Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

doi: 10.3791/57011 Published: June 13, 2019

Summary

Vi beskriver en detaljert protokoll for isolering av tumor-initiere celler fra humant sarkom pasient-avledet xenotransplantater av fluorescens celle sortering, ved hjelp av humant leukocytter antigen-1 (HLA-1) som en negativ markør, og for ytterligere validering og karakterisering av disse HLA-1-negative tumor-initiere celler.

Abstract

Eksistensen og viktigheten av tumor-initiering celler (rykninger) har blitt støttet av økende bevis i løpet av det siste tiåret. Disse rykninger har vist å være ansvarlig for tumor initiering, metastasering, og resistens. Derfor er det viktig å utvikle spesifikk TIC-målretting terapi i tillegg til dagens kjemoterapi strategier, som hovedsakelig fokuserer på mesteparten av ikke-rykninger. For ytterligere å forstå mekanismen bak den menneskelige rykninger, beskriver vi en metode for å isolere og karakterisere rykninger i humant sarkomer. Heri, viser vi en detaljert protokoll for å generere pasient-avledet xenotransplantater (PDXs) av menneskelig sarkomer og å isolere rykninger av fluorescens celle sortering (FACS) ved hjelp av humant leukocytter antigen klasse I (HLA-1) som en negativ markør. Også beskriver vi hvordan du funksjonelt karakterisere disse rykninger, inkludert en sfære formasjon analysen og en svulst formasjon analysen, og å indusere differensiering langs mesenchymal trasé. Isolasjonen og karakterisering av PDX-rykninger gir ledetråder til oppdagelsen av potensielle målrettings reagenser for behandling. Videre tyder det på økende bevis på at denne protokollen kan bli ytterligere utvidet til å isolere og karakterisere rykninger fra andre typer av menneskelig kreft.

Introduction

Intratumoral Cellular heterogenitet av menneskelig kreft har blitt støttet av økende bevis i løpet av det siste tiåret1. I likhet med normalt vev består kreft vev av en liten pasientpopulasjonen av rykninger (også kalt kreft stamceller), som viser tumor-forming evne; i mellomtiden, hoveddelen av kreftceller viser differensiert fenotyper2. Disse rykninger viser stilk celle-lignende egenskaper, inkludert uttrykk for en stilk cellen markør og evnen til både selv-fornyelse og asymmetrisk celledeling, og dermed kan starte dannelsen av en mobilnettet heterogen tumor3. Nyere studier har avdekket at rykninger er ikke bare ansvarlig for tumor initiering, men er også forbundet med tumor aggressivitet4, metastasering5, og resistens6. Derfor er det viktig å forstå hvor biologisk det er, og dermed utvikle en spesifikk behandlings strategi rettet mot disse.

FACS-baserte metoder har blitt brukt til å identifisere rykninger ved hjelp av rykninger-markører, inkludert CD133, CD24 og CD441. De fleste av disse markørene er også uttrykt i normale stamceller7. Men ingen av disse markørene bare merke rykninger. Rollene disse molekylene spiller i den kreft av rykninger er fortsatt ikke klart. For eksempel kan CD133 ofte deaktiveres av DNA-metylering, og dermed kan denne intertumoral heterogenitet gjengi nøyaktigheten av disse markørene8. ALDH1 er en markør som også fungerer for å opprettholde stemness i den9. Det synes å være mer effektiv i å identifisere brystkreft, men er fortsatt tvilsom i andre tumor typer9. Noen signalering trasé spille viktige roller i stilk cellen biologi, inkludert wnt (vingeløse-relatert integrering nettsted), TGF-β (transformere vekstfaktor Beta), og Hedgehog1. Men det er vanskelig å bevise at disse banene er TIC-spesifikke og å bruke aktiviteten på disse veiene for å isolere rykninger fra primære svulster. Dermed er en pålitelig roman TIC markør presserende behov.

Human MHC klasse jeg, også kalt HLA-1, er en celle overflate protein uttrykt i nesten alle kjerne celler10. HLA-1 fungerer som et antigen presentere et molekyl som er spesielt anerkjent av CD8 T-celler10. Den cytotoksisk effekten av CD8 T-celler kan aktiveres når kreftceller presentere en svulst antigen av HLA-1. Derfor, mangler HLA-1 på celleoverflaten av kreftceller kan føre til en immun flukt fra cytotoksisk CD8 T-celler. Downregulation av HLA-1 har blitt beskrevet i ulike typer av menneskelig kreft og er korrelert med dårlig prognose, metastasering, og resistens11. Vi har vist at tapet av HLA-1-uttrykket på celleoverflaten kan brukes til å identifisere rykninger i sarkomer, så vel som i prostata kreft6,12.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere rykninger fra humant sarkom PDXs av FACS, ved hjelp av HLA-1 som en negativ markør, og for ytterligere å validere og karakterisere disse HLA-1-negative rykninger.

Protocol

Alle protokoller for mus eksperimenter diskutert her var i samsvar med institusjonelle retningslinjer og godkjent av Mount Sinai Medical Center institusjonelle Human Research etikk komité og Animal Care og use Committee.

1. behandling av sarkom Vevsprøve og PDX-formasjonen

  1. Under en institusjonell gjennomgang Board-godkjent protokoll, har patologi servicepersonell forberede sarkom prøver fra kirurgi prøver og umiddelbart sette hver prøve på isen i en 100 mm Petri parabolen.
  2. Plasser prøven i en 15 mL polystyren konisk rør med 6 mL kaldt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kultur medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin/Streptomycin. Behandle vevsprøven umiddelbart.
  3. Valgfritt For osteosarcoma bare, følg etter fulgte skritt, hvilke kan hoppet for bløt tissue sarkom.
    1. Skjær vevet i 20 mm3 stk ved hjelp av en skalpell. Overfør vevs bitene til et 15 mL rør som inneholder 3 mL kollagenase oppløsning (RPMI 1640 med 1 mg/mL kollagenase).
    2. Sett røret inn i et vannbad ved 37 ° c i 30 min.
    3. Grundig Vortex røret, og deretter legge til 3 mL RPMI 1640 supplert med 10% FBS å nøytralisere den kollagenase aktivitet.
    4. Sentrifuger for 5 min ved 350 x g ved romtemperatur. Fjern supernatanten.
  4. Arbeid i et sterilt biosafety kabinett, plasser vevsprøven i en 100 mm Petri-rett. Tilsett 500 μL av steril 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) i vevet. Med en steril skalpell, mekanisk triturate vevet i små biter til ingen synlige vevet stykke er større enn 0,1 mm.
  5. Overfør 500 μL celle suspensjon til en 35 μm celle sil og samle filtrert suspensjon med en 50 mL polystyren tube. Sett denne 50 mL polystyren rør med cellen suspensjon på isen.
  6. Legg til en annen 500 μL av PBS til vevet. Triturate for andre gang, overføre suspensjonen gjennom celle sil, og samle den inn i samme 50 mL tube.
  7. Gjenta disse trinnene (trinn 1.5 – 1,6) til vevs delen er helt dissosiert, vanligvis 6 ganger-8x.
  8. Pellet cellen suspensjon ved sentrifugering ved 350 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast supernatanten, resuspend pellet ved hjelp av 5 mL hemolyse buffer (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, og 0,1 mm EDTA), og ruge løsningen i 5 min ved romtemperatur for å fjerne røde blodlegemer.
  9. Sentrifuger for 5 min ved 350 x g ved romtemperatur og fjern hemolyse buffer. Vask pellet med 5 mL PBS. Sentrifuger igjen i 5 min ved 350 x g og fjern supernatanten.
  10. Resuspend pellet med 1 mL av PBS og telle levedyktig celle nummer ved hjelp av en hemocytometer eller annen alternativ metode. Fortynne cellene til en endelig konsentrasjon av 1 x 107 celler i 200 ΜL av PBS. La cellen suspensjon på isen.
  11. La kjelleren membran matrise på isen for å la den smelte. Tilsett 200 μL av matrise for kjeller membran til 200 μL celle fjæring. Bland forsiktig og hold på isen.
  12. Subkutant injeksjons celle oppheng: kjeller membran matrise (1:1) i to NOD scid gamma-mus (NSG) i deres flanken. Bruk 200 μL for hver injeksjon.
  13. Overvåk PDX-formasjonen ved å sjekke injeksjonsstedet til musene 2x i uken. Fjern tumor xenograft når den når 1 cm i diameter.

2. isolering av tumor-initiere celler ved FACS fra PDX

  1. Kirurgisk fjerning av PDX fra mus som beskrevet tidligere12.
  2. Skjær svulsten i to. Fix halvparten av xenograft med 4% paraformaldehyde over natten. Dette er for histologiske analyse. Behandle den andre halvdelen av vevet som beskrevet ovenfor (trinn 1.3 – 1.8) for å få en tumor celle suspensjon.
  3. Resuspend pellet med PBS og telle levedyktig celle nummer.
  4. Fortynne celle suspensjonen i PBS supplert med 5% FBS til en konsentrasjon av 2 x 106 celler/ml. La cellen suspensjon på isen i 30 min. del celle fjæringen over to rør. Merk rørene med henholdsvis isotop kontroll og antistoff. Legg merke til antall celler i hvert rør.
  5. Klargjør 2x HLA-1-PE antistoff ved å fortynne antistoff med PBS supplert med 5% FBS (1:250). Fortynne det negative isotype kontroll antistoff med samme tilstand. Bland cellen suspensjon fra "antistoff" tube med fortynnet antistoff (1:1) for å gjøre den endelige antistoff fortynning 1:500. Bland celle fjæringen fra "isotop Control" rør med isotop kontroll (1:1). Sett cellen suspensjoner på isen for 90 min.
  6. Sentrifuger for 5 min ved 350 x g ved 4 ° c og fjern supernatanten. Tilsett 10 mL PBS for å vaske pellet 2x.
  7. Tilsett 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til PBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Legg til denne DAPI-løsningen i celle pellet for å lage en celle suspensjon av 107 celler/ml (ved hjelp av celle tallene fra trinn 2,4).
  8. Filter celle suspensjonen gjennom 35 μm sil caps i 12 mm x 75 mm polystyren rør.
  9. Bruk en Flow flowcytometer å sortere HLA-1-negative TIC pasientpopulasjonen6. Gate levedyktige celler (DAPI-negative) og samle både HLA-1-negative og-positive subpopulasjoner i 2 15 mL samling rør, som hver inneholder 4 mL RPMI 1640 kultur medium.

3. karakterisering av tumor-initiere celler

  1. Sarcosphere formasjon
    1. Lag sarcosphere vekstmedium, ved hjelp av Alpha-MEM cellekultur medium. Legg til kosttilskudd for å lage en endelig konsentrasjon av B-27 kosttilskudd (1x), N2-tillegg (1x), grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) (20 ng/mL) og epidermal vekstfaktor (EGF) (20 ng/mL) og penicillin/Streptomycin (100 IU/ml). Filtrer mediet med et 0,2 μm cellekultur filter før bruk.
    2. Pellet den sorterte HLA-1-negative og-positive pasientpopulasjonen fra trinn 2,9 og telle cellenumrene til hver pasientpopulasjonen.
    3. Fortynne 1,5 x 106 celler i 15 ml av sarcosphere vekstmedium for å gjøre cellen fortynning av 1 x 105 celler/ml.
    4. Serielt fortynne cellene med fersk sarcosphere vekstmedium for å gjøre 15 mL av hver celle fortynning av 104, 103, og 102 celler/ml. Deretter forberede 4 96-vel ultra-lav feste cellekultur plater, hver for en celle fortynning.
    5. Overføring 100 μL av celle fjæring fra de 105 celler/ml fortynning til hver brønn av den første 96-brønn ultra-lav feste cellekultur plate. Denne platen har 104 celler i hver brønn.
    6. Bruk de andre 3 96-brønn ultra-lav feste cellekultur platene for de andre tre celle fortynninger: 104, 103, og 102 celler/ml. Overføring 100 μL av celle fjæring til hver brønn av 96-brønn ultra-lav feste cellekultur plater. Disse tre kultur platene har 1 000 celler/brønn, 100 celler/brønn, og 10 celler/brønn, henholdsvis.
    7. Sett platene inn i en 37 ° c, 5% CO2 Cell kultur inkubator.
    8. Legg til nye bFGF og EGF direkte til cellen kultur medium (siste konsentrasjon på 20 ng/mL) hver tredje dag uten å endre medium for å unngå celler tapt i suspensjonen kultur.
    9. Ved hjelp av et lett mikroskop, overvåke sarcosphere formasjon hver dag i tre uker, som vist i figur 2a.
    10. Etter tre uker, telle antall sarcosphere-positive brønner og sarcosphere-negative brønner av hver celle fortynning for både HLA-1-negativ og HLA-1-positive celler.
    11. Beregn Sphere-forming celle frekvens basert på en Poisson-sannsynlighetsfordeling13. Sammenlign HLA-1-negative rykninger med HLA-1-positive bulk celler.
  2. Seriell-fortynning tumor-formasjon analysen
    1. Tell HLA-1-negative og-positive subpopulasjoner fra trinn 2,9.
    2. Lag seriell fortynninger av cellene med PBS til konsentrasjoner på 106, 105, 104, og 103 celler/ml. Bruk 1 mL av hver fortynning til tumor dannelsen i 10 mus.
    3. Tilsett 1 mL kjeller membran matrise til 1 mL celle suspensjonen av hver fortynning (1:1). Hold 2 mL hver blanding på isen.
    4. Subkutan injeksjon 200 μL av cellen: kjeller membran matrise blandingen inn i flanken av NGS mus, ved hjelp av HLA-1-negative celler for en flanke og HLA-1-positive celler for den andre flanken av samme mus. Bruk 10 mus for hver fortynning. Bruk 25G sprøyter med en nål for injeksjoner.
    5. Overvåke tumor dannelse i musene i fire til åtte uker, avhengig av frekvensen av tumor vekst.
    6. Beregn tumor-initiering celle frekvens av prosentandelen av tumor formasjon på ulike input celle tall. Sammenlign HLA-1-negative rykninger med HLA-1-positive bulk celler.
  3. Indusert differensiering langs mesenchymal trasé
    1. Bruk sarcospheres som dannes under de forrige trinnene (trinn 3.1.9). Overfør sarcospheres til en ny 6-brønn plate. Kultur sarcosphere med 2,5 mL Alpha-MEM supplert med 10% FBS å la cellene feste til kulturen plateoverflaten.
    2. Etter et vedlegg i to dager, bytte kulturen medium fra Alpha-MEM supplert med 10% FBS til 1:1 blanding av Alpha-MEM supplert med 10% FBS og menneskelig mesenchymal stilk cellen (hMSC) vekstmedium.
    3. Etter to dager, bytte til fullføre hMSC vekstmedium.
    4. Når cellene nå 90% confluency, aspirer hMSC medium og legge differensiering medium. For osteogen differensiering, tilsett osteogen differensiering medium (hMSC vekstmedium supplert med 10 nM deksametason, 5 mM β-glycerophosphate, 50 μg/mL L-askorbinsyre, og 10 mM litium klorid). For lipogenic differensiering, Legg adipocyte differensiering medium (hMSC vekstmedium supplert med 0,5 μM deksametason, 0,5 μM isobutylmethylxanthine, og 50 μM indometacin).
    5. Endre differensiering medium hver tredje dag.
    6. Etter tre til fire uker, stoppe differensiering og vaske cellene med PBS. Deretter aspirer PBS og tilsett 2 mL 10% formalin til cellene for fiksering. La cellene sitte i 45 minutter ved romtemperatur. Vask dem med deionisert vann. Cellene er nå klar for Alizarin rød S farging (trinn 3.3.6.1) eller olje rød O farging (trinn 3.3.6.2).
      1. For å oppdage osteogen differensiering, Utfør Alizarin rød S farging. Aspirer vann og tilsett 2 mL Alizarin rød S arbeids løsning (2% Alizarin rød S, pH 6,0) til cellene, og la dem sitte i 5 min for farging. Vask cellene med deionisert vann og observere reaksjons mikroskopisk.
      2. For å oppdage adipogenic differensiering, Utfør olje rød O farging.
        1. Lag en olje rød O-løsning. Forbered en lagerløsning ved å legge til 300 mg olje rød O pulver til 100 mL isopropanol.
        2. Innen 2 timer før bruk, bland tre deler (30 mL) av olje rød O lagerløsning med to deler (20 mL) deionisert vann. La blandingen sitte i 10 min ved romtemperatur.
        3. Filtrer arbeids løsningen ved hjelp av før bruk.
        4. Fjern vannet fra cellene utarbeidet i henhold til trinn 3.3.6. Tilsett 2 mL 60% isopropanol for å dekke celle monolag og cellene sitter i 2 min.
        5. Fjern isopropanol og tilsett 2 mL olje rød O arbeids løsning. Tillat cellene å sitte i 5 min ved romtemperatur.
        6. Skyll cellene med deionisert vann og Observer reaksjonen under et lett mikroskop.

Representative Results

En menneskelig sarkom PDX ble generert og beiset. Intratumoral heterogenitet ble vist ved immunhistokjemi ved hjelp av HLA-1 antistoff. Xenograft besto av to distinkte subpopulasjoner, nemlig HLA-1 positive og negative (figur 1a)12. Den sarkom PDX viste histologiske likheter med foreldrenes primære tumor (figur 1a). Sarkom PDX-rykninger ble isolert av FACS. Ved hjelp av en dobbel sorteringsmetode var HLA-1-negative celler svært beriket fra foreldrenes celle befolkning (figur 1B)12.

Gener uttrykt i stamceller (f. eks, Oct4, Nanog, og myC) ble funnet å være svært uttrykt i isolerte HLA-1-negative celler i forhold til deres HLA-1-positive motstykke (figur 1C). Sox-9, en utviklingsmessige genet rapporteres å spille viktige roller i andre kreft stamceller, slik som i brystkreft, ble spesielt uttrykt i HLA-1-negative celler (figur 1d).

For å validere isolert HLA-1-negative pasientpopulasjonen, en sarcosphere formasjon analysen ble utført for å undersøke selv-fornyelse evne av cellene. HLA-1-negative celler var i stand til å danne kuler med en innledende inngang på så lite som 10 celler (figur 1e)12. For å undersøke tumor-forming evne, en seriell-fortynning tumor-formasjon analysen ble utført. Det samme antall HLA-1-negative og-positive celler ble injisert subkutant i hver flanke av samme mus. HLA-1-negative celler viste en signifikant høyere tumor formasjon evne (figur 1F)12, mens XENOTRANSPLANTATER dannet av både HLA-1-negative og-positive subpopulasjoner var mobilnettet heterogene svulster (figur 1h).

Vi utførte et genuttrykk analyse av isolert HLA-1-negative rykninger12. Gener assosiert med normal mesenchymal celle differensiering ble forhøyet i rykninger12. Derfor har vi også testet om HLA-1 rykninger kan indusert til Terminal differensiering og resultere i en redusert tumor formasjon evne. Resultatene viste at HLA-1-negative celler kan bli indusert å skille langs både lipogenic og osteogen trasé og vise sterke olje rød O og Alizarin rød S farging (figur 1g). I kontrast, HLA-1-positive celler skiller ikke under de samme forholdene. Dermed indikerer disse resultatene en lovende differensiert behandlings strategi som kan brukes til å målrette sarkom-rykninger.

Figure 1
Figur 1: isolering av HLA-1-negative celler fra intratumoral heterogene sarkom PDXs. (A) HLA-1-negative celler (piler) ble funnet i ulike under typer av menneskelig sarkomer av IMMUNHISTOKJEMI (IHC). (a og b) Tøm celle sarkom. (c og d) Pleomorphic liposarkom. (e og f) Leiomyosarcoma. (g og h) Ondartet perifere nerve skjede svulst. (i og j) Liposarkom, ikke annet er angitt. (k og l) Dedifferentiated liposarkom. Scale bar = 100 μm. (B) sarkom PDXs var histologisk lik foreldrenes svulst (hematoksylin og Eosin [H & E] flekken) og viste cellulære HETEROGENITET i HLA-1 uttrykk med IHC. Her vises representative bilder av sarkom PDXs, inkludert en klar celle sarkom (CCS), en dedifferentiated chondrosarcoma (DCS), og en dedifferentiated liposarkom (DDL). Scale bar = 100 μm. (C) PASIENTPOPULASJONEN av HLA-1-negative celler ble isolert av Flow flowcytometri med en dobbel-sortering metode. Fra øverst til nederst: første sortering, andre sortering og renhet sjekk. Isolert HLA-1-negativ og HLA-1-positive celler ble utsatt for en påfølgende funksjonell analyse, inkludert en svulst formasjon analysen. Resultatene fra dette tallet er fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av HLA-1-negative rykninger ved funksjonell analyser. (A) en sfære formasjon analysen viste at så få som 10 HLA-1-negative celler var i stand til å danne sarkom kuler. Venstre: representative bilder av sarkom kuler. Høyre: sfære-forming frekvens; gjennomsnittlig ± SD. Scale bar = 100 μm. (B) HLA-1-negative celler isolert fra sarkom PDX var svært tumorigene. Her vises er representative bilder av svulsten dannet av HLA-1-negative og-positive celler fra DDL. En tusen celler av HLA-1-negativ og HLA-1-positive DDL-celler ble injisert i separate flanken av samme mus. (C) mRNA nivåer av Stamcelle gener Oct4, Nanog, og myC ble uttrykt på høyere nivåer i HLA-1-negative celler sammenlignet med HLA-1-positive celler. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD (n = 5). (D) sterk positiv farging av olje Red O og Alizarin Red S viser en Terminal differensiering langs lipogenic og osteogen trasé som er indusert fra sarkom rykninger. (E) HLA-1 Immunostaining av PDXs DANNET av HLA-1-positive (venstre) og-negative (høyre) subpopulasjoner. Scale bar = 100 μm. Resultatene fra dette tallet er fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Det er flere viktige trinn som begrenser suksessen til denne protokollen til å isolere og karakterisere tumor-initiere celler fra menneskelige sarkom PDXs. Human sarkom inkluderer mange forskjellige under typer. Vi observerte at PDX-formasjonen er svært avhengig av sarkom under typer. Klinisk aggressiv sarkomer med en histologisk udifferensierte fenotype (f. eks, pleomorphic udifferensierte sarkomer [suksess rate 100%, n = 2], dedifferentiated Liposarcomas [suksess rate 100%, n = 2], og synovial sarkomer [ suksessraten 100%, n = 3]) har en høy suksess rate på PDX-formasjonen. I mellomtiden, sarkomer med differensiert fenotyper (f. eks, godt differensiert Liposarcomas [suksess rate 0%, n = 3]) viser lavere PDX formasjon priser. Det er mulig at celler med tumor Start finnes i flere ondartede under typer på en høyere prosentandel enn i mindre ondartede, differensiert under typer. I tillegg anbefaler vi å fullføre tumor-initiere celle isolasjon prosedyre i løpet av en dag uten stopp for å minimere tap av celle levedyktighet.

Vi har identifisert at HLA-1-negative celler finnes mye i menneskelig sarkomer. Men andelen av HLA-1-negative celler kan variere mellom prøver fra forskjellige pasienter. Ved denne metoden har vi med hell isolert tumor-initiere celler fra prøver som har HLA-1-negative celler som spenner fra mindre enn 0,5% til mer enn 30%12. Det er viktig å karakterisere HLA-1-negative celler funksjonelt ved sfære dannelse og tumor formasjon analyser for å bekrefte tumor-initiering celle identitet av isolerte HLA-1-negative celler.

Imidlertid har protokollen som presenteres her også begrensninger. Tidligere data viste at HLA-1 uttrykk er epigenetically regulert, som er forenlig med observasjon av HLA-1 uttrykket mobilnettet heterogenitet innenfor samme tumor12. HLA-1 genomisk mutasjoner ble påvist i sarkomer og andre krefttyper. Mutasjoner i HLA-1 gener kan føre til fullstendig tap av HLA-1 på celleoverflaten i hele svulsten eller å uttrykke fungerende mutert HLA-1. I begge tilfeller kan HLA-1 negativitet ikke brukes til å identifisere rykninger i svulsten.

Ved hjelp av HLA-1 som en negativ markør, har vi lykkes isolert rykninger fra en rekke menneskelige sarkom under typer og validert våre resultater ved funksjonell analyse. Dermed var vi i stand til å utføre molekylære studier inkludert genuttrykk analyse på rykninger, for å utvikle spesifikk behandling rettet mot disse rykninger.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av NCI-p01-CA087497 (til C.C.-C. og D.H.) og NIH-U 54-0OD020353 (til C.C.-C., D.H. og JD-D.), Agilent trodde Leader Award (til C.C.-C.), og Martel Foundation (til C.C.-C. og JD-D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cell culture filter ThermoFisher 450-0020
100 mm Petri dish Falcon 353003
15 mL conical tube Falcon 352196
35 μm cell strainer Falcon 352340
50 mL polystyrene tube Falcon 352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate Corning 7007
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
B-27 Gibco 08-0085SA
bFGF Invitrogen PHG0021
dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EGF Invitrogen PHG0311
HLA-1-PE antibody Abcam ab43545
hMSC growth medium ATCC PCS-500-030
indomethacin Sigma-Aldrich I7378
isobutylmethylxanthine Sigma-Aldrich I5879
isopropanol Sigma-Aldrich W292907
Isotype Control Antibody Abcam ab103534
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
lithium chloride Sigma-Aldrich 62476
Matrigel basement membrane matrix Corning 354230
MEM Alpha Gibco 12571-063
N2 Gibco 17502-048
NSG mice The Jackson Lab 005557
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
PBS Corning 21-040-CM
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Syringe with needle BD 309626
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15, (4), 338-344 (2013).
  2. Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355, (12), 1253-1261 (2006).
  3. Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood? Cell Stem Cell. 4, (3), 203-205 (2009).
  4. Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65, (8), 3025-3029 (2005).
  5. Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69, (4), 1302-1313 (2009).
  6. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, (3), 373-388 (2012).
  7. Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, (6859), 105-111 (2001).
  8. Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68, (19), 8094-8103 (2008).
  9. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1, (5), 555-567 (2007).
  10. Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14, (10), 491-499 (1993).
  11. Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
  12. Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
  13. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).
Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).More

Han, D., Rodriguez-Bravo, V., Izadmehr, S., Domingo-Domenech, J., Cordon-Cardo, C. Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts. J. Vis. Exp. (148), e57011, doi:10.3791/57011 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter