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Cancer Research

एक अंडाकार आकृति में चिकित्सा परीक्षण-सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के लिए 3 डी सेल संस्कृति मॉडल आधारित

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57012
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 3, 1, 1, 1, 3, 1,3
1Department of Otorhinolaryngology, Johannes-Gutenberg University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology, Technical University of Munich Medical Center, 3Department of Otorhinolaryngology, Ludwig-Maximilian-University Medical Center, 4Department of Otorhinolaryngology, University of Goettingen Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

हम एक अंडाकार आकृति के विकास का वर्णन आधारित, तीन आयामी इन विट्रो मॉडल है कि हमें सेल लाइनों पर सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के लिए प्रयोगात्मक चिकित्सा परहेजों के मौजूदा मानक परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है, चिकित्सा के मूल्यांकन में लक्ष्य भविष्य में मानव नमूनों से प्राथमिक कोशिकाओं पर संवेदनशीलता और प्रतिरोध ।

Abstract

उन्नत और आवर्तक सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) के लिए वर्तमान उपचार के विकल्प विकिरण और chemo-विकिरण दृष्टिकोण के साथ या सर्जरी के बिना संलग्न । जबकि प्लेटिनम आधारित कीमोथेरेपी परहेजों वर्तमान में प्रभावकारिता के मामले में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते है और मामलों के विशाल बहुमत में दिए गए हैं, नई कीमोथेरेपी परहेजों, अर्थात् immunotherapy उभर रहे हैं । हालांकि, प्रतिक्रिया दरों और चिकित्सा प्रतिरोध तंत्र या तो chemo आहार के लिए भविष्यवाणी करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे है और अपर्याप्त समझ में रहते हैं । chemo और विकिरण प्रतिरोध तंत्र के व्यापक रूपांतरों तिथि करने के लिए जाना जाता है । इस अध्ययन में एक मानकीकृत, उच्च- विट्रो में प्रवाह के विकास का वर्णन करने के लिए विभिंन चिकित्सा परहेजों को HNSCC सेल लाइन की प्रतिक्रिया का आकलन है, और उंमीद है व्यक्तिगत ट्यूमर के लिए एक भविष्य के उपकरण के रूप में व्यक्ति के रोगियों से प्राथमिक कोशिकाओं पर चिकित्सा. परख हमारे तृतीयक देखभाल केंद्र में HNSCC रोगियों के लिए गुणवत्ता नियंत्रित मानक एल्गोरिथ्म में एकीकृत किया जा रहा करने के लिए बनाया गया है; हालांकि, यह भविष्य की पढ़ाई का विषय होगा । तकनीकी व्यवहार्यता वास्तविक रोगियों से ट्यूमर बायोप्सी से प्राथमिक कोशिकाओं के लिए होनहार लग रहा है । नमूने तो प्रयोगशाला में स्थानांतरित कर रहे हैं । बायोप्सी यांत्रिक एंजाइमी पाचन के बाद अलग कर रहे हैं । कोशिकाओं तो अल्ट्रा कम आसंजन सेल संस्कृति शीशियों कि reproducible, तीन आयामी, अंडाकार आकृति के आकार का सेल कंपनियों के मानकीकृत और सहज गठन को बढ़ावा देने में हो रहे हैं । Spheroids तो chemo-विकिरण प्रोटोकॉल और immunotherapy प्रोटोकॉल की जरूरत के रूप में उजागर होने के लिए तैयार हैं । अंतिम कोशिका व्यवहार्यता और अंडाकार आकृति आकार चिकित्सा संवेदनशीलता के संकेतक है और इसलिए भविष्य में विचार में तैयार किया जा सकता है रोगियों की संभावना चिकित्सा प्रतिक्रिया का आकलन । इस मॉडल को सिर और गर्दन के कैंसर के लिए निजीकृत चिकित्सा की दिशा में एक मूल्यवान, लागत कुशल उपकरण हो सकता है ।

Introduction

सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) श्लैष्मिक मानव papillomavirus (एचपीवी) संक्रमण से जुड़े रोगजनन, अत्यधिक निकोटीन और शराब की वजह से मामलों के बहुमत के बगल में एक बढ़ती घटनाओं के साथ दुनिया भर में छठे सबसे आम कैंसर है उपभोग 1,2. जबकि छोटे ट्यूमर और पूर्व इनवेसिव चरणों आमतौर पर शल्य चिकित्सा उत्पाद के साथ अच्छी तरह से इलाज कर रहे हैं, आमतौर पर गर्भाशय ग्रीवा लिम्फ नोड विच्छेदन के साथ संयुक्त, उन्नत चरण और आवर्तक HNSCC के लिए उपचार के साथ आक्रामक ट्यूमर आक्रमण के कारण चुनौतीपूर्ण रहता है मेटास्टेटिक प्रसार और विकिरण और कीमोथेरेपी के लिए प्रतिरोध प्रोटोकॉल3,4,5,6,7,8। हाल के अध्ययनों सेलुलर phenotype की एक उच्च परिवर्तनशीलता का सुझाव देते हैं, और परिसंचारी और प्रसार ट्यूमर कोशिकाओं के उप लक्षण वर्णन सिर्फ9,10शुरू कर दिया है । एक ठोस, समान ट्यूमर मास के पहले विश्वास पिछले वर्षों में हाल के अध्ययनों के प्रकाश में संशोधित किया जाना था11,12,13,14। ट्यूमर लक्षण वर्णन और कुंजी उत्परिवर्तनों की पहचान के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कई जीन है कि चिकित्सा प्रतिरोध के साथ जुड़े प्रतीत होते हैं, लेकिन एक लागत गहन दृष्टिकोण रहने की पहचान सकता है । इसके अलावा, जीनोटाइप का ज्ञान जरूरी phenotype और उसके इलाज की प्रतिक्रिया के एक विश्वसनीय भविष्यवाणी की अनुमति नहीं है ।

उन्नत चरण और आवर्तक रोग के लिए समग्र और रोग मुक्त अस्तित्व में सुधार लाने में कुछ प्रगति हुई है । निकोटीन के लिए-के रूप में अच्छी तरह से वायरस से जुड़े कार्सिनोमा, सर्जरी के अलावा वर्तमान उपचार के विकल्प आक्रामक विकिरण और प्लेटिनम आधारित कीमोथेरेपी परहेजों संलग्न हैं । वहां एचपीवी के बीच अलग प्रतिक्रिया दरों के लिए निहितार्थ नकारात्मक और सकारात्मक कार्सिनोमा गया है; हालांकि, यह अभी तक सामान्य चिकित्सा दिशानिर्देशों में कोई परिवर्तन करने के लिए लीड नहीं है । विकिरण और कीमोथेरेपी के प्रति प्रतिरोध सभी ट्यूमर चरणों में एक व्यापक घटना है और प्लेटिनम आधारित रसायन चिकित्सा के लिए मौजूद है और साथ ही लक्षित थेरेपी के लिए (विरोधी EGFR; एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर) और हाल ही में उभरते चौकी निषेध15। अप्रभावी विकिरण और कीमोथेरेपी dysphagia के मामले में महत्वपूर्ण रोगी रुग्णता की एक उच्च लागत पर आते हैं, mucositis, शुष्क मुँह और दूसरों के बीच गुर्दे या हृदय समारोह की कमी के जोखिम. चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी प्रत्येक व्यक्ति रोगी के लिए एक सामांय चिकित्सा अवधारणा के निर्णय से पहले महत्वपूर्ण लक्ष्य है, अनावश्यक उपचार अवधारणाओं, दुष्प्रभावों और लागत को रोकने लगता है ।

हम मौजूदा मानक chemo-विकिरण है कि नियमित रूप से और गुणवत्ता नियंत्रित oncologic उपचार एल्गोरिथ्म में एक तकनीकी खड़े बिंदु से एकीकृत किया जा सकता है की ओर व्यक्तिगत रोगी के उपचार संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल स्थापित करने की मांग की । दूर लक्ष्य भारी बदल और वृद्ध सेल लाइनों का उपयोग कर के बिना मॉडल का उपयोग किया गया था, क्योंकि वे खराब उनकी परिवर्तनशीलता और विविधता के बिना वास्तविक मानव ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व के रूप में हम अब जानते हैं, जबकि प्रोटोकॉल की स्थापना के विभिंन सेल लाइनों में किया गया था । केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों से स्वतंत्र होने के लिए, हम हाल ही में सफलतापूर्वक अपनी सतह और सीमित मार्ग पर संरक्षित सेलुलर मार्करों के साथ मानव ट्यूमर नमूनों से प्राथमिक HNSCC कोशिकाओं से "PiCa" नामक एक मध्यवर्ती सेल लाइन उत्पन्न 16. इस PiCa सेल लाइन सड़क पर मॉडल के विकास के लिए एक तैयारी के रूप में फिर बाद में ट्यूमर बायोप्सी से ताजा मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ परीक्षण के बाद सेवा करनी चाहिए । यह दिखाया गया है कि तीन आयामी कोशिका संस्कृतियों में कोशिकाओं को अलग ढंग से और अधिक vivo में-monolayers17,18,19,20 में बढ़ रही उन लोगों की तुलना में कैंसर दवाओं के प्रशासन के लिए की तरह प्रतिक्रिया ,21, मुख्य रूप से प्रवासी और कुछ सेल सबसेट के उप-विभेदक गुणों के संरक्षण के कारण22,23,24। यहां, हम एक अंडाकार आकृति के प्रोटोकॉल का वर्णन आधारित, तीन मध्यवर्ती सेल लाइनों और प्राथमिक मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं और तरीके कैसे सिर और गर्दन सर्जन और ऑन्कोलॉजिस्ट के कैंसर के इलाज में इस तरह के एक मॉडल को एकीकृत से आयामी मॉडल ( चित्र 1) ।

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Protocol

सभी अध्ययनों से इस पांडुलिपि में दिखाया गया है, अर्थात् मानव ट्यूमर नमूनों का उपयोग, के तहत संरक्षित कर रहे है और मैन्ज़ के विश्वविद्यालय चिकित्सा से पूर्व फैसलों के साथ सहमति में/म्यूनिख मेडिकल सेंटर एथिक्स कमेटी के विश्वविद्यालय/ मरीजों को उनके उपचार के पाठ्यक्रम में प्राप्त किया गया था कि अतिरिक्त जैविक सामग्री के वैज्ञानिक उपयोग करने के लिए सहमत राष्ट्रीय कानूनी दिशा निर्देशों के अनुसार सूचित सहमति दे दी है । मानव कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुपालन में अनुसंधान किया गया है ।

1. सिर और बिल्ली स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा से एक ट्यूमर बायोप्सी लेने

  1. सामान्य (propofol और/या sevoflurane, मांसपेशी आराम एजेंट) या स्थानीय घुसपैठ (2% ultracaine, एड्रेनालाईन)/surface (क्शयलोकाने) ऑपरेटिंग कमरे या ओटोलर्यनोलोजी परीक्षा कुर्सी में संज्ञाहरण प्रदर्शन करते हैं । मौखिक गुहा/ग्रसनी/गला/मानक ऑपरेटिंग उपकरणों के साथ ऊपरी पाचन और श्वसन तंत्र के अन्य भागों में ट्यूमर मास कल्पना और, अगर जरूरत है, माइक्रोस्कोप के तहत.
  2. कुंद या काटने के उपकरणों के साथ कैंसर के घावों की परिधि से एक ताजा ट्यूमर बायोप्सी ले लो । इस क्षेत्र में प्रचुर मात्रा में परिगलन के कारण घावों के केंद्र से बचें । isotonic सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ एक बाँझ कंटेनर के लिए प्राप्त ऊतक रखो ।
  3. बायोप्सी के बाद, के रूप में रक्तस्तम्भन प्रदर्शन की जरूरत है, उदा, vasoconstrictive पदार्थों के उपयोग के अलावा एक द्विध्रुवी या monopolar जमावट उपकरण के साथ ।
  4. आसन्न प्रयोगशाला पथ के लिए सीधे सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा ट्यूमर बायोप्सी लाओ । सामान्य रूप से कैंसर से बाहर शासन करने के लिए पैथोलॉजिस्ट के लिए अन्य ट्यूमर बायोप्सी भेजें.
  5. सुनिश्चित करें कि एक प्रयोगशाला तकनीशियन नमूना प्रक्रिया के लिए तैयार है सीधे ।

2. ट्यूमर नमूना प्रसंस्करण

  1. एक उपयुक्त और बाँझ सतह पर ट्यूमर नमूना प्लेस और एक बाँझ एकल उपयोग स्केलपेल के साथ अच्छी तरह से कटौती के रूप में संभव टुकड़े के रूप में कम.
    सावधानी: सुनिश्चित करें कि संक्रामक और रक्त जनित रोगों की स्थिति अच्छी तरह से प्रलेखित है और तकनीशियन संस्थानों मानक प्रोटोकॉल का ध्यान में सुई छड़ी को रोकने के लिए या संभावित जोखिम रोगी सामग्री के साथ चोट काटने और प्रोटोकॉल संभव चोट के बाद पालन करने के लिए ।
  2. प्राथमिक ऊतक के पर्याप्त यांत्रिक जुदाई के बाद, एक Collagenase मैं/द्वितीय और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन युक्त शीशी में ऊतक डाल दिया । एक ७० µm बाज़ सेल छलनी के माध्यम से छलनी और हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ निलंबन धो लो ।
  3. सफल जुदाई और बाद में धोने के बाद, एक T75 सेल संस्कृति कुप्पी (७५ cm2) में 1-2 × 106 कोशिकाओं से युक्त निलंबन जगह 5% CO2 और ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान पर उप-प्रवाह को विकसित करने के लिए । इस चरण में 10 दिन तक का समय लग सकता है ।
    1. निंनलिखित से मिलकर विशेष keratinocyte संस्कृति माध्यम का प्रयोग करें: १२५ Dulbecco के संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) के एमएल, keratinocyte पूरित मध्यम के २५० मिलीलीटर (पूरित मध्यम keratinocyte एस एफ मध्यम के ५०० एमएल, 15 गोजातीय पिट्यूटरी के मिलीग्राम से मिलकर extract (BPE), २.५ मिलीलीटर की पेनिसिलिन/streptomycin, १५० एनजी रिकॉमबिनेंट मानव उपकला विकास फैक्टर (EGF), ३०० mM CaCl2के ५१६ µ l, शेयर मिश्रण अग्रिम में तैयार किया जा करने के लिए), F12 पोषक तत्व मिश्रण की १२५ मिलीलीटर, 10 मिलीग्राम की BPE (०.७५ एमएल), ७५ एनजी रिकॉमबिनेंट मानव EGF (2 µ एल) , ३.७५ मिलीलीटर की २०० मिमी एल-Alanyl-एल-Glutamin-Dipeptide (सामग्री की तालिका) ।

3. अल्ट्रा कम आसंजन सेल संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं सीडिंग

  1. एक खुर्दबीन के नीचे ट्यूमर सेल विकास की पुष्टि करें । संस्कृति में कोशिकाओं की गणना (प्राथमिक या कोशिका संस्कृति) और बीज ५,००० प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं या मध्यवर्ती सेल लाइन के 1000-2000 कोशिकाओं/मीडिया के 200-300 µ l में अन्य सेल लाइन (चरण ३.२.) एक अल्ट्रा में गुफा के साथ कम आसंजन प्लेट, गोल नीचे से (९६-well) ।
  2. संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह में कोशिकाओं और बराबर भागों में DMEM और airway उपकला कोशिका मध्यम (BEGM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1% सोडियम पाइरूवेट, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% L-glutamine (चरण २.३.). यदि सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा रहा है, DMEM के आधार पर मीडिया पर्याप्त है ।
    1. हर दूसरे दिन मीडिया परिवर्तन निष्पादित करें । ध्यान दें मीडिया में परिवर्तन के दौरान पिपेट के साथ अंडाकार आकृति महाप्राण नहीं है । संस्कृति spheroids जब तक ३.३ में descibed के रूप में वृद्धि का स्तर (लगभग 7-10 दिन) तक पहुंच गया है ।
  3. तीन आयामी, अंडाकार आकृति के आकार का सेल कंपनियों के लिए देख कर माइक्रोस्कोप के तहत सहज अंडाकार आकृति गठन की पुष्टि करें । आगे की जांच से अनियमित और/या एकाधिक अंडाकार आकृति गठन के साथ कुओं को छोड़ दें ।
    नोट: Spheroids नग्न आंखों के साथ दिखाई जानी चाहिए, भी, आगे प्रसंस्करण और नीचे वर्णित के रूप में मीडिया परिवर्तन की सुविधा ।

4. Multimodal मानक या प्रयोगात्मक ट्यूमर थेरेपी के लिए Spheroids को उजागर

  1. एक वांछित चिकित्सा आहार चुनें । डिजाइन पर्याप्त बड़े नियंत्रण समूह है कि उपचार की तुलना अनुपचारित spheroids या spheroids केवल आंशिक चिकित्सा परहेजों प्राप्त करने की अनुमति, उदा अकेले विकिरण । नियंत्रण समूहों का आकार प्रायोगिक समूह के डिजाइन पर निर्भर करता है और सार्वभौमिक रूप से परिभाषित नहीं किया जा सकता ।
  2. मीडिया additives के साथ मीडिया के लिए विनिमय, वांछित सांद्रता पर chemotherapeutics और/या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ मीडिया का अर्थ । 2.5/5/10 µ m या 5-fluoruracil (5FU) की सांद्रता पर सिस्प्लैटिन को 30 µ m में जोड़ें ।
    नोट: उच्च प्रवाह प्रयोगों या बड़े समूह के आकार के लिए/बड़ी संख्या में समूहों, एक एक स्वचालित pipetting रोबोट का उपयोग कर सकते है के रूप में हम आगे प्रयोगों में स्थापित कर रहे हैं ।
  3. वैकल्पिक रूप से, एक उपयुक्त विकिरण सुविधा का उपयोग कर 2 Gy पर spheroids के साथ सेल संस्कृति प्लेटें radiating ।
    चेतावनी: संस्थान के कर्मचारियों के हानिकारक विकिरण जोखिम की रोकथाम के बारे में प्रोटोकॉल का सम्मान करें । विकिरण सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार नामित और प्रशिक्षित तकनीशियनों के साथ ही कार्य करें. यदि वांछित, ४.२ के तहत वर्णित के रूप में chemotherapeutics जोड़ें । बाद.
  4. पहले वर्णित संस्कृति की स्थिति में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन (३७ ° c, ३.२ कदम) ।
  5. मशीन के बाद, मीडिया परिवर्तन हर दूसरे दिन के साथ कम से 6 दिनों के लिए सेल संस्कृति जारी है ।

5. परख पढ़ने के लिए अंडाकार आकृति आकार और सेलुलर प्रसार की सीमा का आकलन बाहर

  1. एक ग्राफिक सॉफ्टवेयर (पैरामीटर 1) के साथ दिन 6 (दिवस 10, दिन 16) पर डिजिटल फोटो प्रलेखन के बाद क्षेत्र के संदर्भ में अंडाकार आकृति आकार को मापने ।
  2. ५२० थाली के २.५ मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक के बाद, supernatant निकालें । 1x पंजाबियों की पर्याप्त मात्रा के साथ कोशिकाओं को धो और प्लेट फिर से केंद्रापसारक के रूप में वर्णित है, supernatant (पंजाब) को हटाने के बाद ।
  3. जोड़ें १०० µ एल के एंजाइमी सेल टुकड़ी समाधान के लिए प्रत्येक शीशी को भंग करने की अनुमति spheroids । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए थाली मशीन ।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत अंडाकार आकृति के सफल भंग के लिए जांच करें । DMEM के १०० µ l को जोड़ें । २.५ मिनट के लिए ५२० x g में प्लेट केंद्रापसारक. supernatant निकालें और DMEM के १०० µ l में कोशिकाओं को निलंबित ।
  5. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्णमिति प्रसार परख, उदाहरण में WST-8 प्रत्येक शीशी पर परख निर्माता के निर्देश के अनुसार25प्रदर्शन । एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) रीडर में परख बाहर पढ़ें (2 पैरामीटर) ।

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Representative Results

हम reproducibly एक सेल सस्पेंशन से spheroids उत्पंन करने में सक्षम थे, स्वामित्व PiCa सेल लाइन सहित विभिंन सेल लाइनों से पहले, बाद में प्राथमिक मानव कैंसर ताजा ट्यूमर बायोप्सी से व्युत्पंन के रूप में Hagemann एट अल में वर्णित कोशिकाओं से . 26. हम अंडाकार आकृति पीढ़ी के लिए दो स्थापित तरीकों का मूल्यांकन किया; दो तथाकथित हैंगिंग ड्रॉप (एचडी) विधि और अल्ट्रा कम आसंजन (उला) विधि जा रहा है, बाद और अधिक प्रभावी और सुरक्षित एक जा रहा है । हम HD की तुलना में उला विधि के लाभों को उजागर करने में सक्षम थे, तेजी से अंडाकार आकृति वृद्धि सहित, प्लेट हैंडलिंग के साथ कम मुद्दों, भारी कंपन के साथ spheroids के फलस्वरूप नुकसान, और एकरूपता के मामले में अधिक reproducible अंडाकार आकृति वृद्धि ( चित्रा 2) । कई spheroids प्रति शीशी की घटना HD विधि में अधिक आम था । हम अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान के एक और अधिक विशिष्ट लक्षण वर्णन के लिए जांच की । चित्रा 3 Ki67, PiCa कोशिकाओं से एक अंडाकार आकृति के एक प्रसार मार्कर, के लिए एक immunochemistry दाग से पता चलता है. साहित्य में वर्णित के रूप में, spheroids एक proliferating बाहरी परत के साथ एक कम proliferating कोर से मिलकर बनता है, मानव में ठोस HNSCC के प्रसार के विभिंन क्षेत्रों नकल उतार । इन विट्रो में vivo मेंके रूप में, यह माना जाता है पोषक तत्वों और कोशिका संस्कृति ट्यूमर के केंद्र के लिए परिधि से कमी के कारण मीडिया द्वारा आपूर्ति की ऑक्सीजन की ढाल के कारण होता है ।

हम तो दिखाने की कोशिश की है कि परख कीमोथेरेपी दवाओं या विकिरण के लिए जोखिम के साथ मशीन के बाद अंडाकार आकृति आकार में बदलाव का पता लगाने में सक्षम है, यहां HNSCC के लिए दो सामांय मानक उपचार परहेजों का प्रतिनिधित्व । इससे पहले कि संभवतः एक पूर्व उपचार दिनचर्या, परख की संवेदनशीलता के सत्यापन में परख एकीकृत एक शर्त होगी । दो मापदंडों परख के अंत अंक के रूप में उपलब्ध थे: अंडाकार आकृति आकार (क्षेत्र, ५.१ कदम से पैरामीटर 1.) और प्रसार (५.४ कदम से पैरामीटर 2 देखें.), सेल व्यवहार्यता और चिकित्सा के बाद विकास की क्षमता के लिए एक किराए मार्कर जा रहा है । सामान्य कीमोथेरेपी और chemo-विकिरण प्रोटोकॉल के साथ उपचार अध्ययन के परिणाम चित्रा 4में दिखाए जाते हैं । सिस्प्लैटिन या 5FU के साथ spheroids का एक्सपोज़र और मशीन समय के साथ एक अनुपचारित नियंत्रण समूह (p< 0.001) की तुलना में विकास की गति में उल्लेखनीय कमी का नेतृत्व करता है । 2Gy के साथ विकिरण एक महत्वपूर्ण तरीके से विकास की गति को कम करने में सक्षम था (पी< 0.01) । अस्तित्व परख (WST-8) के लिए एक अतिरिक्त, chemo के महत्वपूर्ण मूल्य का पता लगाने में सक्षम था-विकिरण अकेले विकिरण की तुलना में सिस्प्लैटिन के साथ (पी = ०.०१७), अंडाकार आकृति आकार के आकलन में एक पहले से पता चला अंतर । यह एक पूरे के रूप में परख के लिए अपने महत्व को रेखांकित, छोटे परिवर्तन थेरेपी प्रतिक्रिया के लिए अपनी संवेदनशीलता बढ़ाने ।

Figure 1
चित्रा 1: भविष्य व्यक्तिगत चिकित्सा के रास्ते पर एक मॉडल की अवधारणा । श्लैष्मिक एचपीवी संक्रमण और/या तंबाकू और शराब दुरुपयोग के इतिहास की पृष्ठभूमि के साथ रोगियों को सिर और गर्दन के कैंसर के संदिग्ध निदान के लिए हमारे तृतीयक रेफरल देखभाल केंद्र के लिए मौजूद । संदिग्ध श्लैष्मिक क्षेत्रों या macroscopic ट्यूमर जनता के बायोप्सी निदान सुरक्षित करने के लिए संज्ञाहरण के तहत लिया जाता है । इसके अतिरिक्त, हम ट्यूमर बायोप्सी लेने के लिए तीन आयामी प्रयोगशाला में अंडाकार आकृति के आकार का सेल संस्कृतियों पैदा करते हैं । प्राथमिक के पर्याप्त वृद्धि-सेल आधारित spheroids पर, हम उंहें वर्तमान मानक या प्रयोगात्मक उपचार के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण परहेजों को बेनकाब । आनुवंशिक या आणविक रूपांतरों के आगे विश्लेषण चिकित्सा परिणामों के विश्लेषण के बाद जोड़ा जा सकता है । इन विट्रो में चिकित्सा परिणाम रोगी के लिए चिकित्सा अवधारणाओं की योजना बनाने की प्रक्रिया के लिए विचार में तैयार किया जा सकता है । यह आंकड़ा Hagemann, जे एट अल से पुनर्मुद्रित है. 26, लेखकों और जर्नल द्वारा दी गई अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सभी कक्ष रेखाएं विश्वसनीय spheroids उत्पंन कर सकती हैं; पठन-आउट के आकार और समय में अंतर चित्र 1 के अनुसार हैं. प्रारंभिक प्रयोगों में, प्राथमिक कोशिकाओं HD लेकिन उला प्लेटों (नीचे बाएँ) में reproducible spheroids फार्म नहीं था. प्राथमिक कोशिकाओं से अंडाकार आकृति वृद्धि विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए आगे की पढ़ाई शुरू की जानी है । सही पर कोशिकाओं की संख्या एक अंडाकार आकृति बनाने के लिए शीशी में डाल कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या है । यह आंकड़ा Hagemann, जे एट अल से पुनर्मुद्रित है. 26, लेखकों और जर्नल द्वारा दी गई अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Ki67 immunochemistry एक अंडाकार आकृति स्लाइस (PiCa) के दाग । संस्कृति की परिधि केंद्रीय कोशिकाओं की तुलना में बहुत अधिक प्रसार दर से पता चलता है, ठोस श्लैष्मिक ट्यूमर में पोषक तत्व वितरण नकल उतार कि अक्सर गल कोर दिखा । यह आंकड़ा Hagemann, जे एट अल से पुनर्मुद्रित है. 26, लेखकों और जर्नल द्वारा दी गई अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: थेरेपी अध्ययन । (क) PiCa कोशिकाओं उला प्लेटों में spheroids (n = 12 प्रति समूह) उत्पन्न करने के लिए खेती की गई थी. कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में या तो पंजाब के साथ प्रोटोकॉल के अनुसार उत्तेजित हो गए थे, सिस्प्लैटिन पर 5 µ m या 5FU पर 30 µ m. spheroids के आकार दिन 6, 10 और 16 मानक प्रोटोकॉल के अनुसार निर्धारित किए गए थे । सिस्प्लैटिन और 5FU उपचार आकार में एक महत्वपूर्ण कमी करने के लिए नेतृत्व (पी-मूल्यों खंड में बाएं तल पर दिया जाता है (ख) (a) (n = 12) के रूप में समान प्रयोगात्मक डिजाइन, लेकिन 2Gy के अतिरिक्त विकिरण के साथ । (ग) प्लाट अधिकतम करने के लिए मिनट से पता चलता है । के अनुसार p-(C) में दिए गए मानों, 2Gy के साथ पिछले विकिरण नियंत्रण समूह में अंडाकार आकृति आकार में एक महत्वपूर्ण कमी के लिए नेतृत्व किया, विकिरण चिकित्सा की नकल और PiCa कोशिकाओं के विकिरण संवेदनशीलता दिखा । सिस्प्लैटिन उपचार के साथ संयोजन में विकिरण अंडाकार आकृति (p > 0.05) के आकार में एक और महत्वपूर्ण कमी करने के लिए नेतृत्व नहीं था । प्लॉट अधिकतम करने के लिए मिनट दिखाता है। (ग) परिकलित p-मानों से 2-way ANOVA विश्लेषण से प्रयोगों ए और बी. (डी) WST8 परख planimetric (क्षेत्र) spheroids के विश्लेषण के लिए एक विकल्प के रूप में 16 दिन पर प्रदर्शन किया । WST8 विश्लेषण chemo के बाद जीवित कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण कमी का पता लगाने में सक्षम थे विकिरण (2Gy विकिरण और सिस्प्लैटिन) अकेले सिस्प्लैटिन (p = ०.०१७) की तुलना में, इसलिए दोनों planimetric विश्लेषण और WST8 के संयोजन का लाभ दिखा परख के समय वर्णमिति परख कर पढ़ा-लिखा । प्लाट अधिकतम करने के लिए मिनट से पता चलता है । यह आंकड़ा Hagemann, जे एट अल से पुनर्मुद्रित है. 26, लेखकों और जर्नल द्वारा दी गई अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम सेल सस्पेंशन से reproducible spheroids उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने में सक्षम थे, दोनों सेल लाइनों के लिए और, प्रारंभिक प्रयोगों में, प्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं. हम पहले दो पहले वर्णित तरीकों का आकलन किया और उला-विधि की पहचान की, एक तरीका है जहां अल्ट्रा कम आसंजन के साथ संस्कृति प्लेटें इस्तेमाल कर रहे हैं, के लिए सुरक्षित और अधिक एक समान तीन आयामी spheroids की पीढ़ी के लिए विश्वसनीय हो । परख पढ़ने के लिए दो अलग तरीकों के संयोजन से बाहर (आकार/क्षेत्र और सेल व्यवहार्यता), इस multimodal परख पर्याप्त समूहों के बीच छोटे मतभेदों की पहचान के प्रति संवेदनशील है । यह हमारे तृतीयक देखभाल केंद्र में नैदानिक मार्ग में परख के बाद एकीकरण के लिए तकनीकी व्यवहार्यता के सबूत की दिशा में पहला कदम है । भविष्य में, यह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (मैं) आम पहले या दूसरी/third-line चिकित्सा प्रोटोकॉल (chemo-reagents, विकिरण) और प्रयोगात्मक चिकित्सा प्रोटोकॉल के लिए व्यक्तिगत ट्यूमर संवेदनशीलता का आकलन, (ii) आगे ताजा नमूनों से ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषता और चिकित्सा प्रतिक्रिया के लिए आणविक सतह या cytoplasmic पैटर्न सहसंबंधी बनाना । विभिंन ट्यूमर स्थानीयकरण, जैसे, प्राथमिक और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस से आ रही नमूनों से Spheroids, कल्पना कर रहे हैं ।

प्रोटोकॉल और विधि की स्थापना के दौरान, हम अलग ज्ञात सेल लाइनों, कुछ दशकों के लिए अच्छी तरह से स्थापित किया जा रहा था । सेल लाइनों की मात्र उंर उनके संबंध और वर्तमान वास्तविक मानव ट्यूमर कोशिकाओं को तुलना के संदेह को जंम देती है, माना जाता है कि कई गुण और पहचान आणविक मार्करों खो दिया है । इन विट्रो प्रयोगों से परिणाम मानव में या vivo परीक्षण27में पुन: पेश करने के लिए मुश्किल थे । इसलिए हम एक सेल लाइन पर ध्यान केंद्रित हाल ही में हमारी सुविधा है कि अच्छी तरह से16विशेषता है में मानव प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पंन । इस सेल लाइन PiCa के साथ, हम एक बड़े पैमाने पर उपचार प्रयोगों का संचालन करने में सक्षम थे और वर्तमान चिकित्सा अपेक्षाओं की पुष्टि की । इस सिद्धांत का समर्थन करता है कि PiCa कोशिकाओं वास्तविक मानव ट्यूमर दूसरे से बेहतर व्यवहार को प्रतिबिंबित, और अधिक वृद्ध और पारित सेल लाइनों है कि कई मार्ग गुजरा । वे कोशिकाएं जो गैर-शारीरिक चयन के कारण लंबी अवधि के इन विट्रो शर्तों से गुजर सकती हैं, chemo-विकिरण संवेदनशीलता को पक्षपाती कर सकती हैं । हाल के प्रयोगों में, हम में प्राथमिक कोशिकाओं के साथ व्यवहार्यता की पुष्टि के लिए विश्वसनीय अंडाकार आकृति गठन का संबंध है; हालांकि, आगे और बड़े प्रयोगों के लिए नैदानिक दिनचर्या में परख को लागू करने में सक्षम होने से पहले प्रदर्शन किया जाना है ।

यह माना जाता है कि spheroids और तीन आयामी सामांय में कोशिका संस्कृति अलग तरह से प्रतिक्रिया पारंपरिक 2d की तुलना में जब कीमोथेरेपी दवाओं या विकिरण के संपर्क में 28संस्कृति । spheroids की वास्तुकला के लिए बाहरी सतह से कोर करने के लिए ऑक्सीजन और पोषण वितरण का एक ढाल की ओर जाता है, और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि तीन आयामी सेल क्लस्टर के विभिंन भागों के लिए भी दवा वितरण वर्दी नहीं है29। इसके अलावा, अंडाकार आकृति संस्कृति में कोशिकाओं को कुछ जीन अभिव्यक्ति पैटर्न है कि पशु मॉडल 30 में दवा प्रतिरोध के साथ जुड़े रहे है संरक्षित करने लगते हैं । हम सुझाव है कि भी तथाकथित विकिरण प्रतिरोध, एक विशेषता है कि कई रोगियों में सिर और गर्दन के कैंसर से जोड़ा गया है, सेल सेल संपर्क और विशिष्ट microenvironments ऑक्सीजन की आपूर्ति और चयापचय गतिविधि में बदलाव के लिए अग्रणी का परिणाम है । इस घटना के कारण spheroids में एक वृद्धि हुई vivo कार्यशीलता में नकल उतारा जा सकता है । अंत में, प्राथमिक कोशिकाओं और spheroids की पीढ़ी का उपयोग हमें के रूप में कई के रूप में संभव विशेषताओं के रूप में संरक्षित करने के लिए अनुमति सकता है vivo ट्यूमर विकास में एक लागत कुशल परख के साथ संयोजन के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा प्रतिक्रिया का अध्ययन.

वहां निश्चित रूप से दृष्टिकोण के लिए सीमाएं हैं । तारीख करने के लिए, यह अज्ञात है कैसे अलग अलग व्यक्ति के रोगियों से कोशिकाओं परख में प्रदर्शन करने के लिए ट्यूमर के इलाज से अवगत कराया जा रहा है, और कैसे परख पूर्वानुमान बाद में चिकित्सा परिणाम के साथ संबंध के संदर्भ में है । अत्यधिक अध्ययन के लिए बस इन विट्रो में नैदानिक पाठ्यक्रम बनाम प्रदर्शन की तुलना करने के लिए आवश्यक हैं । अंय लोगों के अलावा, अर्थात् दो कारकों इस अनिश्चितता में योगदान: ट्यूमर विविधता और सह की कमी stromal और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संस्कृति । ट्यूमर विविधता एक पूरी तरह से समझ में नहीं आता घटना है और प्राथमिक के विभिन्न उप साइटों के बीच मौजूद है, साथ ही प्राथमिक और मेटास्टेटिक स्थानीयकरण12के बीच. हाल के अध्ययनों के बाद से, वहां एक तीसरी साइट है जहां बहुत अलग और विशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं मौजूद है और niches में प्रबल कर सकते हैं: रक्त और अस्थि मज्जा को परिसंचारी और प्रसार ट्यूमर कोशिकाओं को9,10घर में सक्षम हैं । कोशिका संस्कृति में stromal कोशिकाओं और टी कोशिकाओं (प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए एक प्रतिनिधि के रूप में) की तरह अन्य कोशिका प्रकार की कमी परख करने के लिए सीमित नहीं है, लेकिन ट्यूमर चिकित्सा संवेदनशीलता का अध्ययन इन विट्रो परख में सबसे की एक वैध नुकसान. हाल ही में दवा स्वीकृति और चल रहे अध्ययनों के प्रकाश में है कि टी सेल प्रतिक्रिया, दवा खोज के लिए भविष्य के प्रयोगों के विभिंन परख और तरीकों का एक संयोजन में आयोजित किया जाना चाहिए प्रभाव ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के म्यूनिख विश्वविद्यालय के अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (FöFoLe परियोजना-no.: 789-781).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) Biochrom, Berlin, Germany F 0425
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies, Paisley, UK 10500-064
penicillin/streptomycin Biochrom, Berlin, Germany A2212
sodium pyruvate Biochrom, Berlin, Germany L0473
non-essential amino acids Biochrom, Berlin, Germany K0293
L-Glutamine Biochrom, Berlin, Germany K0293
Liberase Roche Life Sciences, Basel, Switzerland 5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform InSphero, Schlieren, Switzerland PB-CS 06-001
GravityTRAP plate InSphero, Schlieren, Switzerland PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates Corning, Corning, NY, USA 4520
airway epithelial cell growth medium Promocell, Heidelberg, Germany C-21060
amphotericin B Biochrom, Berlin, Germany A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix Promocell, Heidelberg, Germany C39165
WST-8 test Promocell, Heidelberg, Germany PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL Invitrogen #17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg Invitrogen #37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg Invitrogen #37000015
DMEM High Glucose Invitrogen #21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin Invitrogen #15140-122
F12 Nutrient Mix Invitrogen #21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) Invitrogen #35050087
HBSS (Ca, Mg) Life Technologies #14025-092 (no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme Invitrogen #12604-013 (no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution) Innovative cell technologies Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer BD Biosciences, USA #352350

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