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Cancer Research

अलगाव और सरकोमा रोगी व्युत्पन्न Xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता

doi: 10.3791/57011 Published: June 13, 2019

Summary

हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन-1 (HLA-1) का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव सार्कोमा रोगी व्युत्पन्न xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, और आगे सत्यापन के लिए और इन HLA-1-नकारात्मक ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता.

Abstract

ट्यूमर शुरू कोशिकाओं (TICs) के अस्तित्व और महत्व पिछले एक दशक के दौरान सबूत बढ़ाने के द्वारा समर्थित किया गया है. इन TICs ट्यूमर दीक्षा, मेटास्टेसिस, और दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार होना दिखाया गया है. इसलिए, वर्तमान रसायन चिकित्सा रणनीतियों के अलावा विशिष्ट टीआईसी-लक्ष्यीकरण चिकित्सा विकसित करना महत्वपूर्ण है, जो ज्यादातर गैर-टीआईसी के थोक पर ध्यान केंद्रित करते हैं। आदेश में आगे TICs की द्रोह के पीछे तंत्र को समझने के लिए, हम एक विधि को अलग करने के लिए और मानव सार्क में TICs की विशेषता का वर्णन. इसमें, हम मानव सार्कोमा के रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) उत्पन्न करने के लिए और एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन वर्ग मैं (HLA-1) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिखा। इसके अलावा, हम वर्णन कैसे कार्यात्मक इन TICs की विशेषता के लिए, एक क्षेत्र के गठन परख और एक ट्यूमर गठन परख सहित, और mesenchymal रास्ते के साथ भेदभाव प्रेरित करने के लिए. अलगाव और PDX TICs की विशेषता संभावित लक्ष्यीकरण चिकित्सा अभिकर्मकों की खोज के लिए सुराग प्रदान करते हैं. इसके अलावा, बढ़ते सबूत पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल को और अधिक अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और मानव कैंसर के अन्य प्रकार से TICs की विशेषता.

Introduction

मानव कैंसर के इंट्राट्यूमरल सेलुलर विषमता को पिछले दशक1के दौरान साक्ष्य में वृद्धि करके सहायता प्रदान की गई है . सामान्य ऊतक के समान, कैंसर के ऊतकों में TICs (जिसे कैंसर स्टेम सेल भी कहा जाता है) की एक छोटी सी उपजनसंख्या होती है, जो ट्यूमर बनाने की क्षमता प्रदर्शित करती है; इस बीच, कैंसर कोशिकाओं के थोक विभेदित phenotypes2प्रदर्शन. इन TICs स्टेम सेल की तरह गुण दिखाने के लिए, एक स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और दोनों आत्म-नवीकरण और असममित सेल विभाजन की क्षमता सहित, और इस प्रकार, एक सेलुलर विषम ट्यूमर3के गठन आरंभ कर सकते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि टीआईसी न केवल ट्यूमर दीक्षा के लिए जिम्मेदार हैं बल्कि ट्यूमर आक्रामकता4, मेटास्टेसिस5, और दवा प्रतिरोध6के साथ भी जुड़े हुए हैं . इसलिए, यह TICs के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और, इस प्रकार, इन TICs को लक्षित एक विशिष्ट उपचार रणनीति विकसित.

FACS-आधारित विधियों का उपयोग TICs मार्करका उपयोग करके TICs की पहचान करने के लिए किया गया है, जिसमें CD133, CD24 और CD441शामिल हैं। इनमें से अधिकांश मार्कर सामान्य स्टेम कोशिकाओं7में भी व्यक्त किए जाते हैं . हालांकि, इन मार्करों में से कोई भी केवल TICs निशान. TICs की द्रोह में इन अणुओं की भूमिकाएँ अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। उदाहरण के लिए, CD133 डीएनए मिथाइलेशन द्वारा अक्सर निष्क्रिय किया जा सकता है, और इस प्रकार, इस intertumoral विषमता इन मार्करों8की सटीकता प्रदान कर सकते हैं. ALDH1 एक मार्कर है कि भी TICs9के स्टेमनेस बनाए रखने के लिए कार्य करता है. यह स्तन कैंसर TICs की पहचान करने में अधिक प्रभावी लगता है, लेकिन अभी भी अन्य ट्यूमर प्रकार9में संदिग्ध है . कुछ संकेतन रास्ते स्टेम सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, Wnt (wingless से संबंधित एकीकरण साइट), TGF-जेड (परिवर्तन विकास कारक बीटा), और हेजहॉग1सहित. लेकिन यह साबित करना मुश्किल है कि इन रास्ते टीआईसी-विशिष्ट हैं और प्राथमिक ट्यूमर से TICs को अलग करने के लिए इन रास्ते की गतिविधि का उपयोग करें। इस प्रकार, एक विश्वसनीय उपन्यास टीसी मार्कर तत्काल जरूरत है.

मानव MHC वर्ग मैं, भी HLA-1 कहा जाता है, एक सेल सतह प्रोटीन लगभग सभी नाभिकीय कोशिकाओं में व्यक्त10है. एचएलए-1 एक प्रतिजन के रूप में कार्य करता है जो एक अणु पेश करता है जिसे विशेष रूप से CD8 T कोशिकाओं10द्वारा मान्यता प्राप्त है। सीडी 8 टी कोशिकाओं के cytotoxic प्रभाव सक्रिय किया जा सकता है जब कैंसर की कोशिकाओं HLA-1 द्वारा एक ट्यूमर प्रतिजन मौजूद. इसलिए, कैंसर कोशिकाओं की कोशिका सतह पर HLA-1 की कमी साइटोटॉक्सिक सीडी 8 टी कोशिकाओं से प्रतिरक्षा से बचने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एचएलए-1 के डाउनरेगुलेशन को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर में वर्णित किया गया है और यह खराब पूर्वानुमान, मेटास्टेसिस और दवा प्रतिरोध11के साथ सहसंबद्ध है। हमने दिखाया है कि कोशिका की सतह पर एचएलए-1 अभिव्यक्ति के नुकसान का उपयोग सार्कोमा में टीआईसी की पहचान करने के साथ-साथ प्रोस्टेट कैंसर6,12में किया जा सकता है।

यहाँ, हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग कर, और आगे मान्य और इन HLA-1-नकारात्मक TICs की विशेषता के लिए, FACS द्वारा मानव सार्कोमा PDXs से TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.

Protocol

यहाँ चर्चा माउस प्रयोगों के लिए सभी प्रोटोकॉल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार थे और माउंट Sinai मेडिकल सेंटर संस्थागत मानव अनुसंधान आचार समिति और पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित.

1. Sarcoma ऊतक नमूना के प्रसंस्करण, और PDX गठन

  1. एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत, पैथोलॉजी सेवा कर्मियों सर्जरी नमूनों से सार्कोमा नमूने तैयार करते हैं और तुरंत एक 100 मिमी पेट्री डिश में बर्फ पर प्रत्येक नमूने डाल दिया है।
  2. ठंड Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) 1640 संस्कृति मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / ऊतक के नमूने को तुरंत संसाधित करें।
  3. (वैकल्पिक) केवल ऑस्टियोसार्कोमा के लिए, निम्न चरणों का पालन करें, जिन्हें नरम ऊतक सार्कोमा के लिए छोड़ दिया जा सकता है।
    1. एक स्केलपेल का उपयोग कर 20 मिमी3 टुकड़ों में ऊतक कट. ऊतक के टुकड़ों को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 3 एमएल कोलैजाज़ घोल (आरपीएमआई 1640 1 मिलीग्राम/एमएल कोलैजानेस के साथ) शामिल है।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब रखो.
    3. पूरी तरह से ट्यूब भंवर और, फिर, जोड़ें 3 एमएल आरपीएमआई 1640 के साथ पूरक 10% FBS कोलेजाने की गतिविधि को बेअसर करने के लिए.
    4. कमरे के तापमान पर 350 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट निकालें.
  4. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, एक 100 मिमी पेट्री डिश में ऊतक नमूना जगह है. ऊतक के लिए बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 500 डिग्री एल जोड़ें। एक बाँझ स्केलपेल के साथ, यंत्रवत् ऊतक को छोटे टुकड़ों में triturate जब तक कोई दिखाई ऊतक टुकड़ा 0.1 मिमी से बड़ा है.
  5. एक 35 डिग्री सेल छलनी के लिए 500 डिग्री एल सेल निलंबन स्थानांतरण और एक 50 एमएल polystyrene ट्यूब के साथ फ़िल्टर्ड निलंबन इकट्ठा. बर्फ पर सेल निलंबन के साथ इस 50 एमएल polystyrene ट्यूब रखो.
  6. ऊतक के लिए पीबीएस के एक और 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. दूसरी बार के लिए Triturate, सेल छलनी के माध्यम से निलंबन हस्तांतरण, और यह एक ही 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा.
  7. इन चरणों को दोहराएँ (चरण 1.5-1.6) जब तक ऊतक अनुभाग पूरी तरह से अलग है, आमतौर पर 6x - 8x.
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा सेल निलंबन गोली। सुपरनेटेंट को छोड़ दें, 5 एमएल हेमोलिसिस बफर (0.15 एम एनएच4सीएल, 10 एमएम KHCO3, और 0.1 एमएम EDTA) का उपयोग करके गोली को फिर से करें, और लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें।
  9. कमरे के तापमान पर 350 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और हेमोलिसिस बफर को हटा दें। पीबीएस के 5 एमएल के साथ गोली धो लें। 350 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को हटा दें।
  10. पीबीएस के 1 एमएल के साथ गोली को पुन: निलंबित करें और एक हेमोसाइटोमीटर या किसी अन्य वैकल्पिक विधि का उपयोग करके व्यवहार्य सेल संख्या की गणना करें। पीबीएस के 200 डिग्री एल में 1 x 107 कोशिकाओं की अंतिम सांद्रता के लिए कोशिकाओं को पतला करें। बर्फ पर सेल निलंबन छोड़ दें.
  11. बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स छोड़ दो यह पिघल करने के लिए अनुमति देते हैं. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 200 $L 200 $L सेल निलंबन के लिए जोड़ें. धीरे से मिश्रण और बर्फ पर रहते हैं.
  12. कोशिका निलंबन को उप-संयोगसे इंजेक्ट करें: आधार झिल्ली मैट्रिक्स (1:1) मिश्रण दो NOD scid गामा (एनएसजी) चूहों में उनके flanks में. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए 200 $L का प्रयोग करें।
  13. चूहों 2x एक सप्ताह के इंजेक्शन साइट की जाँच करके PDX गठन की निगरानी. ट्यूमर xenograft निकालें जब यह व्यास में 1 सेमी तक पहुँचता है.

2. पीडीएक्स से FACS द्वारा ट्यूमर शुरू कोशिकाओं के अलगाव

  1. पहले बताए गए 12 चूहोंसे पीडीएक्स को शल्य चिकित्सा से हटा दें.
  2. ट्यूमर को आधे में काटें। 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ रात भर के लिए जेनेग्रैफ्ट का आधा ठीक करें। यह हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए है। ऊपर वर्णित के रूप में ऊतक के अन्य आधे प्रक्रिया (चरणों 1.3-1.8) एक ट्यूमर सेल निलंबन पाने के लिए.
  3. पीबीएस के साथ गोली resuspend और व्यवहार्य सेल संख्या गिनती.
  4. पीबीएस में सेल निलंबन को 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए 5% एफबीएस के साथ पूरक को हल करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन छोड़ दें। दो ट्यूबों पर सेल निलंबन विभाजित करें। क्रमशः आइसोटोप नियंत्रण और एंटीबॉडी के साथ ट्यूबों को चिह्नित करें। प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं की संख्या नोट कीजिए।
  5. PBS के साथ एंटीबॉडी को कम करके 2x HLA-1-पीई एंटीबॉडी तैयार करें 5% FBS (1:250) के साथ पूरक. एक ही शर्त के साथ नकारात्मक आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी को विलेन करें। पतला एंटीबॉडी के साथ "एंटीबॉडी" ट्यूब से सेल निलंबन मिक्स (1:1) अंतिम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बनाने के लिए 1:500. आइसोटोप नियंत्रण (1:1) के साथ "आइसोटोप नियंत्रण" ट्यूब से सेल निलंबन मिक्स। 90 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन रखो.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें। गोली 2x धोने के लिए पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें।
  7. पीबीएस में 4',6-diamidino-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) जोड़ें 10 g/ 107 कक्षों/एमएल (चरण 2.4 से कक्ष संख्याओं का उपयोग करके) के कक्ष निलंबन करने के लिए इस DAPI समाधान को सेल पेलेट में जोड़ें.
  8. 12 मिमी x 75 मिमी polystyrene ट्यूबों में 35 डिग्री मीटर छलनी टोपी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर।
  9. HLA-1-नकारात्मक TIC subpopulation6सॉर्ट करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें। गेट व्यवहार्य कोशिकाओं (DAPI-नकारात्मक) और दो 15 एमएल संग्रह ट्यूबों में दोनों HLA-1-नकारात्मक और सकारात्मक subpopulations इकट्ठा, प्रत्येक आरपीएमआई 1640 संस्कृति माध्यम के 4 एमएल युक्त.

3. ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता

  1. सारकोस्फीयर गठन
    1. अल्फा-एमईएम सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करते हुए, sarcosphere विकास माध्यम बनाओ। बी-27 की खुराक (1x), N2 की खुराक (1x), बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF) (20 एनजी/एमएल), और epidermal विकास कारक (EGF) (20 एनजी /एमएल) और पेनिसिलिन / उपयोग करने से पहले 0.2 डिग्री सेल कल्चर फ़िल्टर के साथ माध्यम फ़िल्टर करें.
    2. चरण 2.9 से हल HLA-1-नकारात्मक और -positive subpopulation गोली और प्रत्येक subpopulation के सेल संख्या गिनती.
    3. 1 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल के सेल कमजोर पड़ने को बनाने के लिए सारकोस्फीयर वृद्धि माध्यम के 15 एमएल में 1.5 x 106 कोशिकाओं को पतला करें।
    4. 104, 103, और 102 कोशिकाओं/एमएल के प्रत्येक कोशिका कमजोर पड़ने के 15 एमएल बनाने के लिए ताजा सार्कोस्फीयर विकास माध्यम के साथ कोशिकाओं को क्रमबद्ध रूप से पतला करें। फिर, चार 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव सेल संस्कृति प्लेटें, एक सेल कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक तैयार करते हैं.
    5. पहले 96-वेल अल्ट्रा-लो लगाव सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 105 कोशिकाओं/एमएल कमजोर पड़ने से सेल निलंबन का 100 $L स्थानांतरित करें। इस प्लेट में प्रत्येक कुएं में 104 कोशिकाएं हैं।
    6. अन्य तीन सेल कमजोर पड़ने के लिए अन्य तीन 96-वेल अल्ट्रा-लो लगाव सेल कल्चर प्लेट्स का उपयोग करें: 104, 103, और 102 सेल/ 96-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव सेल संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 100 $L स्थानांतरण. इन तीन संस्कृति प्लेटों में क्रमशः 1,000 कोशिकाएं/अच्छी, 100 कोशिकाएं/अच्छी और 10 कोशिकाएं/
    7. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में डाल दें।
    8. नई bFGF और EGF सीधे सेल संस्कृति माध्यम के लिए जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 20 एनजी /एमएल) निलंबन संस्कृति में खो कोशिकाओं से बचने के लिए माध्यम को बदलने के बिना हर तीन दिन.
    9. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके, तीन सप्ताह के लिए हर दिन sarcosphere गठन की निगरानी, के रूप में चित्र 2Aमें दिखाया गया है.
    10. तीन सप्ताह के बाद, एचएलए-1-नकारात्मक और एचएलए-1-सकारात्मक कोशिकाओं दोनों के लिए प्रत्येक कोशिका कमजोर पड़ने के सारकोस्फीयर-पॉजिटिव कुओं और सार्कोस्फीयर-नकारात्मक कुओं की संख्या की गणना करें।
    11. पोइसन प्रायिकता वितरण13के आधार पर गोले बनाने वाले सेल आवृत्ति की गणना कीजिए। HLA-1-नकारात्मक TICs की तुलना HLA-1-सकारात्मक बल्क कोशिकाओं से करें।
  2. सीरियल-डिल्यूशन ट्यूमर गठन परख
    1. चरण 2.9 से HLA-1-नकारात्मक और -positive subpopulations की गणना करें।
    2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं के सीरियल कमजोर पड़ने 106, 105, 104, और 103 कोशिकाओं / 10 चूहों में ट्यूमर गठन के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 एमएल का प्रयोग करें।
    3. प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 एमएल सेल निलंबन के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 1 एमएल जोड़ें (1:1). प्रत्येक मिश्रण का 2 एमएल बर्फ पर रखें।
    4. कोशिका के 200 डिग्री सेल्सियस को उप-खंड में इंजेक्ट करें: एन जी एस चूहों के पार्श्वों में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण, एक पार्श्व के लिए एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करना और एचएलए-1-सकारात्मक कोशिकाओं को एक ही माउस के दूसरे पार्श्व के लिए। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए, 10 चूहों का उपयोग करें. इंजेक्शन के लिए एक सुई के साथ 25G सिरिंजों का प्रयोग करें।
    5. चार से आठ सप्ताह के लिए चूहों में ट्यूमर गठन की निगरानी, ट्यूमर के विकास की दर पर निर्भर करता है.
    6. विभिन्न इनपुट सेल संख्या ओंकारियों पर ट्यूमर गठन के प्रतिशत से ट्यूमर-आरंभ करने वाली सेल आवृत्ति की गणना करें। HLA-1-नकारात्मक TICs की तुलना HLA-1-सकारात्मक बल्क कोशिकाओं से करें।
  3. मध्यक्रम के रास्ते के साथ भेदभाव प्रेरित
    1. पिछले चरणों (चरण 3.1.9) के दौरान बने sarcospheres का उपयोग करें। एक नई 6 अच्छी तरह से थाली में sarcospheres स्थानांतरण. अल्फा-एमईएम के 2.5 एमएल के साथ sarcosphere संस्कृति 10% FBS के साथ पूरक कोशिकाओं संस्कृति प्लेट सतह को देते हैं.
    2. दो दिनों के लिए एक लगाव के बाद, अल्फा-एमईएम से संस्कृति माध्यम स्विच 10% FBS के साथ पूरक 10% एफबीएस और मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSC) विकास माध्यम के साथ पूरक 1:1 मिश्रण.
    3. दो दिनों के बाद, एचएमएससी विकास माध्यम को पूरा करने के लिए स्विच करें।
    4. जब कोशिकाएं 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो एचएमएससी माध्यम को प्रेरित करें और विभेदन माध्यम जोड़ें। अस्थिजन्य विभेद के लिए ऑस्टियोजेनिक विभेदन माध्यम (एचएमएससी वृद्धि माध्यम 10 एनएम डेक्सामेथासोन, 5 एमएम -ग्लिसेरोफॉस्फेट, 50 ग्राम/एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड, और 10 एमएम लिथियम क्लोराइड) जोड़ें। लिपोजेनिक विभेदकेशन के लिए, एडिपोसाइट विभेदन माध्यम (एचएमएससी वृद्धि माध्यम 0.5 डिग्री सेल्सियस डेक्सामेथासोन, 0.5 डिग्री सेल्सियस आइसोबुटिलमेथिलक्सेन्थीन, और 50 डिग्री एम इंडोमेथासिन) के साथ पूरक जोड़ें।
    5. हर तीन दिन में भेदभाव माध्यम बदलें।
    6. तीन से चार सप्ताह के बाद, भेदभाव बंद करो और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। फिर, पीबीएस को प्रेरित करें और निर्धारण के लिए कोशिकाओं को 10% फॉर्मेलिन के 2 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए बैठते हैं। उन्हें deionized पानी से धो लें. कोशिकाओं को अब Alizarin लाल एस धुंधला (चरण 3.3.6.1) या तेल लाल ओ धुंधला (चरण 3.3.6.2) के लिए तैयार हैं.
      1. ऑस्टियोजेनिक भेदभाव का पता लगाने के लिए, Alizarin लाल एस धुंधला प्रदर्शन करते हैं। Aspirate पानी और कोशिकाओं के लिए Alizarin लाल एस काम कर समाधान (2% Alizarin लाल एस, पीएच 6.0) के 2 एमएल जोड़ें, और उन्हें धुंधला करने के लिए 5 मिनट के लिए बैठते हैं। कोशिकाओं को deionized पानी से धो लें और प्रतिक्रिया सूक्ष्म रूप से निरीक्षण करें।
      2. adipogenic भेदभाव का पता लगाने के लिए, तेल लाल हे धुंधला प्रदर्शन.
        1. एक तेल लाल हे समाधान बनाओ. आइसोप्रोपेनोल के 100 एमएल में 300 मिलीग्राम तेल लाल ओ पाउडर डालकर एक स्टॉक समाधान तैयार करें।
        2. 2 ज का उपयोग करने से पहले, तेल लाल हे स्टॉक समाधान के तीन भागों (30 एमएल) को deionized पानी के दो भागों (20 एमएल) के साथ मिलाएं। मिश्रण कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें।
        3. उपयोग करने से पहले उपयोग करके कार्यशील समाधान फ़िल्टर करें.
        4. चरण 3.3.6 के अनुसार तैयार कोशिकाओं से पानी निकालें. सेल मोनोलेयर को कवर करने के लिए 60% आइसोप्रोपेनोल का 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाएं 2 मिनट के लिए बैठते हैं।
        5. आइसोप्रोपेनोल निकालें और 2 एमएल तेल लाल ओ कार्य समाधान जोड़ें। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
        6. कोशिकाओं को विआयनित जल से कुल्ला करें और प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के नीचे अभिक्रिया का प्रेक्षण करें।

Representative Results

एक मानव सार्कोमा PDX उत्पन्न और दाग था. इंट्राट्यूमरल विषमजनता एचएलए-1 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा दिखाया गया था। एक्सोग्रेफ्ट में दो अलग-अलग उप-जनसंख्याएं शामिल हैं , नामत एचएलए-1 धनात्मक और नकारात्मक (चित्र 1क)12. सार्कोमा पीडीएक्स ने माता-पिता के प्राथमिक ट्यूमर के साथ हिस्टोलॉजिकल समानताएं दिखाईं (चित्र 1क) . Sarcoma PDX TICs FACS द्वारा अलग किया गया. दोहरी छँटाई विधि का उपयोग करते हुए एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं को पैतृक कोशिका जनसंख्या से अत्यधिक समृद्ध किया गया (चित्र 1ख)12.

स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त जीन (उदाहरण के लिए, Oct4, Nanog, और Myc) अत्यधिक अलग HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं में व्यक्त किया जा करने के लिए जब उनके HLA-1 सकारात्मक समकक्ष की तुलना में पाया गया (चित्र 1C). Sox-9, एक विकासात्मक जीन अन्य कैंसर स्टेम कोशिकाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की सूचना दी, जैसे स्तन कार्सिनोमा में, विशेष रूप से HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं में व्यक्त किए गए (चित्र 1D).

अलग HLA-1-नकारात्मक subpopulation को मान्य करने के लिए, एक sarcosphere गठन परख कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण क्षमता की जांच करने के लिए किया गया था. एचएलए-1-ऋणात्मक कोशिकाएं 10 कोशिकाओं के प्रारंभिक निवेश के साथ गोले बनाने में सक्षम थीं (चित्र 1ई)12. ट्यूमर बनाने की क्षमता की जांच करने के लिए, एक सीरियल-डिल्यूशन ट्यूमर-निर्माण परख किया गया था। एचएलए-1-नकारात्मक और -सकारात्मक कोशिकाओं की एक ही संख्या एक ही माउस के प्रत्येक पार्श्व में subcutaneously इंजेक्शन थे. एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं ने काफी अधिक ट्यूमर निर्माण क्षमता दिखाई (चित्र 1 एफ)12, जबकि एचएलए-1-नकारात्मक और सकारात्मक उपजनसंख्या दोनों द्वारा बनाई गई एक्सोग्रैफ्ट्स सेलुलर विषमतापूर्ण ट्यूमर थे (चित्र 1 एच) ।

हमने पृथक एचएलए-1-नकारात्मक TICs12का जीन व्यंजक विश्लेषण किया। सामान्य मेसेन्काइमल कोशिका विभेद से जुड़े जीनों को टिसीएस12में ऊंचा किया गया . इस प्रकार, हम भी परीक्षण किया है कि क्या HLA-1 TICs टर्मिनल भेदभाव करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और एक कम ट्यूमर गठन की क्षमता में परिणाम. परिणामों से पता चला है कि HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं दोनों lipogenic और ऑस्टियोजेनिक रास्ते के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और मजबूत तेल लाल ओ और Alizarin लाल एस धुंधला दिखाने के लिए (चित्र 1 जी). इसके विपरीत, HLA-1-सकारात्मक कोशिकाओं को एक ही परिस्थितियों में अंतर नहीं है. इस प्रकार, इन परिणामों को एक आशाजनक विभेदित चिकित्सा रणनीति है कि सार्कोमा TICs लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संकेत मिलता है.

Figure 1
चित्रा 1: एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं का अंत:ट्यूमरीय विषम सार्कोमा पीडीएक्स से अलगाव। (ए) एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं (एरो) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा मानव सार्कोमा के विभिन्न उपप्रकारों में पाई गई थीं। (क और ख) साफ सेल सार्कोमा. (ग और घ) प्लीमोमॉर्फिक लिपोसरकोमा। (ई और च) लेयोमियोसरकोमा। (जी और ज) घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर. (मैं और जम्मू) Liposarcoma, अन्यथा निर्दिष्ट नहीं. (के और एल) विभेदित लिपोसरकोमा। स्केल बार - 100 डिग्री मीटर (बी) सार्कोमा PDXs histologically माता पिता के ट्यूमर के समान थे (hematoxylin और eosin [एच एंड ई] दाग) और IHC द्वारा HLA-1 अभिव्यक्ति में सेलुलर विषमता से पता चला. यहाँ एक स्पष्ट सेल सार्कोमा (सीसीएस), एक अलग-अलग कोन्ड्रोसार्कोमा (डीसीएस), और एक अलग liposarcoma (DDL) सहित सार्कोमा PDXs के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार - 100 डिग्री मी. () एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं की उपजनसंख्या को द्वि-वर्ग विधि के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अलग किया गया था। ऊपर से नीचे तक: पहला सॉर्ट, दूसरा सॉर्ट, और शुद्धता की जांच। अलग HLA-1-नकारात्मक और HLA-1-सकारात्मक कोशिकाओं एक बाद कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन थे, एक ट्यूमर गठन परख सहित. इस आंकड़े के परिणाम पिछले प्रकाशन12से हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कार्यात्मक परख द्वारा HLA-1-नकारात्मक TICs की विशेषता. (क) एक गोले के निर्माण परख से पता चला कि लगभग 10 एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं सार्कोमा गोलों को बनाने में सक्षम थीं। बाएँ: सार्कोमा क्षेत्रों के प्रतिनिधि चित्र. सही: क्षेत्र बनाने आवृत्ति; मतलब - एसडी स्केल बार $ 100 डिग्री मी. (बी) एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं को सार्कोमा पीडीएक्स से अलग अत्यधिक ट्यूमरीजनिक थे। यहाँ दिखाया HLA-1-नकारात्मक और DDL से सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा गठित ट्यूमर के प्रतिनिधि तस्वीरें हैं. एचएलए-1-नकारात्मक और एचएलए-1-सकारात्मक डीएल कोशिकाओं के एक हजार कोशिकाओं को एक ही माउस के अलग-अलग पार्श्वों में इंजेक्ट किया गया था। (ग) एचएलए-1-सकारात्मक कोशिकाओं की तुलना में एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं में स्टेम सेल जीनों के एम आर ए स्तर अक्टूबर4, नानोगऔर माइक को उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था। ये आंकड़े इस बात का प्रतिनिधित्व करते हैं कि एसडी ( र् 5)। (घ) तेल लाल ओ और अलीजारिन रेड एस का मजबूत सकारात्मक दाग लिपोजेनिक और ऑस्टियोजेनिक पथों के साथ एक टर्मिनल विभेद दर्शाता है जो सार्कोमा टिक्स से प्रेरित होते हैं। () एचएलए-1 एचएलए-1-सकारात्मक (बाएं) और -नकारात्मक (दाएं) उप-जनसंख्या द्वारा निर्मित पीडीएक्स का इम्यूनोस्टेनिंग। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. इस आंकड़े के परिणाम पिछले प्रकाशन12से हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

मानव सार्कोमा से ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को अलग करने और उनकी विशेषता के लिए इस प्रोटोकॉल की सफलता को सीमित करने वाले कई महत्वपूर्ण कदम हैं। मानव सार्कोमा में कई अलग-अलग उपप्रकार शामिल हैं। हमने देखा कि पीडीएक्स का गठन सार्कोमा उपप्रकारों पर अत्यधिक निर्भर है। नैदानिक आक्रामक सार्कोमा एक हिस्टोलॉजिकल रूप से अलग-अलग फीनोटाइप के साथ (जैसे, प्लेमॉर्फिक अपृथक्करणीय सार्कोमा [सफलता दर 100%, n ] 2], अलग-अलग liposarcomas [सफलता दर 100%, n ] 2], और synovial सार्कोमा ] सफलता दर 100%, n [ 3]) PDX गठन की एक उच्च सफलता दर है. इस बीच, विभेदित phenotypes के साथ सार्कोमा (जैसे, अच्छी तरह से अलग liposarcomas [सफलता दर 0%, n ] 3]) कम PDX गठन दर दिखा. यह संभव है कि ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाएं कम घातक, विभेदित उपप्रकारों की तुलना में अधिक प्रतिशत पर अधिक घातक उपप्रकारों में मौजूद हों। इसके अलावा, हम सेल व्यवहार्यता के किसी भी नुकसान को कम करने के लिए किसी भी रोक के बिना एक दिन के भीतर ट्यूमर शुरू सेल अलगाव प्रक्रिया खत्म करने की सलाह देते हैं।

हमने पहचान की है कि मानव सार्कोमा में एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं व्यापक रूप से मौजूद हैं। लेकिन HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत विभिन्न रोगियों से नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस विधि से, हमने सफलतापूर्वक ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को उन नमूनों से अलग कर दिया है जिनमें एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं हैं जो 0.5% से अधिक 30%12तक होती हैं। अलग HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं के ट्यूमर शुरू सेल पहचान की पुष्टि करने के लिए क्षेत्र गठन और ट्यूमर गठन assays द्वारा कार्यात्मक HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है।

हालांकि, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी सीमाएं हैं। पिछले डेटा से पता चला है कि HLA-1 अभिव्यक्ति epigeneticly विनियमित है, जो एक ही ट्यूमर12के भीतर HLA-1 अभिव्यक्ति के सेलुलर विषमता के अवलोकन के साथ संगत है. एचएलए-1 जीनोमिक उत्परिवर्तनों का पता सार्कोमा और अन्य कैंसर प्रकारों में पाया गया। HLA-1 जीन में उत्परिवर्तन पूरे ट्यूमर में सेल सतह पर HLA-1 का पूरा नुकसान करने के लिए या nonfunctional उत्परिवर्तित HLA-1 व्यक्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. किसी भी मामले में, एचएलए-1 नकारात्मकता का उपयोग ट्यूमर के भीतर टीआईसी की पहचान करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक मानव सार्कोमा subtypes की एक किस्म से TICs अलग है और कार्यात्मक विश्लेषण द्वारा हमारे परिणामों को मान्य. इस प्रकार, हम इन TICs को लक्षित विशिष्ट उपचार विकसित करने के लिए, TICs पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित आणविक अध्ययन करने में सक्षम थे.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध NCI-P01-CA087497 द्वारा समर्थित किया गया था (C.C.-C करने के लिए. और डी.एच.) और NIH-U 54-0OD020353 (C.C.-C., D.H., और J.D.-D.), एगिलेंट सोचा नेता पुरस्कार (सी.सी.-सी. को), और Martel फाउंडेशन (सी.सी.-सी. और जे.डी.-डी.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cell culture filter ThermoFisher 450-0020
100 mm Petri dish Falcon 353003
15 mL conical tube Falcon 352196
35 μm cell strainer Falcon 352340
50 mL polystyrene tube Falcon 352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate Corning 7007
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
B-27 Gibco 08-0085SA
bFGF Invitrogen PHG0021
dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EGF Invitrogen PHG0311
HLA-1-PE antibody Abcam ab43545
hMSC growth medium ATCC PCS-500-030
indomethacin Sigma-Aldrich I7378
isobutylmethylxanthine Sigma-Aldrich I5879
isopropanol Sigma-Aldrich W292907
Isotype Control Antibody Abcam ab103534
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
lithium chloride Sigma-Aldrich 62476
Matrigel basement membrane matrix Corning 354230
MEM Alpha Gibco 12571-063
N2 Gibco 17502-048
NSG mice The Jackson Lab 005557
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
PBS Corning 21-040-CM
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Syringe with needle BD 309626
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

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References

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अलगाव और सरकोमा रोगी व्युत्पन्न Xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता
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Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).More

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).

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