Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

doi: 10.3791/57011 Published: June 13, 2019

Summary

Vi beskriver en detaljeret protokol for isolering af tumor initierende celler fra humane sarkom patient-afledte xenografter ved fluorescens-aktiveret celle sortering, ved hjælp af humant leukocytantigen-1 (HLA-1) som en negativ markør, og for yderligere validering og karakterisering af disse HLA-1-negative tumor-initierende celler.

Abstract

Eksistensen og betydningen af tumor initierende celler (TICs) er blevet understøttet af stigende beviser i løbet af det seneste årti. Disse TICs har vist sig at være ansvarlige for tumor initiering, metastase, og resistens over for lægemidler. Derfor er det vigtigt at udvikle specifikke TIC-målretning terapi ud over de nuværende kemoterapi strategier, som for det meste fokusere på hovedparten af non-TICs. For yderligere at forstå mekanismen bag malignitet af TICs, vi beskriver en metode til at isolere og til at karakterisere TICs i human sarcomas. Heri viser vi en detaljeret protokol til at generere patient afledte xenografter (pdxs) af humane sarkomer og til at isolere TICs ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) ved hjælp af humant leukocytantigen klasse I (HLA-1) som en negativ markør. Vi beskriver også, hvordan man funktionelt karakteriserer disse TICs, herunder en sfære formation assay og en tumordannelse assay, og at inducere differentiering langs mesenchymal veje. Isolationen og karakteriseringen af PDX TICs giver spor til opdagelsen af potentielle målretnings terapi reagenser. Desuden tyder stigende dokumentation på, at denne protokol kan udvides yderligere til at isolere og karakterisere TICs fra andre former for kræft i mennesker.

Introduction

Intratumoral cellulær heterogenitet af menneskelige kræftformer er blevet understøttet af stigende beviser i løbet af det seneste årti1. I lighed med normalt væv består cancervævet af en lille delpopulation af TICs (også kaldet Cancer stamceller), som udviser tumor dannende evne; i mellemtiden, hovedparten af kræftceller udviser differentierede fænotyper2. Disse TICs viser stamcelle-lignende egenskaber, herunder udtryk for en stamcelle markør og evnen til både selvfornyelse og asymmetrisk celledeling, og dermed kan indlede dannelsen af en cellulær heterogene tumor3. Nylige undersøgelser har afsløret, at TICs ikke kun er ansvarlige for tumor initiering, men er også forbundet med tumor aggressivitet4, metastase5, og Drug resistens6. Derfor er det vigtigt at forstå biologi TICs og dermed udvikle en specifik behandlingsstrategi rettet mod disse TICs.

FACS-baserede metoder er blevet brugt til at identificere TICs ved hjælp af TICs markører, herunder CD133, CD24 og CD441. De fleste af disse markører er også udtrykt i normale stamceller7. Men ingen af disse markører udelukkende mærke TICs. Rollerne disse molekyler spiller i malignitet af TICs er stadig ikke klar. For eksempel, CD133 kan ofte inaktiveres ved DNA-methylering, og dermed, denne intertumoral heterogenitet kan gøre nøjagtigheden af disse markører8. ALDH1 er en markør, der også funktioner til at opretholde stilhed af TICs9. Det synes at være mere effektiv til at identificere brystkræft TICs, men er stadig tvivlsom i andre tumortyper9. Nogle signalering stier spiller vigtige roller i stamcelle biologi, herunder WNT (wingless-relaterede integration site), TGF-β (omdanne vækstfaktor beta), og pindsvin1. Men det er vanskeligt at bevise, at disse veje er TIC-specifikke og til at bruge aktiviteten af disse veje til at isolere TICs fra primære tumorer. Der er således et presserende behov for en pålidelig ny TIC-markør.

Human MHC klasse I, også kaldet HLA-1, er et celleoverflade protein, der udtrykkes i næsten alle nukleerede celler10. HLA-1 fungerer som et antigen, der præsenterer et molekyle, som er specifikt anerkendt af CD8 T celler10. Den cytotoksiske effekt af CD8 T celler kan aktiveres, når kræftceller præsentere en tumor antigen af HLA-1. Derfor, mangler HLA-1 på celleoverfladen af kræftcellerne kan føre til en immun flugt fra de cytotoksiske CD8 T celler. Downregulation af HLA-1 er blevet beskrevet i forskellige typer af human cancer og er korreleret med dårlig prognose, metastase, og resistens over for stoffer11. Vi har vist, at tabet af HLA-1 udtryk på cellens overflade kan bruges til at identificere TICs i sarcomas, samt i prostatacancer6,12.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for at isolere TICs fra Human sarkom pdxs af FACS, ved hjælp af HLA-1 som en negativ markør, og for yderligere at validere og karakterisere disse HLA-1-negative TICs.

Protocol

Alle protokoller for muse eksperimenter diskuteret her var i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og godkendt af Mount Sinai Medical Center institutionel Human forskning etiske udvalg og dyrepasning og brug udvalg.

1. behandling af sarkom Vævsprøven og PDX-dannelse

  1. Under en institutionel revision Board-godkendt protokol, har patologi service personale forberede sarkom prøver fra kirurgi prøver og straks sætte hver prøve på is i en 100 mm Petri skål.
  2. Prøven placeres i et 15 mL konisk rør af polystyren med 6 mL kold Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kulturmedium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Behandl vævsprøven med det samme.
  3. Valgfri For osteosarkom skal du følge de følgende trin, som kan springes over for bløddelssarkom.
    1. Skær vævet i 20 mm3 stykker ved hjælp af en skalpel. Vævs stykkerne overføres til et 15 ml rør, der indeholder 3 ml kollagenaseopløsning (rpmi 1640 med 1 mg/ml kollagenase).
    2. Sæt røret i et vandbad ved 37 °C i 30 minutter.
    3. Vortex røret grundigt, og tilsæt derefter 3 mL RPMI 1640 suppleret med 10% FBS for at neutralisere collagenaseaktiviteten.
    4. Centrifuge i 5 min ved 350 x g ved stuetemperatur. Fjern supernatanten.
  4. Arbejde i en steril biosikkerhed kabinet, placere vævsprøven i en 100 mm Petri skål. Tilsæt 500 μL steril 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) til vævet. Med en steril skalpel, mekanisk udriv vævet i små stykker, indtil ingen synlige væv stykke er større end 0,1 mm.
  5. 500 μL-cellesuspensionen overføres til et 35 μm-cellefilter, og den filtrerede suspension opsamles med et 50 mL polystyren slange. Sæt dette 50 mL polystyren tube med cellesuspensionen på is.
  6. Tilsæt yderligere 500 μL PBS til vævet. Triturate for anden gang, overføre suspensionen gennem cellen Strainer, og indsamle det i samme 50 mL rør.
  7. Gentag disse trin (trin 1.5 – 1.6), indtil vævs sektionen er fuldstændig dissocieret, sædvanligvis 6x-8x.
  8. Pellet cellesuspensionen ved centrifugering ved 350 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, resuspension af pellet med 5 mL hæmolyse buffer (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3og 0,1 mm EDTA), og Inkuber opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne røde blodlegemer.
  9. Centrifuge i 5 min ved 350 x g ved stuetemperatur og fjern hæmolyse buffer. Du vasker pellet med 5 mL PBS. Centrifugér igen i 5 minutter ved 350 x g , og Fjern supernatanten.
  10. Resuspendere pellet med 1 mL PBS og tælle den levedygtige celle nummer ved hjælp af en hemocytometer eller enhver anden alternativ metode. Cellerne fortyndes til en endelig koncentration på 1 x 107 celler i 200 μl PBS. Lad cellesuspensionen være på is.
  11. Lad kælderen membran matrix på is for at gøre det muligt at smelte. Tilsæt 200 μL kælder membran matrix til 200 μL cellesuspension. Bland forsigtigt og hold på isen.
  12. Subkutant injicere cellesuspensionen: Basement membran matrix (1:1) blanding i to NOD scid gamma (NSG) mus i deres flanker. Brug 200 μL til hver injektion.
  13. Overvåge PDX dannelse ved at kontrollere injektionsstedet af mus 2x om ugen. Fjern tumorxenograft, når den når 1 cm i diameter.

2. isolering af tumor initierende celler af FACER fra PDX

  1. Kirurgisk fjernelse af PDX fra musene som beskrevet tidligere12.
  2. Skær tumoren i halve. Fastgør halvdelen af xenograft med 4% PARAFORMALDEHYD natten over. Dette er til histologisk analyse. Behandl den anden halvdel af vævet som beskrevet ovenfor (trin 1.3 – 1.8) for at få en tumor cellesuspension.
  3. Resuspendere pellet med PBS og tælle den levedygtige celle nummer.
  4. Cellesuspensionen fortyndes i PBS suppleret med 5% FBS til en koncentration på 2 x 106 celler/ml. Efterlad cellesuspensionen på is i 30 min. del cellesuspensionen over to rør. Marker rørene med henholdsvis isotop kontrol og antistof. Bemærk antallet af celler i hvert rør.
  5. Forbered 2x HLA-1-PE-antistof ved at fortynde antistoffet med PBS suppleret med 5% FBS (1:250). Fortynde det negative isotype kontrol-antistof med samme tilstand. Bland cellesuspensionen fra "antistof"-røret med fortyndet antistof (1:1) for at gøre den endelige antistof fortynding 1:500. Bland cellesuspensionen fra "isotop kontrol" røret med isotop kontrol (1:1). Sæt celle suspensionerne på is i 90 min.
  6. Centrifugér i 5 min ved 350 x g ved 4 °c, og Fjern supernatanten. Tilsæt 10 mL PBS for at vaske pellet 2x.
  7. Der tilsættes 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til PBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Tilføj denne DAPI-løsning til celle pellet for at gøre en cellesuspension på 107 celler/ml (ved hjælp af celle numrene fra trin 2,4).
  8. Cellesuspensionen filtreres gennem 35 μm-dæksler til 12 mm x 75 mm polystyren-rør.
  9. Brug et flow flowcytometer til at sortere HLA-1-negativ tic delpopulation6. Gate levedygtige celler (DAPI-negative) og indsamle både HLA-1-negative og-positive subpopulationer i 2 15 mL opsamlings slanger, hver indeholdende 4 mL RPMI 1640 kulturmedium.

3. karakterisering af tumor initierende celler

  1. Dannelse af sarcosphere
    1. Lav sarcosphere vækstmedium, ved hjælp af alpha-MEM cellekulturmedium. Tilføj kosttilskud for at foretage en endelig koncentration af B-27 kosttilskud (1x), N2 kosttilskud (1x), grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) (20 ng/mL), og epidermal vækstfaktor (EGF) (20 ng/mL) og penicillin/streptomycin (100 IU/mL). Filtrer mediet med et 0,2 μm cellekultur filter før brug.
    2. Pellet den sorteret HLA-1-negative og-positive delpopulation fra trin 2,9 og tælle celle numrene på hver delpopulation.
    3. 1,5 x 106 celler fortyndes til 15 ml af sarcosphere-vækstmediet for at gøre celle fortyndingen af 1 x 105 celler/ml.
    4. Serielt fortynde cellerne med frisk sarcosphere vækstmedium til at gøre 15 mL af hver celle fortynding af 104, 103, og 102 celler/ml. Derefter forberede 4 96-godt ultra-lav vedhæftede cellekultur plader, hver for en celle fortynding.
    5. Overfør 100 μL cellesuspension fra 105 celler/ml fortynding til hver brønd af den første 96-brønd ultra-lav vedhæftet cellekultur plade. Denne plade har 104 celler i hver brønd.
    6. Brug de andre 3 96-godt ultra-lave vedhæftnings cellekultur plader til de andre tre celle fortyndinger: 104, 103og 102 celler/ml. Overfør 100 μL cellesuspension til hver brønd af 96-brønden ultra-lave vedhæftnings cellekultur plader. Disse tre kultur plader har 1.000 celler/godt, 100 celler/godt, og 10 celler/godt, hhv.
    7. Sæt pladerne i en 37 °C, 5% CO2 cellekultur inkubator.
    8. Tilføj ny bFGF og EGF direkte til cellekultur mediet (den endelige koncentration på 20 ng/mL) hver tredje dag uden at ændre mediet for at undgå, at cellerne går tabt i suspensions kulturen.
    9. Ved hjælp af et let mikroskop, overvåge sarcosphere dannelse hver dag i tre uger, som vist i figur 2a.
    10. Efter tre uger tælles antallet af sarcosphere-positive brønde og sarcosphere-negative brønde af hver celle fortynding for både HLA-1-negative og HLA-1-positive celler.
    11. Beregn den kugle dannende celle frekvens baseret på en Poisson-sandsynlighedsfordeling13. Sammenlign HLA-1-negative TICs med HLA-1-positive bulk celler.
  2. Test af tumordannelse med seriel fortynding
    1. Tæl HLA-1-negative og-positive subpopulationer fra trin 2,9.
    2. Gør serielle fortyndinger af cellerne med PBS til koncentrationer på 106, 105, 104og 103 celler/ml. Brug 1 mL af hver fortynding til tumordannelse i 10 mus.
    3. 1 mL basalmembran matrix tilsættes til 1 mL-cellesuspensionen af hver fortynding (1:1). Opbevar 2 mL af hver blanding på is.
    4. Subkutant injicerer 200 μL af cellen: kælder membran matrix blanding i flankerne af NGS-mus, ved hjælp af HLA-1-negative celler for en flanke og HLA-1-positive celler til den anden flanke af samme mus. Brug 10 mus til hver fortynding. Brug 25G sprøjter med en nål til injektionerne.
    5. Overvåg tumordannelse i musene i fire til otte uger, afhængigt af hastigheden af tumorvækst.
    6. Beregn tumor-initierende celle frekvens med procentdelen af tumordannelse ved forskellige Inputcelle numre. Sammenlign HLA-1-negative TICs med HLA-1-positive bulk celler.
  3. Induceret differentiering langs mesenchymal veje
    1. Brug sarcosfærerne dannet under tidligere trin (trin 3.1.9). Overfør sarcosfærerne til en ny 6-brønd tallerken. Kultur sarcosphere med 2,5 mL Alpha-MEM suppleret med 10% FBS at lade cellerne vedhæfte til kulturen plade overflade.
    2. Efter en vedhæftet fil i to dage, Skift kulturmediet fra Alpha-MEM suppleret med 10% FBS til 1:1 blandingen af alpha-MEM suppleret med 10% FBS og humant mesenchymal stamcelle (hMSC) vækstmedium.
    3. Efter to dage skal du skifte til komplet hMSC-vækstmedium.
    4. Når cellerne når 90% konfluency, aspirerer hMSC-mediet og tilføjer differentierings medium. For osteogen differentiering tilsættes osteogen differentierings medium (hMSC-vækstmedium suppleret med 10 nM dexamethason, 5 mM β-glycerophosphat, 50 μg/mL L-ascorbinsyre og 10 mM lithiumchlorid). For lipogenic differentiering tilsættes fedtcellerne differentierings medium (hmsc-vækstmedium suppleret med 0,5 μm dexamethason, 0,5 μm isobutylmethylxanthin og 50 μm Indomethacin).
    5. Skift differentierings mediet hver tredje dag.
    6. Efter tre til fire uger, stoppe differentieringen og vaske cellerne med PBS. Derefter aspirere PBS og tilsæt 2 mL 10% formalin til cellerne til fiksering. Lad cellerne sidde i 45 min ved stuetemperatur. Vask dem med deioniseret vand. Cellerne er nu klar til alizarin Red S farvning (trin 3.3.6.1) eller olie rød O farvning (trin 3.3.6.2).
      1. For at påvise osteogen differentiering skal du udføre alizarin Red S-farvning. Aspirer vand og tilsæt 2 mL alizarin Red S-arbejdsopløsning (2% alizarin Red S, pH 6,0) til cellerne, og lad dem sidde i 5 minutter for farvning. Vask cellerne med deioniseret vand og observere reaktionen mikroskopisk.
      2. For at opdage adipogenisk differentiering, udføre olie rød O farvning.
        1. Lav en olie rød O opløsning. Forbered en stamopløsning ved at tilsætte 300 mg olie rødt O pulver til 100 mL isopropanol.
        2. Inden for 2 timer før brug blandes tre dele (30 mL) olie rød O stamopløsning med to dele (20 mL) deioniseret vand. Lad blandingen sidde i 10 minutter ved stuetemperatur.
        3. Filtrer arbejdsopløsningen ved hjælp af før brug.
        4. Fjern vandet fra cellerne, som er fremstillet i henhold til trin 3.3.6. Tilsæt 2 ml 60% isopropanol til at dække celle enkeltlags og cellerne sidder i 2 min.
        5. Fjern isopropanol og tilsæt 2 mL olie rød O arbejdsopløsning. Lad cellerne sidde i 5 minutter ved stuetemperatur.
        6. Skyl cellerne med deioniseret vand og observere reaktionen under et let mikroskop.

Representative Results

En menneskelig sarkom PDX blev genereret og plettet. Intratumoral heterogenitet blev påvist ved immun histokemi ved brug af HLA-1-antistof. Xenograft bestod af to forskellige delpopulationer, nemlig HLA-1 positiv og negativ (figur 1a)12. Sarkom PDX viste histologiske ligheder med forældrenes primære tumor (figur 1a). Sarkom PDX TICs blev isoleret af FACS. Ved hjælp af en dobbelt sorteringsmetode blev de HLA-1-negative celler stærkt beriget fra forældre celle populationen (figur 1b)12.

Gener udtrykt i stamceller (f. eks. Oct4, Nanog og MYC) viste sig at være stærkt udtrykt i isolerede HLA-1-negative celler sammenlignet med deres HLA-1-positive modstykke (figur 1c). Sox-9, et udviklingsmæssige gen, der blev rapporteret til at spille en vigtig rolle i andre kræft stamceller, såsom brystkarcinom, blev specifikt udtrykt i HLA-1-negative celler (figur 1d).

For at validere den isolerede HLA-1-negative subpopulation blev der udført en sarcosphere formation assay for at undersøge cellernes selv fornyelsesevne. HLA-1-negative celler var i stand til at danne kugler med en indledende indgang på så lidt som 10 celler (figur 1E)12. For at undersøge tumor dannende evne, en seriel-fortynding tumor-dannelse assay blev udført. Det samme antal HLA-1-negative og positive celler blev injiceret subkutant i hver flanke af samme mus. HLA-1-negative celler viste en signifikant højere tumordannelse evne (figur 1f)12, mens xenografter dannet af både HLA-1-negative og-positive subpopulationer var cellulære heterogene tumorer (figur 1H).

Vi udførte en analyse af genekspression af de isolerede HLA-1-negative TICs12. Gener forbundet med normal mesenchymal Celledifferentiering blev forhøjet i TICs12. Således, vi også testet, om HLA-1 TICs kan blive induceret til terminal differentiering og resultere i en nedsat tumordannelse evne. Resultaterne viste, at HLA-1-negative celler kan induceres til at skelne langs både lipogene og osteogene veje og vise stærk olie rød O og alizarin rød S farvning (figur 1G). I modsætning hertil skelner HLA-1-positive celler ikke under de samme betingelser. Således, disse resultater indikerer en lovende differentieret terapi strategi, der kan anvendes til at målrette sarkom TICs.

Figure 1
Figur 1: isolering af HLA-1-negative celler fra intratumoral heterogene sarkom PDXs. (A) HLA-1-negative celler (pile) blev fundet i forskellige undertyper af humane sarkomer ved Immunhistokemi (IHC). (a og b) Klar celle sarkom. (c og d) Pleomorphic liposarkom. (e og f) Leiomyosarkom. (g og h) Maligne perifere nerve kappe tumor. (i og j) Liposarkom, ikke andetsteds specificeret. (k og l) Dedifferentieret liposarkom. Scale bar = 100 μm.B) sarkom pdxs var histologisk ligner den forældre tumor (hematoxylin og eosin [H & E] plet) og viste cellulær heterogenitet i HLA-1 ekspression af IHC. Her er vist repræsentative billeder af sarkom PDXs, herunder en klar celle sarkom (CCS), en dedifferentieret chondrosarkom (DCS), og en dedifferentieret liposarkom (DDL). Scale bar = 100 μm.C) delpopulationen af HLA-1-negative celler blev isoleret ved flowcytometri med en dobbelt sorteringsmetode. Fra top til bund: første sortering, anden sortering og renheds kontrol. Isolerede HLA-1-negative og HLA-1-positive celler blev underkastet en efterfølgende funktionel analyse, herunder en tumordannelse analyse. Resultaterne fra dette tal er fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af HLA-1-negative TICs ved funktionelle assays. (A) en sfære formation analyse viste, at så få som 10 HLA-1-negative celler var i stand til at danne sarkom kugler. Venstre: repræsentative billeder af sarkom kugler. Højre: kugle dannende frekvens; Gennemsnitlig ± SD. Scale bar = 100 μm. (B) HLA-1-negative celler isoleret fra sarkom PDX var meget tumorigenic. Her vises repræsentative billeder af tumoren dannet af HLA-1-negative og-positive celler fra DDL. En tusind celler af HLA-1-negative og HLA-1-positive DDL celler blev injiceret i separate flanker af samme mus. C) mRNA-niveauerne for stamcelle gener Oct4, nanogog MYC blev udtrykt ved højere niveauer i HLA-1-negative celler sammenlignet med HLA-1-positive celler. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD (n = 5). D) stærk positiv farvning af olie rødt O og alizarin Red S viser en terminal differentiering langs lipogene og osteogene veje, der er induceret af sarkom TICs. E) HLA-1-immun farvning af pdxs dannet af HLA-1-positive (venstre) og-negative (højre) delpopulationer. Scale bar = 100 μm. Resultaterne fra dette tal er fra en tidligere publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er flere kritiske skridt, som begrænser succesen af denne protokol til at isolere og karakterisere tumor-initierende celler fra Human sarkom pdxs. Human sarkom indeholder mange forskellige undertyper. Vi bemærkede, at PDX dannelse er meget afhængig af sarkom undertyper. Klinisk aggressive sarkomer med en histologisk udifferentieret fænotype (f. eks. pleomorfe udifferentieret sarkomer [succesrate 100%, n = 2], dedifferentieret liposarcomas [succesrate 100%, n = 2], og synovial sarkomer [ Succesraten 100%, n = 3]) har en høj succesrate for PDX dannelse. I mellemtiden viser sarkomer med differentierede fænotyper (f. eks. veldifferentieret liposarcomas [succesrate 0%, n = 3]) lavere PDX-dannelses rater. Det er muligt, at tumor initierende celler er til stede i mere maligne undertyper ved en højere procentdel end i mindre maligne, differentierede undertyper. Derudover anbefaler vi at afslutte tumor initierende celle isolations proceduren inden for en dag uden stop for at minimere ethvert tab af cellernes levedygtighed.

Vi har identificeret, at HLA-1-negative celler findes bredt i human sarcomas. Men procentdelen af HLA-1-negative celler kan variere blandt prøver fra forskellige patienter. Ved denne metode, vi har med succes isoleret tumor-initierende celler fra prøver, der har HLA-1-negative celler spænder fra mindre end 0,5% til mere end 30%12. Det er vigtigt at karakterisere HLA-1-negative celler funktionelt ved sfære dannelse og tumordannelse assays at bekræfte tumor-initierende celle identitet af isolerede HLA-1-negative celler.

Men den protokol, der præsenteres her, har også begrænsninger. Tidligere data viste, at HLA-1 udtryk er epigenetisk reguleret, hvilket er i overensstemmelse med observation af HLA-1 Expression cellulære heterogenitet inden for samme tumor12. Der blev påvist HLA-1-genommutationer i sarkomer og andre kræfttyper. Mutationer i HLA-1 gener kan føre til fuldstændig tab af HLA-1 på cellens overflade i hele tumoren eller til at udtrykke Ufunktionelt muteret HLA-1. I begge tilfælde kan HLA-1 negativitet ikke bruges til at identificere TICs inden for tumoren.

Ved hjælp af HLA-1 som en negativ markør, har vi med succes isoleret TICs fra en bred vifte af human sarkom undertyper og valideret vores resultater ved funktionel analyse. Således var vi i stand til at udføre molekylære undersøgelser, herunder genekspression analyse på TICs, for at udvikle specifik behandling rettet mod disse TICs.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af NIC-P01-CA087497 (til C.C.-C. og D.H.) og NIH-U 54-0OD020353 (til C.C.-C., D.H. og J.D.-D.), Agilent troede Leader Award (til C.C.-C.), og Martel Foundation (til C.C.-C. og J.D.-D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cell culture filter ThermoFisher 450-0020
100 mm Petri dish Falcon 353003
15 mL conical tube Falcon 352196
35 μm cell strainer Falcon 352340
50 mL polystyrene tube Falcon 352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate Corning 7007
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
B-27 Gibco 08-0085SA
bFGF Invitrogen PHG0021
dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EGF Invitrogen PHG0311
HLA-1-PE antibody Abcam ab43545
hMSC growth medium ATCC PCS-500-030
indomethacin Sigma-Aldrich I7378
isobutylmethylxanthine Sigma-Aldrich I5879
isopropanol Sigma-Aldrich W292907
Isotype Control Antibody Abcam ab103534
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
lithium chloride Sigma-Aldrich 62476
Matrigel basement membrane matrix Corning 354230
MEM Alpha Gibco 12571-063
N2 Gibco 17502-048
NSG mice The Jackson Lab 005557
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
PBS Corning 21-040-CM
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Syringe with needle BD 309626
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15, (4), 338-344 (2013).
  2. Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355, (12), 1253-1261 (2006).
  3. Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood? Cell Stem Cell. 4, (3), 203-205 (2009).
  4. Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65, (8), 3025-3029 (2005).
  5. Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69, (4), 1302-1313 (2009).
  6. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, (3), 373-388 (2012).
  7. Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, (6859), 105-111 (2001).
  8. Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68, (19), 8094-8103 (2008).
  9. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1, (5), 555-567 (2007).
  10. Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14, (10), 491-499 (1993).
  11. Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
  12. Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
  13. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).
Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).More

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter