا / مل تخفيف إلى كل بئر من أول 96 جيدا جدا منخفضة لوحة ثقافة الخلية المرفق. هذه اللوحة لديها 104 خلايا في كل بئر.
    6. استخدام لوحات أخرى 96-well عالية منخفضة خلية خلية لإضعافات الخلية الثلاثة الأخرى: 1010و 102 خلايا / مل. نقل 100 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحات ثقافة الخلايا المرفقة منخفضة جدا 96 جيدا. يتلقّى هذا ثلاثة ثقافة لوحات 1,000 خلايا/بئر, 100 خلايا/بئر, و10 خلايا/بئر, على التّوالي.
    7. وضع لوحات في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة ثقافة الخلية.
    8. إضافة bFGF جديدة وEGF مباشرة إلى الخلية ثقافة المتوسطة (التركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل) كل ثلاثة أيام دون تغيير المتوسطة لتجنب الخلايا المفقودة في ثقافة التعليق.
    9. باستخدام المجهر الخفيف، ورصد تشكيل ساروسفير كل يوم لمدة ثلاثة أسابيع، كما هو مبين في الشكل 2A.
    10. بعد ثلاثة أسابيع، عد عدد الآبار إيجابية ساروسفير والآبار سلبية ساروسفير من كل تخفيف الخلية لكل من HLA-1-السلبية وHLA-1-إيجابية الخلايا.
    11. حساب تردد الخلية تشكيل المجال استنادا ً إلى توزيع احتمال بواسون13. قارن TICs HLA-1-السلبية مع الخلايا السائبة HLA-1 إيجابية.
  2. إجراء التبّع التسلسلي لتشكيل الورم
    1. حساب التجمعات السكانية الفرعية HLA-1-سالبة وإيجابية من الخطوة 2.9.
    2. جعل التخفيفات التسلسلية للخلايا مع PBS لتركيزات من 101010و 103 خلايا / مل. استخدام 1 مل من كل تخفيف لتشكيل الورم في 10 الفئران.
    3. إضافة 1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى تعليق الخلية 1 مل من كل تخفيف (1:1). الحفاظ على 2 مل من كل خليط على الجليد.
    4. حقن 200 ميكرولتر من الخلية: خليط مصفوفة غشاء الطابق السفلي في أجنحة الفئران NGS، وذلك باستخدام الخلايا السالبة HLA-1 لجناح واحد وخلايا HLA-1 إيجابية للجناح الآخر من نفس الماوس. لكل تخفيف، استخدم 10 فئران. استخدام المحاقن 25G مع إبرة للحقن.
    5. مراقبة تشكيل الورم في الفئران لمدة أربعة إلى ثمانية أسابيع، اعتمادا على معدل نمو الورم.
    6. حساب تردد الخلايا بدء الورم بنسبة تكوين الورم في أرقام خلايا الإدخال المختلفة. قارن TICs HLA-1-السلبية مع الخلايا السائبة HLA-1 إيجابية.
  3. التمايز المستحث على طول المسارات الميسنشية
    1. استخدام ساروسفيرات شكلت خلال الخطوات السابقة (الخطوة 3.1.9). نقل ساركوسفيس إلى لوحة جديدة 6 جيدا. ثقافة [سركوسفيس] مع 2.5 [مل] من [ألف-م] يلحق مع 10% [فبس] أن يترك الخلايا ربطت إلى الثقافة لوحة سطح.
    2. بعد مرفق لمدة يومين، تبديل وسط الثقافة من ألفا ميم تكملها FBS 10٪ إلى خليط 1:1 من ألفا ميم تكملها 10٪ FBS والخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان (hMSC) النمو المتوسطة.
    3. بعد يومين، انتقل إلى إكمال متوسط نمو hMSC.
    4. عندما تصل الخلايا إلى الملاءمة 90%، يستنشق وسيط hMSC وأضف وسيطة تمايز. للتمايز العظمي، إضافة متوسط التمايز العظمي (hMSC متوسط النمو تكملها 10 نم ديكساميثازون، 5 م بيتا-غليسيروفوسفات، 50 ميكروغرام / مل L-حمض الاسكوربيك، و 10 مل كلوريد الليثيوم). للتمايز الليفيجيني، يضاف متوسط تمايز الخلايا الأديبية (متوسط نمو hMSC مكمّل بـ 0.5 ميكرومتر ديكساميثازون، 0.5 ميكرومتر إيزوبوتيل ميثيل إكسانثين، و50 ميكرومتر إندوميثاسين).
    5. تغيير وسيطة التمايز كل ثلاثة أيام.
    6. بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع، ووقف التمايز وغسل الخلايا مع PBS. ثم، يستنشق PBS وإضافة 2 مل من 10٪ رسمي إلى الخلايا لتثبيت. السماح للخلايا الجلوس لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها بالماء منزوع الأيونات. الخلايا جاهزة الآن لبقع الأحمر Alizarin S (الخطوة 3.3.6.1) أو النفط الأحمر O تلطيخ (الخطوة 3.3.6.2).
      1. للكشف عن التمايز العظمي، قم بأداء تلطيخ الأليزارين الأحمر S. يستنشق الماء ويضاف 2 مل من حل عمل Alizarin Red S (2٪ Alizarin Red S, pH 6.0) إلى الخلايا، والسماح لهم بالجلوس لمدة 5 دقائق للتلطيخ. غسل الخلايا بالماء منزوع الأيونات ومراقبة رد الفعل مجهري.
      2. للكشف عن التمايز adipogenic، وأداء النفط الأحمر يا تلطيخ.
        1. جعل النفط الأحمر O الحل. إعداد حل الأسهم عن طريق إضافة 300 ملغ من مسحوق النفط الأحمر O إلى 100 مل من إيزوبروبانول.
        2. في غضون 2 ح قبل استخدام، مزيج ثلاثة أجزاء (30 مل) من النفط الأحمر يا الأوراق المالية الحل مع جزأين (20 مل) من الماء منزوع الأيونات. السماح للخليط للجلوس لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
        3. تصفية حل العمل باستخدام قبل الاستخدام.
        4. إزالة الماء من الخلايا المعدة وفقا للخطوة 3.3.6. إضافة 2 مل من 60٪ إيزوبروبانول لتغطية الخلية أحادية الطبقة والخلايا الجلوس لمدة 2 دقيقة.
        5. إزالة isopropanol وإضافة 2 مل من النفط الأحمر يا حل العمل. السماح للخلايا للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
        6. شطف الخلايا بالماء منزوع الأيونات ومراقبة رد الفعل تحت المجهر الخفيف.

Representative Results

تم إنشاء ساركوما بشرية PDX وملطخة. وقد تبين عدم التجانس داخل الورم عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة HLA-1. تألفت xenograft من اثنين من التجمعات السكانية الفرعية متميزة، وهي HLA-1 إيجابية وسلبية (الشكل1A)12. وأظهرت PDX ساركوما أوجه التشابه النسيجي مع الورم الأساسي الأبوي (الشكل1A). وقد عزلت القوات المسلحة الكونغولية مراكز البحث والشرطة. باستخدام طريقة الفرز المزدوج، كانت الخلايا السالبة HLA-1 غنية بدرجة عالية من سكان الخلايا الأبوية (الشكل1B)12.

تم العثور على الجينات المعبر عنها في الخلايا الجذعية (على سبيل المثال، Oct4، Nanog، وMyc) أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في الخلايا المعزولة HLA-1-السلبية بالمقارنة مع نظيرها HLA-1 إيجابية (الشكل1C). تم التعبير عن Sox-9، وهو جين تنموي يقال أنه يلعب أدوارًا هامة في الخلايا الجذعية السرطانية الأخرى، كما هو الحال في سرطان الثدي، على وجه التحديد في الخلايا السلبية HLA-1 (الشكل1D).

للتحقق من صحة السكان الفرعيين المعزولين HLA-1-السلبية، تم إجراء فحص تشكيل ساروسفير لفحص قدرة التجديد الذاتي للخلايا. وكانت الخلايا السالبة HLA-1 قادرة على تشكيل المجالات مع مدخلات أولية من أقل من 10 خلايا (الشكل1E)12. من أجل فحص قدرة تشكيل الورم، تم إجراء فحص تشكيل الورم التمييع التسلسلي. تم حقن نفس الأرقام من الخلايا HLA-1-السلبية والإيجابية تحت الجلد في كل جانب من نفس الماوس. وأظهرت الخلايا السالبة HLA-1 قدرة أعلى بكثير تشكيل الورم (الشكل1F)12، في حين xenografts التي شكلتها كل من HLA-1-السلبية وإيجابية التجمعات الفرعية كانت الأورام الخلوية غير متجانسة (الشكل 1H).

قمنا بإجراء تحليل التعبير الجيني من عزلHLA-1-السلبية TICs12. وقد ارتفعت الجينات المرتبطة بالتمايز الطبيعي للخلايا المتوسطة في TICs12. وهكذا، اختبرنا أيضا ما إذا كان HLA-1 TICs يمكن أن يسببها التمايز الطرفي ويؤدي إلى انخفاض قدرة تشكيل الورم. وأظهرت النتائج أن الخلايا السالبة HLA-1 يمكن أن تدفع للتمييز على طول كل من مسارات lipogenic وosteogenic وتظهر قوية النفط الأحمر O وAlizarin الأحمر S تلطيخ (الشكل1G). وعلى النقيض من ذلك، لا تفرق الخلايا الإيجابية HLA-1 تحت نفس الظروف. وهكذا، تشير هذه النتائج إلى استراتيجية العلاج المتمايزة واعدة التي يمكن استخدامها لاستهداف ساركوما TICs.

Figure 1
الشكل 1: عزل الخلايا السالبة HLA-1 من الساركوما غير المتجانسة داخل الورم PDXs. (أ) تم العثور على الخلايا السالبة HLA-1 (الأسهم) في أنواع فرعية مختلفة من ساركوما الإنسان بواسطة الكيمياء المناعية (IHC). (أ) و (ب) امسح ساركوما الخلية (ج) و (د) الساركوما الشحمية الجنبية. (هـ و) (لييوموساركوما) (ز و ح) ورم غمد العصب المحيطي الخبيث. (ط و ي) الساركوما الشحمية، غير محددة خلاف ذلك. (ك ول) الساركوما الشحمية المتمايزة. شريط مقياس = 100درجة مئوية (B) كانت SARCOMa PDXs هيتومولوجيا مماثلة للورم الأبوي (هيماتوكسيلين ويوسين [H & E] وصمة عار) وأظهرت عدم تجانس الخلوية في التعبير HLA-1 من قبل IHC. هنا تظهر الصور التمثيلية لـ ساركوما PDXs، بما في ذلك ساركوما خلية واضحة (CCS)، والساركوما الغضروفية غير المتمايزة (DCS)، وساركوما ليبوكوما غير متمايزة (DDL). شريط مقياس = 100 درجة مئوية (C) تم عزل التجمعات الفرعية للخلايا السالبة HLA-1 بواسطة قياس التدفق بمقياس السيتومي باستخدام طريقة الفرز المزدوج. من أعلى إلى أسفل: الفرز الأول، والفرز الثاني، والتحقق من النقاء. خضعت الخلايا المعزولة HLA-1-negative وHLA-1-إيجابية لتحليل وظيفي لاحق، بما في ذلك فحص تشكيل الورم. والنتائج من هذا الرقم هي من منشور سابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف مركبات الدخل غير المتصلة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بالاختبارات الوظيفية. (أ) أظهر نموذج تشكيل الكرة أن عدد قليل من 10 خلايا سلبية HLA-1 كانت قادرة على تشكيل مجالات ساركوما. اليسار: صور تمثيلية لمجالات ساركوما. الحق: تردد تشكيل الكرة؛ يعني ± SD. مقياس بار = 100 درجة مئوية (B) HLA-1-الخلايا السلبية المعزولة من PDX ساركوما كانت ورمية للغاية. هنا تظهر صور تمثيلية للورم التي شكلتها HLA-1-السلبية والخلايا الإيجابية من DDL. تم حقن ألف خلية من خلايا HLA-1-negative وHLA-1-positive DDL في أجنحة منفصلة من نفس الماوس. (C) تم التعبير عن مستويات mRNA من جينات الخلايا الجذعية Oct4, Nanog, وMyc على مستويات أعلى في الخلايا السالبة HLA-1 مقارنة مع الخلايا الإيجابية HLA-1. البيانات تمثل المتوسط ± SD = 5). (د) تلطيخ إيجابي قوي من النفط الأحمر O وAlizarin الأحمر S يظهر تمايز المحطة الطرفية على طول مسارات lipogenic وosteogenic التي يتم حثها من TICs ساركوما. (E) HLA-1 التلطيخ المناعي من PDXs التي شكلتها HLA-1 إيجابية (اليسار) وسلبية (يمين) التجمعات السكانية. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. والنتائج من هذا الرقم هي من منشور سابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تحد من نجاح هذا البروتوكول لعزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما البشرية PDXs. لاحظنا أن تشكيل PDX يعتمد إلى حد كبير على الأنواع الفرعية ساركوما. ساركوما العدوانية السريرية مع النمط الظاهري غير المتمايز النسيجي (على سبيل المثال، ساركوما غير متمايزة pleomorphic [معدل النجاح 100٪، ن = 2]، الساركوما الشحمية غير المتمايزة [معدل النجاح 100٪، ن = 2]، وساركوما الزليلي [ معدل النجاح 100٪، ن = 3]) لديها معدل نجاح عال من تشكيل PDX. وفي الوقت نفسه، ساركوما مع الأنماط الظاهرية المتمايزة (على سبيل المثال، الساركوما الشحمية المتمايزة بشكل جيد [معدل النجاح 0٪، ن = 3]) تظهر معدلات تشكيل PDX أقل. من الممكن أن تكون الخلايا التي تبدأ الورم موجودة في أنواع فرعية أكثر خبيثة بنسبة مئوية أعلى مما كانت عليه في الأنواع الفرعية الأقل الخبيثة والمتباينة. وبالإضافة إلى ذلك، نوصي بالانتهاء من إجراء عزل الخلايا التي تبدأ الورم في غضون يوم واحد دون أي توقف لتقليل أي فقدان لوجدية الخلية.

لقد حددنا أن الخلايا السالبة HLA-1 موجودة على نطاق واسع في ساركوما الإنسان. ولكن النسبة المئوية للخلايا السلبية HLA-1 يمكن أن تختلف بين عينات من مرضى مختلفين. من خلال هذه الطريقة، قمنا بنجاح بعزل الخلايا التي تبدأ الورم من العينات التي لديها خلايا سلبية HLA-1 تتراوح بين أقل من 0.5٪ إلى أكثر من 30٪12. من المهم أن تميز الخلايا السالبة HLA-1 وظيفيا من خلال تشكيل الكرة والاختبارات تشكيل الورم لتأكيد هوية الخلية التي تبدأ الورم من الخلايا المعزولة HLA-1-السلبية.

ومع ذلك، فإن البروتوكول المعروض هنا له أيضا ً قيود. وأظهرت البيانات السابقة أن التعبير HLA-1 يتم تنظيمها جينيا، وهو ما يتفق مع ملاحظة التغاير الخلوي التعبير HLA-1 داخل نفس الورم12. تم الكشف عن طفرات جينية HLA-1 في ساركوما وأنواع السرطان الأخرى. الطفرات في جينات HLA-1 قد تؤدي إلى فقدان كامل من HLA-1 على سطح الخلية في الورم كله أو للتعبير عن غير وظيفية تغيير HLA-1. في كلتا الحالتين، لا يمكن استخدام سلبية HLA-1 لتحديد TICs داخل الورم.

باستخدام HLA-1 كعلامة سلبية، نجحنا في عزل TICs عن مجموعة متنوعة من الأنواع الفرعية للساركوما البشرية والتحقق من صحة نتائجنا من خلال التحليل الوظيفي. وهكذا، تمكنا من إجراء دراسات جزيئية بما في ذلك تحليل التعبير الجيني على TICs، من أجل تطوير علاج محدد يستهدف هذه المراكز.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل NCI-P01-CA087497 (إلى C.C.-C. وD.H.) وNIH-U 54-0OD020353 (إلى C.C.-C., D.H., و J.D.-D.), جائزة قائد الفكر Agilent (إلى C.C.-C.), ومؤسسة مارتيل (إلى C.C.C.C.and J.D.-D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cell culture filter ThermoFisher 450-0020
100 mm Petri dish Falcon 353003
15 mL conical tube Falcon 352196
35 μm cell strainer Falcon 352340
50 mL polystyrene tube Falcon 352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate Corning 7007
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
B-27 Gibco 08-0085SA
bFGF Invitrogen PHG0021
dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EGF Invitrogen PHG0311
HLA-1-PE antibody Abcam ab43545
hMSC growth medium ATCC PCS-500-030
indomethacin Sigma-Aldrich I7378
isobutylmethylxanthine Sigma-Aldrich I5879
isopropanol Sigma-Aldrich W292907
Isotype Control Antibody Abcam ab103534
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
lithium chloride Sigma-Aldrich 62476
Matrigel basement membrane matrix Corning 354230
MEM Alpha Gibco 12571-063
N2 Gibco 17502-048
NSG mice The Jackson Lab 005557
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
PBS Corning 21-040-CM
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Syringe with needle BD 309626
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15, (4), 338-344 (2013).
  2. Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355, (12), 1253-1261 (2006).
  3. Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood? Cell Stem Cell. 4, (3), 203-205 (2009).
  4. Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65, (8), 3025-3029 (2005).
  5. Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69, (4), 1302-1313 (2009).
  6. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, (3), 373-388 (2012).
  7. Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, (6859), 105-111 (2001).
  8. Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68, (19), 8094-8103 (2008).
  9. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1, (5), 555-567 (2007).
  10. Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14, (10), 491-499 (1993).
  11. Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
  12. Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
  13. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).
عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).More

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter