Summary
Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.
Abstract
Het circuit van de circadiane pacemaker regisseert ritmische gedrags- en fysiologische uitgangen gecoördineerd met milieu signalen, zoals dag/nacht cyclus. De moleculaire klok binnen elke pacemaker neuron genereert circadiane ritmen in genexpressie, ten grondslag liggen, de ritmische neuronale functies noodzakelijk zijn voor de werking van het circuit. Onderzoek naar de eigenschappen van de individuele moleculaire oscillatoren in verschillende subklassen van pacemaker neuronen en hun interactie met de neuronale signalering levert een beter begrip van het circadiane pacemaker-circuit. Hier presenteren we een time-lapse fluorescent microscopie aanpak ontwikkeld voor het controleren van de moleculaire uurwerk in klok neuronen van gekweekte Drosophila larvale hersenen. Deze methode staat de meerdaagse opname van de ritmes van genetisch gecodeerde fluorescerende circadiane verslaggevers bij eencellige resolutie. Deze setup kan worden gecombineerd met farmacologische manipulaties nauw analyseren real-time respons van de moleculaire klok op verschillende verbindingen. Buiten de circadiane ritmes biedt deze multifunctionele methode in combinatie met krachtige Drosophila genetische technieken de mogelijkheid om te bestuderen van de diverse neuronale of moleculaire processen in levende hersenweefsel.
Introduction
Circadiane klokken helpen organismen aan te passen aan de periodieke veranderingen in het milieu die zijn gegenereerd door de 24u draaiing van de aarde. De interlocked transcriptionele-translationeel feedbacklussen vaak ten grondslag liggen de moleculaire machine van circadiane klokken over soorten1. Het circuit van de circadiane pacemaker bestaat uit de klok-bevattende neuronen integreert tijd van de dag informatie overgebracht door middel van de ecologische signalen, zoals de licht/donker (LD) en temperatuur cycli, om te orkestreren de ritmes van een overvloed aan dagelijks fysiologische en gedragsmatige processen2,3. De coördinatie van de moleculaire ritmes met neuronale inputs en outputs is uitermate belangrijk voor de werking van de circadiane circuit maar blijft slechts ten dele begrepen.
In Drosophila, de kern van de moleculaire klok, de klok/cyclus (CLK/CYC) heterodimer activeert de transcriptie van periode (per) en tijdloze (tim). PER TIM vormen een complex en voeren de kern, waar ze transcriptionele activiteit van CLK/CYC en daarmee hun eigen transcriptie remmen. Post-transcriptional en posttranslationele verordeningen veroorzaken vertragingen tussen CLK/CYC-gemedieerde transcriptie en repressie door PER / TIM, zorgen voor de generatie van circa 24 uur moleculaire oscillaties1,3,4 . Ongeveer 150 neuronen die deze moleculaire klokken-formulier bevat vliegt een circuit tot controle circadiane gedrag van volwassene5. Een veel eenvoudiger maar volledig functionele circadiane circuit dat bestaat uit 3 groepen van neuronen van de klok - 5 ventrale laterale neuronen (LNvs; 4 PDF-positieve LNvs en één PDF-negatieve LNv, zie hieronder), 2 dorsale Neuron 1s (DN1s) en 2 dorsale Neuron 2s (DN2s) - is aanwezig in het larvale hersenen6,7.
Het eenvoudige larvale circadiane circuit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van de interacties tussen Inter neuronale communicatie en de moleculaire uurwerk. Met behulp van onze nieuw ontwikkelde fluorescerende verslaggever PER-TDT, die de hoeveelheid PER eiwit en haar subcellular locatie bootst, wilde wij karakteriseren de dynamiek van de moleculaire uurwerk in verschillende klok neuron subgroepen in het larvale circadiane circuit 8. Bovendien, te weten de sleutelrol van de neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) geproduceerd door 4 LNvs bij het reguleren van de circadiane ritmen bij de neuronale niveau9,10,11, we wilden onderzoeken van de directe effect van de PDF op de moleculaire klokken. Te dien einde ontwikkelden we een methode voor het controleren van de circadiane genexpressie ritmes in larvale hersenen over meerdere dagen door time-lapse confocale microscopie explant. Het protocol is ook aangepast voor farmacologische testen om te testen van het effect van PDF of andere verbindingen op het niveau van de PER-TDT. Dus, de aanpassing bestaat uit de hersenen explant cultuur toegankelijk maken voor toepassing van de drug, verhoging van de temporele resolutie en imaging voor een kortere duur.
Ex vivo cultuur van Drosophila hersenen van verschillende ontwikkelingsstadia geweest tevoren vastgelegde12,13,14,15,16,17 ,18. Overwegende dat deze protocollen zijn gebruikt voor imaging-verschillende biologische fenomenen, sommige van hen zijn niet compatibel met beeldvorming bij eencellige resolutie of bieden geen ondersteuning voor de cultuur voor meer dan enkele uren. Alternatieve methoden voor het uitvoeren van langdurige live beeldvorming van circadiane neuronen in Drosophila omvatten bioluminescentie beeldvorming van moleculaire ritmes19,20,21 en fluorescentie beeldvorming van calcium-indicator met licht blad microscopie22,23. Hoewel bioluminescentie imaging hogere temporele resolutie bereiken kan en lichte blad microscopie aangepast voor in vivo imaging worden kan, ze zijn beperkt op de ruimtelijke resolutie en vereisen gespecialiseerde Microscoop systemen.
De hier beschreven methode is toegesneden op het visualiseren van fluorescerende signalen in de hele hersenen cultuur bij eencellige resolutie over meerdere dagen. Deze facile en veelzijdige methode kan worden aangepast naar afbeelding gekweekte volwassen vliegen hersenen en farmacologische experimenten veel verschillende problemen in Drosophila neurobiologie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de stamoplossingen onder de motorkap van een cultuur
- Bereiden van 400 mL 1 x Schneider actieve Medium (SAM) geoptimaliseerd voor ex vivo cultuur van larvale hersenen (gewijzigd van referentie24,25) (tabel 1). Aliquot tot 5 mL en flash bevriezen in vloeibare stikstof (LN2), op te slaan bij - 80 ° C.
- 1 x ontrafeling zoutoplossing (DSS) bereid door verdunning 10 x stockoplossing (gewijzigd van referentie26) (tabel 2).
- Aliquot fibrinogeen 10 mg te bewaren bij 4 ° C voor een eenmalig gebruik.
Let op: Weeg fibrinogeen onder laminaire flow, het dragen van handschoenen, want het is schadelijk. - Bereiden van trombine stockoplossing in SAM (1500 NIH eenheid/mg) en aliquoot aan 10 µL, flash bevriezen in LN2 en houden bij-80 ° C.
Let op: Draag handschoenen bij het verwerken van trombine, want het is schadelijk. - Aliquot stockoplossing van 100 x penicilline-streptomycine. Houden bij-20 ° C.
- Snijd de cirkels van polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan (Zie materialen tabel) naar het formaat dat overeenkomt met de binnenkant van een glazen bodem schotel. Spoel ze in 70% EtOH en vervolgens in een gesteriliseerde met autoclaaf dH2O. Sterilize en droog onder laminaire flow met UV. Houden in een steriele petrischaal. Eenmalig gebruik.
Opmerking: PTFE is een poreuze flexibele membraan die staat gasuitwisseling toe en verhindert dat medium verdampen tijdens langdurige opname.
2. time-lapse microscopie Setup
Opmerking: De volgende installatie is voor een tandem scanner omgekeerde confocal microscoop (Zie materialen tabel) uitgerust met een resonante scanner (8.000 Hz). Het systeem omvat een uiterst gevoelige foto-multiplier detector, die samen met de resonant scanner fototoxiciteit en photobleaching voorkomen. Temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd binnen een Microscoop milieu kamer (Zie Materialen tabel) dat behandelt de meeste van de Microscoop.
- Plaats een etappe-top vochtigheid kamer.
- Inschakelen van de temperatuur en vochtigheid-controllers equilibreer de Microscoop zaal tot 25 ° C en 80% luchtvochtigheid.
- Voor het uitvoeren van experimenten in constante duisternis (DD), dekken de Microscoop milieu zaal met een ondoorzichtig doek (tenzij de Microscoop kamer is gemaakt van een ondoorzichtig materiaal).
- Als met behulp van een water-onderdompeling doelstelling, plaatst u een Water onderdompeling Micro Dispenser op de top van de doelstelling en een protocol met de Autoimmersion doelstelling Controller-software af te zien van water met een constante snelheid tijdens time-lapse imaging program.
Opmerking: Water-onderdompeling doelstellingen samen met een water dispenser of droge objectief worden aanbevolen voor lange termijn levende imaging, zoals andere type van onderdompeling medium zou uitdrogen. - Plaats een petrischaal houder in het werkgebied, binnenkant van de kamer vochtigheid.
- Start de Microscoop software en selecteer de modus resonant scanner in het eerste dialoogvenster. Kies OK om te initialiseren het werkgebied wanneer daarom wordt gevraagd. Ga naar tabblad Configuratie en Hardware configuratie om over te schakelen op de relevante laserlijnen.
- Gaat naar ophaal tabblad en XY deelvenster selecteren bidirectionele modus en afbeelding overname parameters instellen.
Opmerking: De beschreven imaging setup hier gepresenteerd (Figuur 2en Figuur 3 film 1) is geoptimaliseerd voor het observeren van circadiane expressie van specifieke fluorescerende verslaggevers. De volgende parameters werden gekozen tot het beste passen bij onze specificaties: 40 X water onderdompeling doelstelling, 8 X lijn gemiddelde met 512 × 512 beeldresolutie. Voor multicolor imaging, sequentiële Beeldacquisitie is nodig wanneer de golflengte van de emissie van een fluorophore en de golflengte van de excitatie van een andere overlapping (hier, golflengten van gele fluorescerende eiwit (YFP) emissie en tomaat excitatie overlapping). Kies de sequentiële modus "tussen stapel" zoals het is de snelste en het verkeer van klok neuronen te verwaarlozen tijdens de overname van een Z-stack is. Microscopie instellingen moeten worden aangepast aan het doel van elk experiment.
3. setup van larvale hersenen Explant cultuur
Opmerking: Het hele procédé vanaf dissectie te embedding van hersenen explantaten duurt ~ 30 min.
-
Bereiding van reagentia onder de motorkap van een cultuur.
- Ontdooi een aliquoot gedeelte van trombine en houden bij kamertemperatuur totdat de insluiten stap (stap 3.3). Eenmalig gebruik.
- Snel ontdooien van een aliquoot deel van SAM bij 37 ° C en houd op ijs voor een eenmalig gebruik.
- SAM toevoegen aan een hoeveelheid van 10 mg van fibrinogeen tot 10 mg/mL, flick zachtjes en Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten, en tijdens het insluiten stap (stap 3.3). Eenmalig gebruik.
Opmerking: Niet broeden de fibrinogeen oplossing meer dan 2 h als het begint te polymeriseren. - Ontdooi een aliquoot gedeelte van 100 x voorraad penicilline-streptomycine. Bereiden van 2.5 mL van SAM met 1 x penicilline-streptomycine (SAM/antibiotica). Bewaren bij kamertemperatuur.
Opmerking: Winkel de resterende 100 x voorraad penicilline-streptomycine bij 4 ° C tot 1 maand. - Bereiden een aliquoot deel van 500 µL van de resterende SAM. Houd op ijs.
- Voor langdurige imaging, gesteriliseerde met autoclaaf vacuüm vet toepassen op het plastic deel van de onderkant van de glazen bodem schotel (figuur 1A) en steriliseren onder laminaire flow met UV.
-
Dissectie van het centrale zenuwstelsel en ventrale zenuw snoer.
- De verlostang en 2 x drie-well glas dissectie gerechten met 70% reinigen EtOH. Giet 400 µL van DSS in 4 putten en 400 µL van SAM in een put. Houd op ijs.
- Schep vliegen opslagmedium met larven en niet-zwerven 3e instar larven (L3) te halen met een pincet. Spoel ze achtereenvolgens in 2 DSS gevulde wells. Houd ze in de 3de DSS gevulde goed op ijs dat anesthetizes van de larven.
Opmerking: L3 duurt ongeveer 2 dagen bij 25 ° C. Te observeren de hersenen in fysiologisch relevante tijdsbestek die we gekozen voor het gebruik van niet-zwerven L3 larven. Andere subgroepen van klok neuronen, zoals l-LNvs en DN3s, beginnen te worden gevormd op het zwerven L3 stadium, maar ze nog niet noodzakelijkerwijs fietsen (gegevens niet worden weergegeven). Daarom, hoewel het mogelijk te afbeelding is fietsen klok neuronen in dit stadium (gegevens niet worden weergegeven), is het belangrijk om zorgvuldig de neuronen al functionele larvale klok onderscheiden ontwikkelingslanden voor data-analyse. Non-zwerven L3 verschijnen ongeveer 4 tot 4,5 dagen na ei leggen bij 25 ° C. Voor het gebruik van dit protocol voor het bestuderen van de circadiane ritmes, synchroniseren (later) de ontwikkelingslanden larven in 12 h/12 h LD cycli bij 25 ° C gedurende 3 dagen vóór het verzamelen van L3 larven. - Ontleden larvale hersenen met fijne pincet in de 4e DSS gevulde put, die niet is gebruikt voor het spoelen van de larven, met behulp van de methode van binnenstebuiten27.
- Kort, de larve in twee gesneden, zachtjes knijpen de mond haken met een paar pincet en oprollen van binnenstebuiten de muur van de lichaam met behulp van de andere paar pincet, dus het blootstellen van de hersenen. Gratis de hersenen door te snijden de luchtpijp en de zenuwen die aan de rest van het lichaam hechten.
- De hersenen in ongeveer 3 µL van DSS gecombineerd met een 20 µL Pipet (vooraf gespoeld met DSS) en afzien in de SAM-gevulde waterput. Herhaal de procedure voor maximaal 7 hersenen.
Opmerking: Dissectie moet worden uitgevoerd op een koud oppervlak te houden van de larven verdoofd en de hersenen gekoeld. Bijvoorbeeld de dissectie schotel te plaatsen op een koeling blok verbonden aan een pomp te laten circuleren van ijs-koud water. De dissectie procedure duurt ~ 30 s per hersenen. Het is belangrijk om te houden van het oog/antennal imaginaire schijven aangesloten op de hersenen en het ventrale zenuw snoer intact. Scheuren uit de volgende onderdelen zullen de hersenen beschadigen en de kwaliteit van de cultuur te verminderen. Ook, Vermijd blootstelling van de hersenen naar de lucht. Voordat de eerste hersenen, pipet op en neer de DSS bevattende delen van de ontleed larven, aspirating als het voorkomt dat de hersenen vasthouden aan de muur van de tip.
-
Inbedding van hersenen explantaten in een 3D matrix en montage (~ 20 min).
- Dompelen een ontleed hersenen in fibrinogeen werkoplossing (fibrinogeen eindconcentratie ~3.3 mg/mL, 10.5 µL per hersenen) als volgt:
- 3.5 µL van SAM/antibiotica gecombineerd (met de dezelfde tip gebruikt in punt 3.2.3). Gecombineerd een ontleed hersenen van de dissectie ver in de dezelfde pipette uiteinde zonder verstrekking van het medium van de SAM/antibiotica in de tip.
- Afzien van de hersenen en het medium op het deksel van een steriele petrischaal. Voeg een ander 3.5 µL van SAM/antibiotica en 3,5 µL van warme fibrinogeen/SAM 10 mg/mL oplossing op de daling met de hersenen. Meng de oplossing rond de hersenen zachtjes door pipetteren met een 20 µL pipette uiteinde.
Opmerking: Met behulp van een precisiepipet in plaats van de verlostang in deze stap vermijdt het benadrukken van de hersenen. - Neem 2 µL van de werkoplossing fibrinogeen uit het drop- en toe te passen op het dekglaasje aan van de schotel onder glas als een klein rondje. Voeg 0.8 µL van trombine en meng heel snel met een pipet tip. De fibrinogeen wordt omgezet tot fibrine en begint te polymeriseren.
- De hersenen die zit in de fibrinogeen werkoplossing (stap 3.3.1) tussen een paar pincet te nemen en plaats deze op de matrix zodra een witte matrix van fibrine zichtbaar is. Oriënteren de hersenen anterior zijde naar beneden (voor imaging-klok neuronen). Duw het zo dicht mogelijk aan het glas van de cover. Fibrine clot bestaat uit lagen van fibrine. Kies één laag en vouw het op de top van de hersenen met kleine en zachte bewegingen zonder loskoppelen van de matrix.
- Herhaal 2 tot 3 keer uit verschillende delen van de klonter te stabiliseren van de hersenen.
Opmerking: Bij de behandeling van de hersenen met een tang, wees voorzichtig niet te droog het of het een fysieke stress op te leggen.
- Herhaal 2 tot 3 keer uit verschillende delen van de klonter te stabiliseren van de hersenen.
- Voeg 20 µL van SAM/antibiotica op de top van de ingesloten hersenen om te stoppen met de werking van trombine.
- Herhaal de procedure voor het monteren van de resterende hersenen. Het is mogelijk om het insluiten van maximaal 5 tot 6 hersenen op een glazen bodem schotel.
- Voor langdurige levende imaging, voeg 600 µL van SAM/antibiotica in de innerlijke put (het glazen gedeelte). Plaats een voorgesneden PTFE-membraan op de top van het medium en vasthouden aan het vacuüm vet toegepast op het plastic deel van de bodem (3.1.5) (figuur 1A).
- Voor farmacologische testen, vult u de schotel met 2 mL van SAM/antibiotica (figuur 1B).
Opmerking: Het is zeer belangrijk om de verdamping van het medium, zoals de osmolaliteit van het medium essentieel voor de levensvatbaarheid van neuronen is. Voor langdurige imaging experimenten daarom noodzakelijk voor het afdichten van de cultuur-schotel met PTFE-membraan. Overwegende dat voor de korte termijn experimenten, afdichten membraan niet vereist is, zolang de schotel is gevuld met 2 mL van medium en gecontroleerd in een bevochtigde kamer.
4. time-lapse Beeldacquisitie
- Zet de glazen bodem schotel op de petrischaal houder binnen de fase-top vochtigheid kamer.
- Ga naar z-stack panel op het tabblad ophaal en ingesteld van de z-sectie stappen via de Microscoop software (2 µm × ~ 40 in de experimenten weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3, en film 1). Het begin van een z-stapel vastgesteldop het vliegtuig het verst van het dekglaasje aan en het einde aan het oppervlak van de hersenen explant, dicht bij het dekglaasje aan. Hoewel de hersenen bewegingen zijn te verwaarlozen, extra z-secties toevoegen aan het begin en einde van de z-stack.
- Ga naar Mark & paneel en set-up multi-positie Beeldacquisitie vinden. Met een 40 X doelstelling kan 1 hersenhelft worden vastgelegd in een gezichtsveld
- Ga naar overname modus paneel en selecteer xyzt (z-stack time-lapse). Ga naar tijd overname panel en de gewenste tijd interval en frequentie parameters instellen.
Opmerking: Verwerven time-lapse beelden met de gewenste frequentie. Merk op dat op lange termijn live beeldbewerking (24-72 uur) met time lapse interval korter dan 2 h neiging om resultaten in minder fietsen neuronen, waarschijnlijk omdat het vermindert de levensvatbaarheid van neuronen. Het datavolume breidt als de koers van de verhogingen van de overname van de afbeelding, waardoor data-analyse en opslag uitdagender.
5. farmacologische behandeling van hersenen explantaten met Short-term Live Imaging
Opmerking: De volgende procedure is in wezen hetzelfde als voor langdurige imaging maar hoeft niet een PTFE-membraan. Om te voorkomen dat bloot de hersenen blauw licht wanneer de chemische stof wordt toegevoegd aan de cultuur, moet de Microscoop worden geplaatst in de donkere kamer met rood licht.
- Ga naar tijd overname deelvenster en stel het gewenste tijdsinterval en aantal scan om de basislijngegevens vóór de toepassing van de drug te verkrijgen. Scan starten.
- Na de basislijn scan is voltooid, til de scan hoofd van het systeem van de Microscoop. Verwijder het deksel van de fase-top vochtigheid controller en zeer zorgvuldig en verwijder het deksel van de schotel glazen bodem zonder het te verplaatsen.
- De juiste hoeveelheid kweekmedium indien nodig verwijderen. Toevoegen van de experimentele oplossing in het medium, en zorgvuldig en zeer zacht, meng met een steriele Pipet van Pasteur zonder te raken de hersenen explantaten.
Opmerking: Voor de toepassing van de bad van PDF, gebruik 2 µM PDF-stockoplossing (in 10% DMSO). - Vervang de deksels van de glazen bodem schotel en de vochtige kamer, en het hoofd van de scan. Als gebruikt, verplaatst de zwarte ondoorzichtig doek rond de Microscoop kamer.
- Controleer of de hersenen op hun oorspronkelijke posities in levende scanmodus. Pas indien nodig.
- Ga naar tijd overname deelvenster en stel het gewenste tijdsinterval en aantal scan. Scan starten.
Opmerking: Hier we getest time-lapse beelden verkregen van elk uur voor maximaal 10 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier, laten we de representatieve resultaten van het langdurige opname van een circadiane fluorescerende verslaggever in ex vivo larvale hersenen cultuur, en de levende imaging resultaten van PDF Bad toepassing op verslaggever expressie.
Non-zwerven L3 larven uiting geven aan de moleculaire klok verslaggever PER-TDT en UAS-mCD8::YFP gedreven door een klok neuron driver Clk (856)-gal4 (Figuur 1 c) werden entrained in LD. Brains werden ontleed en ingesteld voor langetermijnkweek tijdens de laatste licht fase van de LD-cyclus net voorafgaande de donkere fase (figuur 1A en 2B). Time-lapse imaging werd uitgevoerd in DD en hersenen explantaten werden elke 2 h voor 64 h beeld. Een som-stapel met het neuron van belang is gemaakt en de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de oppervlakte die overeenkomt met het neuron werd gemeten na achtergrond aftrekken8. Om te bepalen rhythmicity van de verslaggever expressie, waren zowel maximale entropie spectrale analyse (MESA) en handmatige inspectie gebruikte8. Twee DN2s die weer circadiane ritmen met een periode van ~ 26 h in PER-TDT niveaus worden hier gepresenteerd (figuur 2Aen 2 C, film 1).
Met behulp van in wezen dezelfde cultuur instellingen (figuur 1B), werd het effect van de neuropeptide PDF op de expressie van PER-TDT bestudeerd. De hersenen van niet-zwerven larven van de dezelfde genotype zoals hierboven beschreven werden ontleed hetzij op ZT1 (Zeitgeiber tijd 1, 1 h na lichten op in LD) of ZT13 (1 h na de lichten uit). De flesjes met larven werden onmiddellijk gekoeld op ijs nadat de incubator onttrokken. Op ZT13, werden ook de flesjes verpakt in aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling van de blauw-licht. De hersendissectie werd uitgevoerd op ijs en ontleed hersenen werden gehouden op het ijs. De hersenen op ZT13 genomen waren bedekt met aluminiumfolie waar mogelijk. Dus, hoewel deze procedure werd uitgevoerd in het lab verlicht met natuurlijk licht, de gevolgen van blootstelling aan licht voor macromoleculaire synthese en metabolisme was minimaal. De hersenen zijn gescand tweemaal met 1 h interval om de basislijngegevens. PDF of voertuig (DMSO) is toegevoegd aan het kweekmedium en time-lapse beelden werden verkregen elke 1 h voor latere 6 h. PER-TDT expressie profiel vertoont een stijging van-dag-tijdafhankelijke in intensiteit van de fluorescentie op PDF toevoeging op ZT13 in de LNvs en DN1s, en een mindere mate op het DN2s (Figuur 3)8.
Deze resultaten wijzen erop dat de beeldvormende techniek en de hier beschreven methode van cultuur de opname van PER-TDT ritmes bij eencellige resolutie zonder merkbaar fototoxiciteit, photobleaching of focus drift ingeschakeld.
Opmerking: Afbeeldingen werden geanalyseerd en verwerkt met behulp van Fiji28. 10 X iteratieve deconvolutie werd uitgevoerd met AutoQuant en Imaris. Kleine afwijkingen in de time-lapse beelden werden gecorrigeerd met de juiste 3D drift plugin voor ImageJ.
Figuur 1: Anatomie van klok neuronen in de L3 larvale brein en hersenen explant cultuur setup. (A en B) Schema van de hersenen cultuur setup voor lange termijn imaging (A) en voor farmacologische testen met korte imaging (B). Sub a, werd vacuüm vet (geel) toegepast op het plastic deel van de glazen bodem schotel te koppelen van de PTFE-membraan. (C) een representatief beeld van een LD-entrained L3 larvale hersenen op ZT2. De uitdrukking van de moleculaire klok verslaggever PER-TDT (magenta) is zichtbaar in klok neuronen, die worden aangeduid door UAS-mCD8::YFP(green) gedreven door Clk (856)-gal4. Er zijn 3 groepen van gedifferentieerde klok neuronen in L3: 5 LNvs (met inbegrip van de 5e LNv, die niet PDF uitdrukken doet), 2 DN1s en 2 DN2s, aangegeven door witte pijlpunten. Opmerking de expressie van PER-TDT in de kernen van klok neuronen. YFP-negatieve PER-TDT-positieve cellen zijn glia en andere deelgroep van klok neuronen die zijn nog in ontwikkeling. Schaal bar = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve resultaten van langdurig leven beeldvorming van larvale klok neuronen. (A) vergroot weergave van DN2s van de lange termijn time-lapse beeldvorming van een gekweekte hersenen. Hersenen explantaten waren bereid uit de larven van de LD-entrained L3 ontleed in ZT11. Beelden werden genomen elke 2 h vanaf CT17 (circadiane tijd 17, 5 h na subjectieve lichten uit in DD) voor 64 h in DD. Merged beelden van PER-TDT (magenta) en UAS-mCD8::YFP gedreven door Clk (856)-gal4 (groen) zijn aan de linkerkant van elke plaat en PER-TDT niveaus weergegeven als heatmap met blauwe kleurovergang worden aan de rechterkant. Schaal bar = 10 µm. Voor alleen vertegenwoordiging, werden beelden verwerkt met 3D-correctie drift en een 10 X iteratieve deconvolutie. (B) Timing van het experiment. (C) grafiek vertegenwoordigen de relatieve fluorescentie intensiteit genormaliseerd op t = 0 van twee DN2s (blauw en rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve resultaten voor live-imaging voor farmacologische experimenten. LD-entrained larvale hersenen waren ontleed en gemonteerd op ZT1 of ZT13 en PDF (2 µM) of DMSO werd toegepast op de ZT2 of ZT14. PER-TDT expressie in hersenen explantaten werd ieder uur gecontroleerd door time-lapse microscopie. Gemiddelde fluorescentie intensiteit ± SEM genormaliseerd naar de waarde aan het begin van de imaging (overeenkomend met ZT1 of ZT13) wordt weergegeven. Rode pijlen geven de PDF of voertuig toepassing (ZT2 of ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001 en *** p < 0,0001 door two-way ANOVA met Sidak de correctie voor meerdere vergelijkingen. Een minimum van 32 LNvs, 18 DN1s en 16 DN2s werden geanalyseerd voor elk gegevenspunt. Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: lange termijn live beeldvorming van larvale DN2 klok neuronen. Time-lapse film van gekweekte larvale hersenen ontleed bij ZT11 en beeld in DD. Magnified uitzicht op de DN2s in een enkele halfrond uiting van PER-TDT en UAS-mCD8::YFP gedreven door Clk (856)-gal4 worden weergegeven. Beelden werden verkregen elke 2 h voor 64 h. PER-TDT (magenta) en YFP (groen) zijn aan de linkerkant en PER-TDT niveaus vertegenwoordigd als een heatmap (blauwe kleurovergang) zijn op het recht. Schaal bar = 10 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Stappen | Reagentia | Concentratie |
| 1. Meng reagentia. | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1.05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glucose | 2 mg/ml | |
| Trehalose | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric zuur | 0.35 mg/ml | |
| Fumaarzuur | 60 μg/ml | |
| Appelzuur | 0,6 mg/ml | |
| Barnsteenzuur | 60 μg/ml | |
| Gistextract | 2 mg/ml | |
| FCS niet warmte-geïnactiveerd | 20% | |
| dH2O, gesteriliseerde met autoclaaf | ||
| 2. steriliseren met 0,22 μm filter. | ||
| 3. bebroed in een broedmachine voor cultuur van de cel bij 25 ° C in het donker voor 72 h. Incubator moet verstoken van bacteriële of schimmel verontreiniging. | ||
| 4. Voeg reagentia. | Insuline | 2 μg/ml |
| BIB-Tris pH 6.8, steriliseren met 0,22 μm filter | 5 mM | |
| 5. Breng de pH op 6,8-6,9. | NaOH (10 N) | ~ 8 druppels |
| 6. steriliseren met 0,22 μm filter. | ||
| 7. aliquot tot 5 ml Flash bevriezen in LN2 winkel bij-80 ° C. Gebruik whithin 60 dagen. | ||
| Opmerking: Voor grote volumes, steriliseren met filter top fles door vacuüm, anders gebruik een spuit-filter. Open aliquots in de kap van een cultuur. Eenmalig gebruik. | ||
Tabel 1: bereiding van SAM medium (1 x) voor Drosophila hersenen cultuur. Middellange tot cultuur hersenen explant. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een cultuur kap met uitzondering van de incubatie van het medium.
| Stappen | Reagentia | Concentratie |
| 1. Meng reagentia. | HEPES-KOH, pH 7.4 | 99 mM |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1.7 mM | |
| KH2PO4 | 2.2 mM | |
| Glucose | 33 mM | |
| Sacharose | 438 mM | |
| gesteriliseerde met autoclaaf dH2O | ||
| 2. steriliseren met 0,45 micrometer filter. | ||
| 3. bewaren bij 4 ° C tot 6 maanden. | ||
| Opmerking: Voor experimenteel gebruik: Verdun tot 1 X met gesteriliseerde met autoclaaf dH2O en steriliseren met 0,45 micrometer filter top fles door vacuüm of met filter spuit. Bewaren bij 4° C. Open in de kap van een cultuur, meermalig gebruik. | ||
Tabel 2: voorbereiding van DSS (10 x). Zoutoplossing te ontleden Drosophila hersenen. Bereiden in de kap van een cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we de methode voor de lange termijn fluorescentie time-lapse microscopie van gekweekte larvale hersenen. Het succes van dit soort experimenten hangt van meerdere factoren, zoals de gezondheid van de cultuur, methode voor immobilisatie van de hersenen explant, fluorescentie intensiteit en signaal-/ ruisverhouding van de verslaggever, temporele en ruimtelijke resolutie, en toegankelijkheid van de explant. Deze factoren kunnen uitsluiten. Bijvoorbeeld, verhogen van time-lapse frequentie beïnvloedt de gezondheid van de cultuur en de immobilisatie van de hersenen explant gasuitwisseling kan belemmeren. Dus is vinden een gulden middenweg (geen bedoelde woordspeling) voor de verschijnselen onder studie sleutel tot een succesvolle protocol. De hier beschreven methode is geoptimaliseerd voor het controleren van de expressie van fluorescerende circadiane verslaggevers in de omvang van uren tot dagen. Het is ook van toepassing op het bestuderen van andere onderwerpen in de Drosophila neurobiologie, zolang de kritieke processen worden ongewijzigd en met zorg uitgevoerd.
In dit protocol, zijn hersenen explantaten geïmmobiliseerd in een fibrine clot, waardoor een 3D matrix. Hoewel andere methoden voor immobilisatie bestaan, zoals poly-lysine of laminin coating van het glas van de cover, deze vertragen de ontwikkeling van het larven hersenen29 en dus in gevaar hun fysiologische robuustheid brengen kunnen. Door de aard ervan biedt fibrine een uitstekende-matrix die los genoeg om voedingsstoffen naar de hersenen explant bereiken en plakkerig genoeg is voor de hersenen om dicht bij de glazen cover zonder het te pletten16. Als gevolg van deze voordelen, fibrine clot methode heeft gewerkt in diverse protocollen voor celkweek en hersenen explant cultuur14,17,29,30,31,32 3433, ,. Het is raadzaam een fibrine 3D matrix gebruikt voor larvale hersenen cultuur zelfs voor relatief korte experimenten die meer dan een paar uur duren. Larvale hersenen cultuur zonder 3D matrix geeft grillige resultaten (gegevens niet worden weergegeven), waarschijnlijk als gevolg van het gebrek aan fysieke ondersteuning vereist voor de ontwikkeling van de hersenen.
Het is belangrijk om zorgvuldig observeren de morfologie van de explant en de cellen in het weefsel, vóór en tijdens de time-lapse imaging voor het detecteren van enig teken van nood. In de experimenten die hier gepresenteerd, expressie van de membraan-gebonden mCD8::YFP toonde intact morfologie van de neuronen en PER-TDT werd ontdekt in het cytoplasma en de kern, zoals verwacht, die aangeeft dat de hersenen explant bleef levensvatbare en gezond in de gehele de duur van de beeldvorming. Circadiane rhythmicity werd bestudeerd voor maximaal 72 uur maar we waargenomen dat de hersenen explantaten kunnen worden gekweekt tot maximaal 5 dagen zonder verslechtering functioneert de integriteit van de neuronen en de hersenen (gegevens niet worden weergegeven). Als de neurites dotty worden of de cel lichaam van de neuronen barsten, deze zijn over het algemeen tekenen van fototoxiciteit en gemakkelijk voorkomen door aanpassing van Microscoop instellingen dienovereenkomstig. Bijvoorbeeld, verminder laser macht terwijl het verhogen van de grootte van het gaatje, smart winst en het venster voor detectie. Intensiteit van de fluorescentie van de verslaggever is echter in het algemeen, de beperkende factor voor het verkrijgen van beelden van goede signal-to-noise verhouding zonder hoge intensiteit laser verlichting. Het ontwerp van de verslaggever, de keuze van de fluorophore, en het nummer van de kopie van de verslaggever zijn dus de eerste dingen te overwegen bij het oplossen van de problemen van de levensvatbaarheid. (In de experiment hier gepresenteerd, 4 exemplaren van per-tdt verslaggever werden gebruikt.)
Andere tekens van een cultuur van gecompromitteerde hersenen omvatten het uiteenspatten van een halfrond tijdens time-lapse beeldvorming en verkeer van vloeistof uit de hersenen explant. Dit is waarschijnlijk te wijten aan micro-lekke banden veroorzaakt tijdens de dissectie van de hersenen. Het verwijderen van de imaginaire schijven aangesloten op de larvale hersenen is de belangrijkste bron van lekke banden, dus adviseren wij tegen het.
Het voordeel voor fluorescentie circadiane levende imaging over bioluminescentie imaging is zijn hoge ruimtelijke resolutie. Daarnaast vergemakkelijkt het gemak van het gebruik van cellulaire markeringen samen met de ritme-verslaggever de analyse van celtype specificiteit. Daarentegen heeft de Bioluminescentie superieure temporele resolutie en uitstekende signaal-/ ruisverhouding19,20,21. Totale is aantal fietsen neuronen per hersenen beeld door bioluminescentie echter niet superieur ten opzichte van het aantal verkregen met onze methode8,19,21. In de meeste gevallen worden de ritmes van de fluorescerende verslaggevers met onze methode ontdekt gesynchroniseerd binnen hetzelfde cluster van klok neuronen (Zie figuur 2C), zoals met bioluminescentie19. Fase verschillen tussen klok neuron clusters werden waargenomen in zowel fluorescentie en bioluminescentie circadiane imaging8,19,21. Daarom zowel methodologieën in het observeren van circadiane ritmen in gekweekte hersenen even geldig zijn, en de keuze tussen bloeien en bioluminescentie dient te geschieden volgens het doel van de studie.
De belangrijkste technische moeilijkheid van deze methode is in de insluiten stap. Omdat het protocol confocal imaging fast-scannen met een omgekeerde Microscoop verlangt en verstrooiing van licht in het hersenweefsel de fluorescentie-detectie, vermindert vooral wanneer beeldvorming diep in het weefsel, hersenen explantaten gemonteerd moeten worden zo dicht mogelijk aan het glas van de cover. De reproduceerbaarheid van de resultaten van beeldvorming is bovendien afhankelijk van de consistentie van de z-posities van neuronen van belangen. Daarom is het belangrijk te oriënteren en mount hersenen altijd op dezelfde manier, waarin praktijk. Om het imago van neuronale clusters gelegen in anatomisch verschillende posities, kan het vereist voor het uitvoeren van afzonderlijke experimenten met verschillende hersenen explant oriëntatie. Er zijn alternatieve methoden voor diep-weefsel levende imaging waarvoor geen kweken van het weefsel, zoals door twee-foton microscopie en lichte blad microscopie. De laatste is met succes gebruikt om beeld circadiane calcium dynamiek in levende Drosophila hersenen-22,23. Echter, licht blad microscopie heeft lagere ruimtelijke resolutie dan confocale microscopie en de toepassing ervan op de beeldvorming bij eencellige resolutie blijft dus een uitdaging.
Kortom combineert dit protocol een eenvoudig cultuur systeem van larvale hersenen explantaten onder voorwaarden die ondersteuning bieden voor time-lapse Beeldacquisitie van fluorescerende verslaggevers over dagen en kwantitatieve analyse van biologische ritmes. Hoewel er bepaalde beperkingen zoals hierboven besproken, kan de methodologie worden aangepast aan de verschillende verslaggevers afbeelding in larvale en volwassen Drosophila hersenen en verder gewijzigd om gevoeligheid en ruimtelijke resolutie te verhogen. Bijvoorbeeld, axonale projecties ligt diep in de hersenen of vesiculaire vervoer mogelijk aantoonbaar door het combineren van onze hersenen explant cultuur techniek met twee-foton microscopie35. Dat gezegd zijnde, het is nog steeds mogelijk om uit te voeren van live-imaging van organellen, zoals mitochondriën in volwassen hersenen explants met behulp van dit protocol (gegevens niet worden weergegeven). Wij ook de variatie van dit protocol voor Bad toepassing van experimentele oplossing gepresenteerd in farmacologische testen. Men kan dit protocol voor het uitvoeren van "pulse-chase" experimenten door handmatig vervangen het kweekmedium aan het wassen van de drug of met behulp van een perfusie kamer18,36uitbreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Michael Rosbash voor zijn mentorschap en ondersteuning tijdens de eerste fase van de ontwikkeling van deze methode. Dit werk werd gefinancierd door het JST PRESTO programma, de Swiss National Science Foundation (31003A_149893 en 31003A_169548), de European Research Council (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-biomedisch onderzoek (13A39) en de Universiteit van Genève .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
