Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة

doi: 10.3791/57015 Published: January 19, 2018

Summary

والهدف من هذا البروتوكول إنشاء ثقافة الدماغ اليرقات السابقين فيفو المورفولوجية الأمثل لرصد إيقاعات الجزيئية الإيقاعية مع المدى الطويل fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. وتناقش أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات الدوائية.

Abstract

دائرة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية ينظم الإيقاعي النواتج السلوكية والفسيولوجية منسقة مع إشارات بيئية، مثل دورات اليوم/ليلة. ساعة جزيئية داخل كل تنظيم ضربات القلب العصبية يولد إيقاعات circadian في التعبير الجيني، التي تكمن وراء الإيقاعي وظائف الخلايا العصبية اللازمة لعمل الدائرة. التحقيق في خصائص التذبذب الجزيئية الفردية في مختلف أقسام فرعية لتنظيم ضربات القلب من الخلايا العصبية وتفاعلها مع الإشارات العصبية غلة فهم أفضل لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الدائرة. نقدم هنا، نهجاً الوقت الفاصل بين الفحص المجهري نيون لرصد البرتقالة الجزيئية في الخلايا العصبية على مدار الساعة لمثقف المورفولوجية اليرقات الدماغ. يسمح هذا الأسلوب تسجيل عدة أيام من إيقاعات الصحفيين الإيقاعية الفلورسنت وراثيا مرمزة في القرار خلية واحدة. يمكن أن يكون هذا الإعداد جنبا إلى جنب مع المعالجات الدوائية لتحليل استجابة في الوقت الحقيقي على مدار الساعة الجزيئية للمركبات المختلفة عن كثب. خارج إيقاعات circadian، يقدم هذا الأسلوب متعدد الأغراض في تركيبة مع التقنيات الجينية المورفولوجية القوية إمكانية دراسة العمليات العصبية أو الجزيئية المختلفة في أنسجة الدماغ حية.

Introduction

الساعات الإيقاعية تساعد الكائنات الحية على التكيف مع التغييرات البيئية الدورية الناتجة عن دوران الأرض ح 24. عادة وراء حلقات متداخلة ردود الفعل النسخي متعدية الآلية الجزيئية للساعات الإيقاعية نطاق الأنواع1. تتألف الدارة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية المحتوية على مدار الساعة الخلايا العصبية يدمج معلومات الوقت من اليوم تنقلها العظة البيئية، مثل الضوء/الظلام (دينار) ودورات درجة الحرارة، تنسق الإيقاعات من عدد كبير صحيفة الفسيولوجية و العمليات السلوكية2،3. تنسيق إيقاعات الجزيئية مع الخلايا العصبية المدخلات والمخرجات من الأهمية بمكان لتشغيل الدائرة الإيقاعية لكن يظل مفهوما جزئيا فقط.

في المورفولوجية، في صميم عقارب الساعة الجزيئية، ينشط هيتيروديمير ساعة/دورة (CLK/الفتوة) النسخ من الفترة (الواحد) و زمان (تيم). تشكل مجمعا في وتيم وإدخال النواة، حيث أنها تكبح النشاط الترانسكربتي CLK/الفتوة، ونتيجة لذلك النسخ الخاصة بهم. أنظمة بوستترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال يسبب التأخير بين النسخ CLK/الفتوة-التوسط والقمع من جانب في/تيم، ضمان توليد سيركا ذبذبات الجزيئية 24-ح1،،من34 . حوالي 150 من الخلايا العصبية التي تحتوي على النموذج الجزيئي الساعات هذه دائرة للتحكم في سلوك الكبار الإيقاعية الذباب5. كثير أبسط لم تعمل بكامل طاقتها الإيقاعية دارة تتكون من 3 مجموعات من الخلايا العصبية على مدار الساعة-5 البطني الجانبي الخلايا العصبية (اللازم؛ 4 PDF-الإيجابي اللازم وواحد سالب PDF لنف، انظر أدناه)، 1s العصبية الظهرية 2 (DN1s) و 2s العصبية الظهرية 2 (DN2s)-موجود في اليرقات الدماغ6،7.

الدائرة الإيقاعية اليرقات بسيط يوفر نموذجا ممتازا لدراسة التفاعلات بين الاتصالات بين الخلايا العصبية والبرتقالة الجزيئية. استخدام مراسلنا الفلورسنت المطورة حديثا في--TDT، الذي يحاكي المستويات كل البروتين وموقعها سوبسيلولار، وسعينا إلى وصف ديناميات الجزيئية البرتقالة في مجموعات مختلفة على مدار الساعة العصبية فرعية في الدائرة الإيقاعية اليرقات 8. وعلاوة على ذلك، مع العلم بالدور الرئيسي لمعامل تفريق الصباغ neuropeptide (PDF) التي تنتجها اللازم 4 في تنظيم إيقاعات circadian في ال10،الخلايا العصبية المستوى9،11، أردنا النظر المباشر أثر PDF على الساعات الجزيئية. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة لرصد الجينات الإيقاعية إيقاعات في الدماغ اليرقات explant على مدى عدة أيام من الوقت الفاصل بين الفحص المجهري [كنفوكل]. وكان أيضا تكييف البروتوكول لفحوصات الدوائية لاختبار تأثير PDF أو غيرها من المركبات على المستوى في--TDT. وهكذا، وتكييف يتألف من إتاحة ثقافة explant الدماغ لتطبيق المخدرات وزيادة دقة الزمانية والتصوير لمدة أقصر.

السابقين فيفو ثقافة العقول المورفولوجية لمراحل تنموية مختلفة قد حددت سابقا12،13،،من1415،16،17 ،18. بينما استخدمت هذه البروتوكولات لتصوير مختلف الظواهر البيولوجية، البعض منهم غير متوافقة مع التصوير في القرار خلية واحدة أو لا تدعم الثقافة لأكثر من عدة ساعات. تشمل أساليب بديلة لإجراء تصوير حية طويلة الأجل من الخلايا العصبية الإيقاعية في المورفولوجية تصوير الإضاءة الحيوية الجزيئية إيقاعات19،،من2021 وتصوير الأسفار مؤشر الكالسيوم مع الورقة الخفيفة الميكروسكوب22،23. على الرغم من أن التصوير بالإضاءة الحيوية يمكن تحقيق أعلى الأزمنة والفحص المجهري الورقة الخفيفة يمكن أن تكون قابلة للتكيف للتصوير في فيفو ، أنها تقتصر على القرار المكانية وتتطلب أنظمة المجهر المتخصصة.

لتلائم الطريقة الموصوفة هنا هو تصور إشارات مضيئة في ثقافة الجامعة الدماغ في القرار خلية واحدة على مدى عدة أيام. هذه طريقة سهلة ومرنة يمكن تكييفها وفقا للصورة مثقف الكبار يطير العقول والتجارب الدوائية لدراسة العديد من مشاكل مختلفة في بيولوجيا الأعصاب المورفولوجية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد حلول الأسهم تحت غطاء الثقافة

  1. إعداد 400 مل 1 × شنايدر المتوسطة النشطة (SAM) الأمثل السابقين فيفو ثقافة العقول اليرقات (تعديل من مرجع24،25) (الجدول 1). قاسمة لمل 5 وفلاش تجميد في النتروجين السائل (LN2)، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. إعداد 1 × تشريح المحلول الملحي (DSS) بتمييع 10 × الحل الأسهم (تعديل من مرجع26) (الجدول 2).
  3. الكوة الفيبرينوجين إلى 10 مغ ومخزن في 4 درجات مئوية لاستخدام واحد.
    تنبيه: وزن الفيبرينوجين تحت الاندفاق الصفحي، ارتداء القفازات، كما أنها ضارة.
  4. إعداد حل ثرومبين الأسهم في سام (1500 المعاهد الوطنية للصحة وحدة/mg) والكوة إلى 10 ميليلتر، فلاش تجميد في LN2 وتبقى في-80 درجة مئوية.
    تنبيه: ارتداء قفازات عند التعامل مع ثرومبين كما أنها ضارة.
  5. الكوة حل الأسهم من 100 × البنسلين والستربتوميسين. تبقى عند-20 درجة مئوية.
  6. قص الدوائر من غشاء تترافلوروايثيلين (PTFE) (انظر الجدول المواد) إلى الحجم الذي يناسب داخل طبق أسفل الزجاج. شطف لهم في 70% EtOH وثم يعقم dH2تعقيم سين والجاف تحت الاندفاق الصفحي مع الأشعة فوق البنفسجية. نضع في طبق بتري معقم. الاستخدام مرة واحدة.
    ملاحظة: PTFE هو غشاء مرن المليئة بالثغرات التي تسمح بتبادل الغازات ويمنع التبخر أثناء التسجيل طويلة الأجل المتوسط.

2-الوقت الفاصل بين الفحص المجهري الإعداد

ملاحظة: الإعداد التالي مجهر الماسح ضوئي مقلوب جنبا إلى جنب [كنفوكل] (انظر الجدول المواد) مزودة بماسح ضوئي رنانة (8,000 هرتز). ويشمل النظام كاشف مضاعف صور حساسة للغاية، مما يمنع الضيائية وفوتوبليتشينج جنبا إلى جنب مع الماسح الضوئي رنانة. يتم التحكم في درجة الحرارة والرطوبة داخل دائرة البيئة مجهر (انظر الجدول المواد) التي تغطي معظم المجهر.

  1. ضع دائرة رطوبة المرحلة الأعلى.
  2. قم بتشغيل وحدات تحكم درجة الحرارة والرطوبة حجته إلى الدائرة المجهر 25 درجة مئوية و 80% من الرطوبة.
  3. للقيام بتجارب في الظلام المستمر (دد)، تغطي الدائرة البيئية المجهر قماش غير شفاف (ما لم تكن الدائرة مجهر مصنوع من مادة غير شفافة).
  4. إذا كان استخدام الماء غمر وهدف، ضع "موزع الصغرى غمر المياه" على رأس الهدف وبرنامج بروتوكول مع برنامج "تحكم الهدف أوتويميرسيون" الاستغناء عن المياه بمعدل ثابت من خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
    ملاحظة: ينصح أهداف غمر المياه جنبا إلى جنب مع موزع المياه أو الجافة الهدف العدسة لتصوير حية طويلة الأجل، كنوع آخر من المتوسطة الغمر أن تجف.
  5. وضع حامل صحن بيتري على المسرح، داخل قاعة الرطوبة.
  6. إطلاق برنامج المجهر وحدد وضع الماسح الضوئي مدوية من مربع الحوار الأول. حدد 'موافق' لتهيئة المسرح عند مطالبتك بذلك. انتقل إلى علامة التبويب التكوين وتكوين الأجهزة للتبديل على خطوط الليزر ذات الصلة.
  7. الذهاب للحصول على علامة التبويب ولوحة س وص تحديد وضع ثنائية الاتجاه وتعيين معلمات اقتناء الصورة.
    ملاحظة: وصف التصوير الإعداد المعروضة هنا (الشكل 2و الشكل 3 و فيلم 1) هو الأمثل لمراقبة الإيقاعية التعبير للصحفيين الفلورسنت محددة. المعلمات التالية تم اختيارها لتتناسب مع مواصفات لدينا أفضل: 40 س الماء الغمر الهدف، 8 X الخط المتوسط مع 512 × 512 صورة القرار. لتصوير متعددة الألوان، صورة متسلسلة مطلوب شراء عند الطول الموجي الانبعاثات fluorophore واحدة والطول الموجي الإثارة لتداخل آخر (هنا، الأطوال الموجية للانبعاثات بروتين فلوري الصفراء (يفب) والطماطم الإثارة التداخل). اختيار طريقة متسلسلة "بين كومة" كما أنها أسرع ولا يكاد حركة الخلايا العصبية على مدار الساعة أثناء الحصول على كدسة Z. إعدادات الفحص المجهري ينبغي تكييفها لتناسب الهدف من كل تجربة.

3-الإعداد للدماغ اليرقات Explant الثقافة

ملاحظة: الإجراء بأكمله من تشريح لتضمين explants الدماغ يأخذ ~ 30 دقيقة.

  1. إعداد الكواشف تحت غطاء ثقافة.
    1. ذوبان الجليد قاسمة ثرومبين وتبقى في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة التضمين (الخطوة 3، 3). الاستخدام مرة واحدة.
    2. ذوبان الجليد بسرعة قاسمة سام عند 37 درجة مئوية والحفاظ على الجليد لاستخدام واحد.
    3. إضافة سام قاسمة 10 مغ من الفيبرينوجين إلى 10 ملغ/مل ونفض الغبار برفق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وخلال الخطوة التضمين (الخطوة 3، 3). الاستخدام مرة واحدة.
      ملاحظة: لا احتضان الفيبرينوجين الحل أكثر من ح 2 كما أنه يبدأ في بلمرة.
    4. ذوبان الجليد قاسمة للأسهم x 100 البنسلين والستربتوميسين. إعداد 2.5 مل سام يحتوي على 1 × البنسلين-ستربتوميسين (سام/المضادات الحيوية). الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: مخزن x 100 المتبقية الأسهم البنسلين والستربتوميسين عند 4 درجة مئوية تصل إلى شهر واحد.
    5. إعداد قاسمة 500 ميليلتر من سام المتبقية. الحفاظ على الجليد.
    6. لتصوير طويلة الأجل، تطبيق يعقم فراغ الشحوم إلى الجزء البلاستيك من أسفل الطبق أسفل الزجاج (الشكل 1A) وتعقيم تحت الاندفاق الصفحي مع الأشعة فوق البنفسجية.
  2. تشريح الجهاز العصبي المركزي والبطني العصب الحبل.
    1. تنظيف الملقط و 2 × أطباق تشريح الزجاج ثلاثة آبار مع 70% EtOH. من أجل 400 ميليلتر من مفاجآت صيف دبي إلى 4 آبار و 400 ميليلتر من سام في بئر واحدة. الحفاظ على الجليد.
    2. يستخرج يطير المتوسطة المحتوية على اليرقات واختيار غير تجول اليرقات الطور الثالث (L3) مع الملقط. شطف لهم تباعا في 2 آبار مليئة بمفاجآت صيف دبي. الاحتفاظ بها في البئر مليئة بمفاجآت صيف دبي الثالثة على الجليد أنيسثيتيزيس اليرقات.
      ملاحظة: L3 يدوم يومين تقريبا عند 25 درجة مئوية. لمراقبة الدماغ في الفترة الزمنية ذات الصلة فسيولوجيا اخترنا استخدام غير تجول اليرقات L3. بدء مجموعات فرعية أخرى من الخلايا العصبية على مدار الساعة، مثل لام-اللازم و DN3s، التي سيتم تشكيلها في التيه المرحلة L3 ولكنها ليست بالضرورة ركوب الدراجات بعد (البيانات لا تظهر). ولذلك، على الرغم من أنه من الممكن للصورة ركوب الدراجات على مدار الساعة من الخلايا العصبية في هذه المرحلة (البيانات لا تظهر)، من المهم لتمييز الخلايا العصبية الوظيفية الفعل اليرقات على مدار الساعة بعناية من البلدان النامية منها لتحليل البيانات. عدم التجول L3 تظهر حوالي 4 إلى 4.5 يوما بعد بيضة زرع عند 25 درجة مئوية. لاستخدام هذا البروتوكول لدراسة إيقاعات circadian، قم بمزامنة (انترين) اليرقات النامية في ح 12/12 ح LD دورات عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام قبل جمع اليرقات L3.
    3. تشريح أدمغة اليرقات مع الملقط غرامة في البئر مليئة بمفاجآت صيف دبي 4، الذي لم يستخدم الشطف اليرقات، باستخدام أسلوب من الداخل إلى الخارج27.
      1. بإيجاز، قص اليرقة في اثنين، ولطف قرصه هوكس الفم مع زوج من الملقط ونشمر من الداخل إلى الخارج في جدار الجسم استخدام زوج آخر من الملقط، وبالتالي تعريض الدماغ. مجاناً الدماغ بالاستغناء عن جميع القصبة الهوائية والأعصاب التي تعلق على بقية الجسم.
      2. نضح الدماغ في حوالي 3 ميليلتر من مفاجآت مع ماصة 20 ميليلتر (قبل شطفها بمفاجآت صيف دبي)، والاستغناء عن في بئر مملوءة سام. كرر هذا الإجراء للعقول يصل إلى 7.
        ملاحظة: ينبغي إجراء تشريح على سطح بارد للحفاظ على اليرقات تخديره والدماغ مبردة. على سبيل المثال، ضع طبق تشريح على كتلة تبريد متصل بمضخة توزيع المياه المبردة الجليد. S تحيط ~ 30 إجراء تشريح للمخ. من المهم الاحتفاظ بأقراص imaginal العين/باللوامس يعلق على العقول والحبل البطني العصب سليمة. تمزيق هذه الأجزاء سوف تلحق الضرر الدماغ ويقلل من جودة الثقافة. أيضا، تجنب تعريض الأدمغة في الهواء. قبل يسفط الدماغ الأولى، ماصة صعودا وهبوطاً مفاجآت صيف دبي التي تحتوي على أجزاء من اليرقات تشريح، كما أنه يمنع العقول من الالتصاق بالجدار من الحافة.
  3. تضمين explants الدماغ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وتركيب (~ 20 دقيقة).
    1. غمر تشريح دماغ في حل العامل الفيبرينوجين (الفيبرينوجين التركيز النهائي ~3.3 ملغ/مل، ميليلتر 10.5 كل الدماغ) على النحو التالي:
    2. نضح ميليلتر 3.5 سام/المضادات الحيوية (مع تلميح نفسها المستخدمة في المقطع 3.2.3). نضح تشريح دماغ من تشريح جيدا إلى نصيحة ماصة نفسه دون الاستغناء عن المتوسط سام/المضادات الحيوية في التلميح.
    3. الاستغناء عن الدماغ والمتوسطة على غطاء طبق بتري معقم. إضافة آخر ميليلتر 3.5 سام/المضادات الحيوية و 3.5 ميليلتر من الفيبرينوجين الحارة/سام 10 ملغ/مل الحل في القائمة التي تحتوي على الدماغ. مزيج الحل حول الدماغ بلطف بيبيتينج مع طرف ماصة 20 ميليلتر.
      ملاحظة: استخدام ماصة بدلاً من الملقط في هذه الخطوة تجنب التشديد على الدماغ.
    4. تأخذ 2 ميليلتر من الحل العامل الفيبرينوجين من الإسقاط وتنطبق على ساترة للطبق أسفل الزجاج على شكل دائرة صغيرة. إضافة 0.8 ميليلتر من ثرومبين وتخلط بسرعة كبيرة مع تلميح ماصة. يتم تحويلها إلى فيبرينوجين الفيبرينوجين ويبدأ بلمرة.
    5. يأخذ الدماغ الذي يجلس في الفيبرينوجين العامل (الخطوة 3.3.1) حل بين زوج من الملقط ووضعه في المصفوفة بمجرد مصفوفة فيبرينوجين بيضاء مرئية. توجيه على الجانب الأمامي من الدماغ إلى أسفل (لتصوير الخلايا العصبية على مدار الساعة). دفع به إلى أسفل أقرب ما يمكن إلى الزجاج غطاء. وتتألف من طبقات من فيبرينوجين فيبرينوجين جلطة. اختر طبقة واحدة وإضعاف أعلى الدماغ مع الحركات الصغيرة ولطيف دون فصل المصفوفة.
      1. كرر 2 إلى 3 مرات من أجزاء مختلفة من جلطة لتحقيق الاستقرار في المخ.
        ملاحظة: عند التعامل مع الدماغ بالملقط، كن حذراً لا الجافة أو تفرض عليه من إجهاد البدني.
    6. إضافة 20 ميليلتر سام/المضادات الحيوية على رأس الدماغ المضمنة لوقف عمل ثرومبين.
    7. كرر الإجراء لجبل على العقول الباقية. فمن الممكن لتضمين تصل إلى 5 إلى 6 العقول على طبق أسفل زجاج.
    8. لتصوير حية طويلة الأجل، إضافة 600 ميليلتر سام/المضادات الحيوية في البئر الداخلية (الجزء الزجاج). ضع غشاء PTFE قبل قطع فوق المتوسط والتمسك بها للشحوم الفراغ المطبق على الجزء البلاستيك من الأسفل (3.1.5) (الشكل 1A).
    9. لفحوصات الدوائية، ملء الطبق مع 2 مل من سام/المضادات الحيوية (الشكل 1B).
      ملاحظة: مهم جداً لتجنب تبخر المتوسط، كما osmolality المتوسط أمر حاسم لبقاء الخلايا العصبية. ولذلك، من الضروري لتجارب التصوير الطويلة الأجل، ختم الطبق الثقافة مع غشاء PTFE. بينما لإجراء التجارب على المدى القصير، ختم غشاء غير مطلوب طالما الطبق مليئة 2 مل متوسطة ورصدها في دائرة هوميديفيد.

4-الحصول على الصور الوقت الفاصل بين

  1. ضع الطبق أسفل الزجاج على حامل صحن بيتري داخل قاعة الرطوبة المرحلة الأعلى.
  2. انتقل إلى لوحة z-المكدس في علامة التبويب الحصول على وتعيين الخطوات z-مقطع من برنامج مجهر (2 ميكرومتر × ~ 40 في هذه التجارب هو مبين في الشكل 2 و الشكل 3، و فيلم 1). تعيين بداية z-مكدس في الطائرة الأبعد عن ساترة والنهاية في سطح explant الدماغ، قريبة ساترة. على الرغم من حركات الدماغ لا يعتد بها، وإضافة المقاطع z إضافية في بداية ونهاية z-المكدس.
  3. انتقل إلى علامة & العثور على الحصول على الصور متعددة موقف الفريق والتشكيل. مع هدف X 40، يمكن التقاط 1 الدماغ الكرة داخل مجال الرؤية
  4. الذهاب للحصول على وضع الفريق وتحديد إكسيزت (z-مكدس مرور الزمن). انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين معلمات الفاصل الزمني وتواتر الوقت المفضل.
    ملاحظة: الحصول على الوقت الفاصل بين الصور مع التردد المطلوب. ملاحظة أن تصوير حية طويلة الأجل (ح 24-72) مع وقت انقضاء فترة أقصر من ح 2 يميل إلى النتائج في الخلايا العصبية ركوب أقل، ربما لأنه يقلل من الجدوى من الخلايا العصبية. توسع حجم البيانات كمعدل الزيادات اقتناء الصورة، مما يجعل تحليل البيانات وتخزين أكثر تحديا.

5-المعالجة من Explants الدماغ مع "العيش التصوير القصيرة الأجل"

ملاحظة: الإجراء التالي هو أساسا نفس لتصوير طويلة الأجل ولكن لا تتطلب غشاء PTFE. لتجنب تعريض الأدمغة الضوء الأزرق عند إضافة المواد الكيميائية إلى الثقافة، يجب وضع المجهر في غرفة مظلمة مع الضوء الأحمر.

  1. انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين الفاصل الزمني المطلوب وعدد من المسح الضوئي للحصول على بيانات خط الأساس قبل تطبيق المخدرات. بدء المسح الضوئي.
  2. خط الأساس بعد اكتمال المسح الضوئي، ورفع رئيس النظام مجهر المسح الضوئي. قم بإزالة غطاء وحدة التحكم بالرطوبة أعلى مرحلة وعناية غطاء الطبق أسفل الزجاج دون نقله.
  3. إزالة المقدار المناسب من الثقافة المتوسطة إذا لزم الأمر. إضافة الحل التجريبي في الأجل المتوسط، ومزيج بعناية والغاية بلطف، مع ماصة باستور معقمة دون لمس explants الدماغ.
    ملاحظة: لتطبيق حمام من قوات الدفاع الشعبي، استخدام 2 ميكرومتر حل الأسهم قوات الدفاع الشعبي (في [دمس] 10%).
  4. استبدال الأغطية للطبق أسفل الزجاج وقاعة الرطبة، ومسح الرأس. في حالة استخدام، قم بتغيير موضع القماش الأسود معتم حول قاعة المجهر.
  5. معرفة ما إذا كان العقل المدبر في مواقعها الأصلية في وضع المسح الضوئي مباشرة. تعديل إذا لزم الأمر.
  6. انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين الفاصل الزمني المطلوب وعدد من المسح الضوئي. بدء المسح الضوئي.
    ملاحظة: هنا نحن اختبار الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة كل ساعة لما يصل إلى 10 س.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نحن إظهار النتائج الممثل التسجيل طويلة الأجل لمراسل الفلورسنت الإيقاعية في السابقين فيفو ثقافة الدماغ اليرقات، ويعيش التصوير نتائج تطبيق حمام PDF في التعبير مراسل.

عدم تجول اليرقات L3 التعبير عن ساعة جزيئية مراسل في--TDT و UAS-mCD8::YFP يقودها سائق العصبية على مدار ساعة كانت العالق Clk 856-gal4 (الشكل 1) في أدمغة ld. تشريح وإعدادها لثقافة طويلة الأجل خلال آخر ضوء المرحلة من دورة LD السابقة فقط في مرحلة مظلمة (الشكل 1 ألف و 2 باء). الوقت الفاصل بين التصوير قد أنجز في شهر وتم تصويرها explants الدماغ كل ح 2 عن ح 64. مجموع-كومة التي تحتوي على الخلايا العصبية التي تهم تم إنشاؤه وتم قياس كثافة fluorescence يعني المنطقة المقابلة للخلايا العصبية بعد خلفية الطرح8. لتحديد رهيثميسيتي التعبير مراسل، التحليل الطيفي الانتروبيا الحد الأقصى (ميسا) والتفتيش اليدوي كانت تستخدم8. DN2s اثنين تعرض إيقاعات circadian مع فترة ~ ح 26 في مستويات في--TDT ترد هنا (الشكل 2 أ وج 2، و 1 فيلم).

تستخدم أساسا في نفس الثقافة الإعداد (الشكل 1B)، درس تأثير neuropeptide PDF على التعبير عن في--TDT. تم تشريح الأدمغة غير تجول اليرقات من نفس النمط الوراثي كما هو موضح أعلاه أما في ZT1 (زيتجيبير الساعة 1، ح 1 وبعد الأضواء على في LD) أو ZT13 (ح 1 بعد الأنوار). كانت مبردة قارورة تحتوي على يرقات فورا على الجليد بعد اتخاذها خارج الحاضنة. في ZT13، كما كانت ملفوفة في قارورة في رقائق الألومنيوم تجنب التعرض للضوء الأزرق. وأجرى تشريح الدماغ على الجليد وتشريح أدمغة وأبقى على الجليد. العقول اتخذت في ZT13 كانت مغطاة برقائق الألومنيوم كلما كان ذلك ممكناً. وهكذا، على الرغم من أن تم تنفيذ هذا الإجراء في مختبر مضاء بالضوء الطبيعي، كان الحد الأدنى تأثير التعرض للضوء على توليف الجزيئات والايض. تم تفحص الأدمغة مرتين مع الفاصل الزمني ح 1 للحصول على بيانات خط الأساس. قوات الدفاع الشعبي أو مركبة ([دمس]) أضيفت إلى متوسط الثقافة والوقت الفاصل بين الصور تم الحصول عليها كل ح 1 ل h. 6 اللاحقة في--TDT التعبير الشخصية أظهرت زيادة الوقت من اليوم تعتمد على كثافة الأسفار عند إضافة قوات الدفاع الشعبي في ZT13 في اللازم و DN1s، وبقدر أقل على DN2s (الشكل 3)8.

تشير هذه النتائج إلى أن تقنية التصوير وثقافة الأسلوب الموصوفة هنا تمكين التسجيل في--TDT إيقاعات في القرار خلية واحدة دون الانجراف الضيائية أو فوتوبليتشينج أو تركيز ملحوظ.

ملاحظة: الصور قد تم تحليلها ومعالجتها باستخدام فيجي28. وأجرى 10 X deconvolution متكررة مع AutoQuant وإيماريس. تم تصحيح الانجرافات طفيفة في الوقت الفاصل بين الصور مع البرنامج المساعد الانجراف 3D الصحيح من إيماجيج.

Figure 1
رقم 1: تشريح الخلايا العصبية على مدار الساعة في الدماغ L3 اليرقات وإعداد الثقافة explant الدماغ. و ب) الخطط لإعداد ثقافة الدماغ للتصوير بالمدى الطويل (A) وفحوصات الدوائية مع قصيرة الأجل التصوير (ب). (أ)، تطبق فراغ الشحوم (أصفر) على الجزء البلاستيك للطبق أسفل الزجاج لإرفاق غشاء PTFE. (ج) صورة تمثيلية للدماغ L3 العالق LD اليرقات في ZT2. التعبير عن مراسل الجزيئية على مدار الساعة في--TDT (أرجواني) مرئياً في الخلايا العصبية على مدار الساعة، وهي المسماة بدافع Clk 856-gal4UAS-mCD8::YFP(green). وهناك 3 مجموعات من الخلايا العصبية متباينة على مدار الساعة في المستوى 3: 5 اللازم (بما في ذلك لنف الخامسة، التي لا تعبر عن قوات الدفاع الشعبي)، 2 DN1s و 2 DN2s، أشارت إلى جانب رؤوس الأسهم البيضاء. ملاحظة التعبير عن في--TDT في نويات الخلايا العصبية على مدار الساعة. يفب السلبية في--TDT-إيجابية الخلايا هي إطلاق وأخرى الفرعي من الخلايا العصبية على مدار الساعة التي لا تزال تتطور. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: يعيش الممثل نتائج طويلة الأجل تصوير الخلايا العصبية ساعة اليرقات. (أ) تضخيم رأي DN2s من تصوير الدماغ مثقف الوقت الفاصل بين طويل الأجل. وتم إعداد explants الدماغ من اليرقات L3 العالق LD تشريح في ZT11. الصور وقد أخذت كل ح 2 من CT17 (الإيقاعية الساعة 17، ح 5 بعد ذاتي الأنوار في DD) ح 64 في ممزوج dd. الصور في--TDT (أرجواني) و UAS-mCD8::YFP يقودها Clk 856-gal4 (الأخضر) على الجهة اليسرى من كل فريق ومستويات TDT في تمثيله ك heatmap مع تدرج أزرق على الحق. شريط المقياس = 10 ميكرون. للتمثيل فقط، تم تجهيز الصور مع 3D تصحيح الانحراف و deconvolution تكرارية X 10. (ب) توقيت التجربة. (ج) الرسم البياني الذي يمثل كثافة نسبية الأسفار تطبيعها في t = 0 DN2s اثنين (زرقاء وحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نتائج تمثيلية لتصوير مباشر للتجارب الدوائية. تشريح أدمغة اليرقات العالق LD وشنت في ZT1 أو ZT13، وقوات الدفاع الشعبي (2 ميكرومتر) أو طبق [دمس] في ZT2 أو ZT14. كان يرصدها التعبير في--TDT في المخ explants المجهري الوقت الفاصل بين كل ساعة. ويرد fluorescence متوسط كثافة ± SEM تطبيع إلى القيمة في بداية التصوير (المقابلة ل ZT1 أو ZT13). الأسهم الحمراء تشير إلى وقت تقديم الطلب الشعبي أو مركبة (ZT2 أو ZT14). * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 و * * * ف < 0.0001 من ANOVA ثنائي الاتجاه مع التصحيح في صداق لمقارنات متعددة. وجرى تحليل الحد أدنى اللازم 32، 18 DN1s و 16 DN2s لكل نقطة بيانات. لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
1 الفيلم: تصوير حية طويلة الأجل اليرقات الخلايا العصبية على مدار الساعة DN2. فيلم الوقت الفاصل بين المخ اليرقات مثقف تشريح في ZT11 وتصويرها في ماجنيفيد dd. وترد آراء DN2s في نصف الكرة واحد الإعراب في--TDT و UAS-mCD8::YFP يقودها Clk 856-gal4 . الصور تم الحصول عليها كل ح 2 عن 64 حاء في--TDT (أرجواني) ويفب (الأخضر) على اليسار ومستويات TDT في تمثيله heatmap (تدرج أزرق) على الحق. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

الخطوات الكواشف تركيز
1-خلط المواد الكاشفة. خ2ص4 4.18 مم
كاكل2 1.05 ملم
.7H مجسو42س 0.7 ملم
كلوريد الصوديوم 116 مم
ناكو3 0.7 ملغ/مل
الجلوكوز 2 مغ/مل
تريهالوسي 2 مغ/مل
حمض كيتوجلوتاريك α 0.35 ملغ/مل
حمض fumaric 60 ميكروغرام/مل
حمض malic 0.6 ملغ/مل
حمض سوكسينيك 60 ميكروغرام/مل
استخراج الخميرة 2 مغ/مل
FCS غير الحرارة-معطل 20%
dH2س، يعقم
2-تعقيم مع 0.22 ميكرومتر التصفية.
3-احتضان في حاضنة لثقافة الخلية عند 25 درجة مئوية في الظلام ل h. 72 حاضنة يجب أن يكون خاليا من التلوث البكتيرية أو الفطرية.
4-إضافة الكواشف. الأنسولين 2 ميكروغرام/مل
مكررا-تريس الأس الهيدروجيني 6.8، تعقيم مع 0.22 ميكرومتر تصفية 5 مم
5-ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8-6.9. هيدروكسيد الصوديوم (10 ن) قطرات ~ 8
6-تعقيم مع 0.22 ميكرومتر التصفية.
7-قاسمة لمل 5 فلاش تجميد في مخزن LN2 في-80 درجة مئوية. استخدام ويثين 60 يوما.
ملاحظة: لكميات كبيرة، تعقيم مع تصفية أعلى زجاجة من فراغ، وإلا استخدم عامل تصفية المحاقن. فتح مختبرين في غطاء ثقافة. الاستخدام مرة واحدة.

الجدول 1: إعداد سام المتوسطة (س 1) للثقافة الدماغ المورفولوجية . المتوسط للثقافة اكسبلانت الدماغ. وينبغي تنفيذ كافة الخطوات في غطاء ثقافة باستثناء حضانة المتوسط.

الخطوات الكواشف تركيز
1-خلط المواد الكاشفة. حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.4 99 مم
كلوريد الصوديوم 1.37 M
بوكل 54 مم
نة2بو4 1.7 مم
خ2ص4 2.2 مم
الجلوكوز 33 ملم
السكروز 438 مم
يعقم dH2س
2-تعقيم مع 0.45 ميكرومتر التصفية.
3-تخزين عند 4 درجة مئوية إلى 6 أشهر.
ملاحظة: للاستخدام التجريبي: تمييع 1 X مع يعقم dH2س وتعقيم 0.45 ميكرومتر تصفية الزجاجة أعلى من فراغ أو مع المحاقن عامل التصفية. تبقى عند 4 درجة مئوية. فتح في غطاء ثقافة، استخدام متعددة.

الجدول 2: إعداد مفاجآت صيف دبي (10 x)- المحلول الملحي تشريح أدمغة المورفولوجية . إعداد في غطاء ثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا وصفت لنا طريقة طويلة الأجل مجهرية الوقت الفاصل بين الأسفار من العقول اليرقات المستزرعة. يتوقف نجاح هذا النوع من التجارب على عدة عوامل، مثل صحة الثقافة، وطريقة لتجميد explant الدماغ، وكثافة الأسفار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء مراسل، الزماني والمكاني القرار، و الوصول إلى explant. وهذه العوامل يمكن أن يستبعد بعضها بعضا. على سبيل المثال، زيادة تواتر مرور الزمن يؤثر على صحة الثقافة، وتعطيل تداول explant الدماغ قد تعوق تبادل الغازات. وهكذا، إيجاد وسيلة سعيدة (لا يقصد التورية) للظواهر قيد الدراسة هو المفتاح لنجاح بروتوكول. الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لرصد التعبير عن الصحفيين الإيقاعية الفلورسنت في نطاق ساعات إلى أيام. كما أنها تنطبق على دراسة مواضيع أخرى في بيولوجيا الأعصاب المورفولوجية طالما دون تغيير العمليات الحرجة وتنفيذها بعناية.

في هذا البروتوكول، وهي معطلة explants الدماغ بجلطة فيبرينوجين، الذي يقوم بإنشاء مصفوفة ثلاثية الأبعاد. ورغم وجود طرق أخرى للتثبيت، مثل بولي-يسين أو طلاء laminin من الزجاج غطاء، هذه تبطئ تنمية اليرقات العقول29 ومما قد يؤدي إلى الإخلال متانة الفسيولوجية. بحكم طبيعته، يوفر فيبرينوجين مصفوفة ممتازة فضفاضة ما يكفي للسماح للمواد الغذائية لتصل إلى اكسبلانت الدماغ ولزجة ما يكفي للدماغ لتكون قريبة من الزجاج غطاء دون السحق هو16. ونظرا لهذه المزايا، قد استخدمت الأسلوب فيبرينوجين جلطة في مختلف البروتوكولات لزراعة الخلايا والمخ explant الثقافة14،،من1729،،من3031،32 ،،من3334. نوصي باستخدام مصفوفة 3D فيبرينوجين للثقافة الدماغ اليرقات حتى بالنسبة لتجارب القصيرة الأجل نسبيا التي تدوم أكثر من بضع ساعات. الثقافة الدماغ اليرقات دون مصفوفة ثلاثية الأبعاد يعطي نتائج خاطئ (البيانات لا تظهر)، ربما بسبب عدم وجود الدعم المادي اللازم لتطوير العقول.

من المهم أن نلاحظ مورفولوجية explant والخلايا في الأنسجة بعناية قبل وخلال الوقت الفاصل بين التصوير للكشف عن أي إشارة استغاثة. في التجارب التي عرضت هنا، التعبير عن mCD8::YFP ربط الغشاء أظهرت مورفولوجيا سليمة من الخلايا العصبية واكتشفت في--TDT في السيتوبلازم والنواة كما هو متوقع، مشيراً إلى أن explant الدماغ لا يزال صالحاً وصحية في جميع أنحاء مدة التصوير. درس رهيثميسيتي الإيقاعية ليصل إلى 72 ساعة ولكن لاحظنا أن explants الدماغ يمكن أن يكون مثقف لمدة 5 أيام دون تدهور سلامة الخلايا العصبية والمخ (البيانات لا تظهر). إذا نيوريتيس تصبح دوتي أو الجسم خلية من الخلايا العصبية الاندفاع، وهذه عادة ما تكون علامات الضيائية ومنعت بسهولة بتكييف إعدادات مجهر تبعاً لذلك. على سبيل المثال، حاول تقليل قوة الليزر مع زيادة حجم الثقب وكسب الذكية ونافذة للكشف. ومع ذلك، عموما، هو كثافة الأسفار للمراسل عاملاً يحد من الحصول على صور نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة دون إضاءة الليزر عالية الكثافة. ولذلك، يتم تصميم المراسل، الخيار فلوروفوري، وعدد النسخ للمراسل أول الأشياء في الاعتبار عند استكشاف أخطاء مشاكل السلامة. (في التجربة المعروضة هنا، 4 نسخ من كل tdt مراسل استخدمت.)

تتضمن علامات أخرى لثقافة الدماغ الشبهة الاندفاع لنصف الكرة خلال الوقت الفاصل بين التصوير وحركة السوائل خارج explant الدماغ. ويرجح سبب الصغرى-ثقوب تسببت خلال تشريح الدماغ. إزالة الأقراص imaginal يعلق على الدماغ اليرقات هو المصدر الرئيسي لثقوب، وبالتالي نحن ننصح ضدها.

ميزة تصوير لايف الإيقاعية الأسفار عبر التصوير بالإضاءة الحيوية هو القرار المكانية العالية. وباﻹضافة إلى ذلك، ييسر سهولة استخدام علامات الخلوية جنبا إلى جنب مع مراسل إيقاع تحليل خصوصية نوع الخلية. وفي المقابل، قد الإضاءة الحيوية الأزمنة متفوقة وممتازة الإشارات إلى الضجيج نسبة19،،من2021. ومع ذلك، عموما عدد الخلايا العصبية ركوب الدراجات في الدماغ تصويرها بالإضاءة الحيوية ليست متفوقة مقارنة بعددهم الذي حصل مع لدينا أسلوب8،،من1921. في معظم الحالات، تتم مزامنة إيقاعات الصحفيين الفلورسنت الكشف مع أسلوبنا داخل نفس الكتلة من الخلايا العصبية على مدار الساعة (انظر الشكل 2)، كما هو موضح بالإضاءة الحيوية19. ولوحظت مرحلة الخلافات بين الكتل العصبية على مدار الساعة في الأسفار والإضاءة الحيوية الإيقاعية التصوير8،،من1921. ولذلك، على حد سواء منهجيات تصلح أيضا في الاحتفال بايقاعات circadian في أدمغة المثقفين، وينبغي الاختيار بين التنوير والإضاءة الحيوية وفقا لهدف الدراسة.

الصعوبة التقنية الرئيسية لهذا الأسلوب في الخطوة التضمين. لأن البروتوكول تدعو تصوير [كنفوكل] المسح السريع مع مجهر مقلوب، وتشتت الضوء في أنسجة المخ يقلل من الكشف عن الأسفار خاصة عند التصوير في أعماق الأنسجة، وينبغي أن شنت explants الدماغ قريبة قدر ممكن لتغطية الزجاج. وعلاوة على ذلك، إمكانية تكرار نتائج نتائج التصوير يعتمد على اتساق z-المواقف من الخلايا العصبية للمصالح. ولذلك، من المهم توجيه وجبل العقول دائماً بنفس الطريقة، الأمر الذي يتطلب ممارسة. الصورة العصبية مجموعات تقع في مواقع متميزة تشريحيا، قد يكون المطلوب لتشغيل التجارب منفصلة مع التوجه explant الدماغ المختلفة. وهناك طرق بديلة لتصوير عميق الأنسجة الحية التي لا تتطلب استزراع الأنسجة، كما هو الحال قبل يومين-فوتون الفحص المجهري والورقة الخفيفة الميكروسكوب. هذا الأخير قد استخدمت بنجاح لديناميات الكالسيوم الإيقاعية الصورة في أدمغة المورفولوجية يعيش22،23. ومع ذلك، الورقة الخفيفة الميكروسكوب دقة مكانية أقل من الفحص المجهري [كنفوكل] وثم تطبيقه على التصوير بدقة وحيدة الخلية لا يزال يشكل تحديا.

وباختصار، يجمع هذا البروتوكول نظام ثقافة بسيطة explants الدماغ اليرقات في ظل الظروف التي تدعم اكتساب صورة الوقت الفاصل بين الصحفيين الفلورسنت على مدى الأيام والتحليل الكمي للايقاعات البيولوجية. على الرغم من أن هناك بعض القيود كما نوقش أعلاه، يمكن تكييفها للصحفيين صورة مختلفة في أدمغة المورفولوجية اليرقات والكبار المنهجية وكذلك تعديل لزيادة الحساسية والقرار المكانية. على سبيل المثال، إسقاطات محواري تقع في عمق الدماغ أو قد يكون النقل حويصلية يمكن كشفها بالجمع بين تقنية الثقافة explant الدماغ لدينا مجهرية اثنين-فوتون35. أن يقال، لا يزال من الممكن القيام بتصوير مباشر من العضيات مثل الميتوكوندريا في المخ الكبار explants استخدام هذا البروتوكول (البيانات لا تظهر). كما قدمنا الاختلاف من هذا البروتوكول لحمام تطبيق الحل التجريبي في فحوصات الدوائية. واحد يمكن أن يمتد هذا البروتوكول القيام بتجارب "نبض--تشيس" يدوياً استبدال المتوسطة الثقافة تغسل المخدرات أو باستخدام نضح دائرة18،36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نشكر روسباش مايكل له الإرشاد والدعم خلال المرحلة الأولى من تطوير هذا الأسلوب. تم تمويل هذا العمل من قبل JST المعزوفة البرنامج، مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_149893 و 31003A_169548)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC-الجنيه الاسترليني-311194)، ومؤسسة نوفارتيس "البحوث" الطبية البيولوجية الطبية (13A39) وجامعة جنيف .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
NaCl Sigma-Aldrich S5886
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1000
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
BIS-TRIS Sigma-Aldrich B4429
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T0167
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512
Fumaric acid Sigma-Aldrich F8509
α-Ketoglutaric acid Sigma-Aldrich K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened BioConcept Ltd. Amimed 2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-654011
KCl Sigma-Aldrich P5405
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S5011
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Fibrinogen from bovine plasma Calbiochem (Merck) 341573-1GM CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T9549 CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH Chi Scientific custom made
Vaccum grease Sigma-Aldrich 18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes fisherscientific 08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm Millipore SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film Dupont 200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLGV033RS
Three-well glass dissection dish Any company
Fine forceps, size 5, Dumont Fine Science Tools 11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber Life Imaging Services The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller Life Imaging Services custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin ImageJ software
10x iterative deconvolution AutoQuant and Imaris software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43, (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
  3. Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
  4. Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
  5. Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
  6. Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19, (1), 10-21 (2004).
  7. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, (2), 293-300 (2005).
  8. Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
  9. Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48, (2), 267-278 (2005).
  10. Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48, (2), 221-227 (2005).
  11. Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48, (2), 213-219 (2005).
  12. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28, (23), 6010-6021 (2008).
  13. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16, (11), 5127-5140 (2005).
  15. Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (10), 970-977 (2013).
  17. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188, (5), 693-706 (2010).
  18. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  19. Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25, (7), 858-867 (2015).
  20. Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, (2), 251-266 (2009).
  21. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, (3), 228-232 (2010).
  22. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351, (6276), 976-981 (2016).
  23. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. (2017).
  24. Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269, (2), 459-478 (2004).
  25. Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
  26. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94, (1), 491-500 (2005).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  29. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
  30. Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29, (9), 721-730 (2005).
  31. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6, (7), 533-549 (1998).
  32. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
  33. Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10, (4), 574-584 (2015).
  34. Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207, (1), 72-79 (2012).
  35. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
  36. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108, (2), 684-696 (2012).
Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية <em>المورفولوجية</em> في الدماغ اليرقات الثقافة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (131), e57015, doi:10.3791/57015 (2018).More

Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (131), e57015, doi:10.3791/57015 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter