Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.
Abstract
Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung orchestriert rhythmische Verhaltens- und physiologischen Ausgänge mit ökologischen Hinweise, wie Tag/Nacht-Zyklen abgestimmt. Die molekulare Uhr innerhalb jedes Neuron Herzschrittmacher erzeugt zirkadianen Rhythmen in der Genexpression, die die rhythmischen neuronalen Funktionen wesentlich für den Betrieb der Schaltung zugrunde liegen. Untersuchung der Eigenschaften der einzelnen molekulare Oszillatoren in verschiedenen Unterklassen der Herzschrittmacher Neuronen und deren Zusammenspiel mit neuronalen Signal ergibt ein besseres Verständnis der zirkadianen Schrittmacher-Schaltung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um die molekularen Uhrwerk in Uhr Neuronen des kultivierten Drosophila Larven Gehirn zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die mehrtägige Aufzeichnung von den Rhythmen der genetisch codierten fluoreszierende circadiane Reporter bei einzelligen Auflösung. Dieses Setup ist kombinierbar mit pharmakologische Manipulationen zu Echtzeit-Reaktion der molekularen Uhr zu verschiedenen Verbindungen genau analysieren. Über zirkadianen Rhythmen bietet diese multifunktionale Methode in Kombination mit leistungsstarken Drosophila genetische Techniken die Möglichkeit verschiedene neuronale oder molekulare Prozesse in live Hirngewebe zu studieren.
Introduction
Zirkadiane Uhren helfen Organismen zur Anpassung an die periodischen Veränderungen der Umwelt durch die 24-Stunden-Rotation der Erde erzeugt. Interlock transkriptionelle translationale Rückkopplungsschleifen unterliegen häufig der molekulare Maschinerie der zirkadianen Taktgeber über Arten1. Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung, bestehend aus Uhr-haltigen Neuronen integriert-Uhrzeit-Informationen vermittelt durch die Umwelt-Signale, wie hell/dunkel (LD) und Temperaturzyklen, die Rhythmen von einer Vielzahl von täglich zu orchestrieren physiologischen und Verhaltensstörungen Prozesse2,3. Die Koordinierung der molekularen Rhythmen mit neuronalen ein- und Ausgängen ist von entscheidender Bedeutung für den Betrieb der circadianen Schaltung aber bleibt nur teilweise verstanden.
Das Herzstück der molekularen Uhr aktiviert TAKTZYKLUS (CLK/CYC) Heterodimer in Drosophila, die Transkription von Zeit (pro) und zeitlos (Tim). V. und TIM bilden einen Komplex und geben Sie den Zellkern, wo sie transkriptionelle Aktivität der CLK/CYC und somit ihren eigenen Transkription hemmen. Posttranskriptionale und post-translationalen Vorschriften verursachen Verzögerungen zwischen CLK/CYC-vermittelten Transkription und Unterdrückung durch v. / TIM, Sicherstellung der Generation von ca. 24 h molekulare Schwingungen1,3,4 . Etwa 150 Neuronen, die diese molekulare Uhren-Formular enthält fliegt eine Schaltung zur Kontrolle circadiane Verhalten der Erwachsenen5. Eine viel einfachere und dennoch voll funktionsfähige circadiane Schaltung bestehend aus 3 Gruppen von Neuronen Uhr - 5 ventralen lateralen Neuronen (LNvs; 4 PDF-Positive LNvs und ein PDF-Negative LNv, siehe unten), 2 dorsalen Neuron 1 s (DN1s) und 2 dorsalen Neuron 2 s (DN2s) - ist in der Larven Gehirn6,7.
Die einfache Larven circadiane Schaltung bietet ein hervorragendes Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Inter neuronale Kommunikation und das molekulare Uhrwerk. Mit unserer neu entwickelten fluoreszierende Reporter pro-TDT, die das Niveau der pro Protein und seine subzelluläre Lage imitiert, haben wir versucht, die Dynamik des molekularen Uhrwerks in verschiedenen Uhr Neuron Untergruppen in der Larven circadiane Schaltung charakterisieren 8. Darüber hinaus wollten wir wissen, die Schlüsselrolle von Neuropeptid Pigment dispersing Factor (PDF) produziert von 4 LNvs bei der Regulierung der zirkadianen Rhythmen auf der neuronalen Ebene9,10,11, untersuchen Sie den direkten Wirkung von PDF auf molekularen Uhren. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode, um die circadiane Genexpression überwachen Rhythmen im Larvenstadium Gehirn über mehrere Tage durch Time-Lapse confocal Mikroskopie explant entwickelt. Das Protokoll wurde auch für pharmakologische Tests, testen Sie die Wirkung von PDF- oder andere Verbindungen auf das Niveau der pro-TDT angepasst. Somit besteht die Anpassung der Zugänglichmachung der Gehirn Explant Kultur zu Drug Application, Zeitauflösung und imaging für eine kürzere Dauer.
Ex-Vivo -Kultur von Drosophila Gehirne von unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden vorher festgelegten12,13,14,15,16,17 ,18. Während diese Protokolle für verschiedene biologische Phänomene-Bildgebung verwendet wurden, einige von ihnen sind nicht kompatibel mit Bildgebung bei einzelligen Auflösung oder unterstützen die Kultur nicht mehr als ein paar Stunden. Alternative Methoden, um langfristige live Darstellung der circadianen Neuronen in Drosophila durchzuführen sind Biolumineszenz Bildgebung von molekularen Rhythmen19,20,21 und Fluoreszenz-Bildgebung des Kalzium-Anzeige mit Licht Merkblatt Mikroskopie22,23. Obwohl Biolumineszenz Bildgebung höheren zeitlichen Auflösung erreichen und Lichtblattmikroskopie für in-Vivo Bildgebung anpassungsfähig sein kann, sie sind begrenzt auf die räumliche Auflösung und erfordern spezialisierte Mikroskopsystemen.
Die hier beschriebene Methode ist zugeschnitten auf um fluoreszierende Signale in der Gesamt-Hirn Kultur bei einzelligen Auflösung über mehrere Tage zu visualisieren. Diese einfache und vielseitige Methode könnte Bild kultiviert Erwachsenen fliegen Köpfe und für pharmakologische Experimente zur Untersuchung viele verschiedene Probleme in Drosophila Neurobiologie angepasst werden.
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Protocol
1. Vorbereitung der Stammlösungen unter einem Kultur-Haube
- Bereiten Sie 400 mL 1 x Schneider aktives Medium (SAM) optimiert für ex-Vivo -Kultur der Larven Gehirne (geändert von Referenz-24,-25) (Tabelle 1). Aliquot 5 mL und Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2), Lagerung bei - 80 ° C.
- Bereiten Sie 1 x Dissecting Kochsalzlösung (DSS) durch Verdünnung 10-fach-Stammlösung (geändert von Referenz-26) (Tabelle 2).
- Aliquoten Fibrinogen, 10 mg und bei 4 ° C für den einmaligen Gebrauch.
Achtung: Wiegen Sie Fibrinogen unter Laminar-Flow, mit Handschuhen, da es schädlich ist. - Thrombin-Stammlösung in SAM vorbereiten (1500 NIH Einheit/mg) und Aliquoten, 10 µL, Blitz in LN2 Einfrieren und halten bei-80 ° C.
Achtung: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Thrombin als schädlich gilt. - Aliquoten Stammlösung von 100 x Penicillin-Streptomycin. Halten Sie bei-20 ° C.
- Schneiden Sie Kreise aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran (siehe Materialtabelle) auf die Größe, die das Innere einer Glasschale unten passt. Spülen Sie sie in 70 % EtOH und dann in den Autoklaven dH2O. entkeimen und trocken unter Laminar-Flow mit UV. Halten Sie in eine sterile Petrischale. Einmaligen Gebrauch.
Hinweis: PTFE ist eine poröse flexible Membran, die Gasaustausch ermöglicht und verhindert, dass Medium verdampfen während Langzeitaufzeichnung.
2. Time-Lapse Mikroskopie-Setup
Hinweis: Die folgende Konfiguration ist für ein Tandem Scanner invertiert confocal Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit einem Resonanz-Scanner (8.000 Hz) ausgestattet. Das System beinhaltet einen hochempfindliche Photomultiplier-Detektor, der zusammen mit der Resonanz-Scanner Phototoxizität und Immunofluoreszenz verhindert. Temperatur und Luftfeuchtigkeit kontrolliert in einer Klimakammer Mikroskop (siehe Materialtabelle), das deckt den Großteil des Mikroskops.
- Legen Sie eine Bühne-Top feuchte Kammer.
- Schalten Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu equilibrate die Mikroskop Kammer bis 25 ° C und 80 % Luftfeuchtigkeit Controller.
- Zum Durchführen von Experimenten in ständige Dunkelheit (DD) decken Sie die Mikroskop-Klimakammer mit einem undurchsichtigen Tuch (es sei denn, die Mikroskop Kammer aus lichtundurchlässigem Material besteht).
- Wenn ein Eintauchen in Wasser Ziel verwenden, positionieren Sie einen Wasserspender Immersion Micro auf das Ziel und Programm ein Protokoll mit der Autoimmersion-Ziel-Controller-Software um Wasser mit einer konstanten Rate während der Time-Lapse Bildgebung zu verzichten.
Hinweis: Eintauchen in Wasser Ziele zusammen mit einem Wasserspender oder trockenen Objektiv sind für langfristige live Imaging, empfohlen, da andere Art von Medium eintauchen austrocknen würde. - Platzhalter eine Petrischale auf der Bühne, in die feuchte Kammer.
- Starten Sie die Mikroskop-Software, und wählen Sie den resonanten Scanner-Modus aus der ersten Dialogbox. Wählen Sie "OK" auf die Bühne, wenn Sie aufgefordert werden zu initialisieren. Gehen Sie zur Registerkarte "Konfiguration", Hardware-Konfiguration auf die relevanten Laserlinien wechseln.
- Gehen Sie zur Registerkarte "Acquire" und XY-Panel bidirektionalen Modus auswählen und einstellen Bild Aufnahmeparameter.
Hinweis: Das beschriebene bildgebende Setup hier vorgestellten ( Film 1,Abbildung 2und Abbildung 3 ) ist optimiert für zirkadianen Ausdruck der spezifischen fluoreszierenden Reporter zu beobachten. Die folgenden Parameter wurden ausgewählt, um unseren Anforderungen am besten passen: 40 X Wasser eintauchen Ziel, 8 X Line Durchschnitt mit 512 × 512 Auflösung. Für mehrfarbige Bildgebung, fortlaufende Bildaufnahme ist erforderlich, wenn die Emissionswellenlänge von einem Fluorophor und die Erregung Wellenlänge eine andere Überlappung (hier: Wellenlängen gelb fluoreszierende Protein (YFP) Emission und Tomate Erregung Überlappung). Wählen Sie die sequenziellen Modus "zwischen den Stapel", wie es die schnellste ist und die Bewegung der Uhr Neuronen ist beim Erwerb eines Z-Stack zu vernachlässigen. Mikroskopie-Einstellungen sollten an das Ziel, jedes Experiment angepasst werden.
3. Setup der Larven Gehirn Explant Kultur
Hinweis: Die ganze Prozedur von Dissektion zur Einbettung des Gehirns Explantaten dauert ca. 30 min.
-
Vorbereitung der Reagenzien unter einem Kultur-Haube.
- Tauen Sie ein Aliquot von Thrombin auf und bei Zimmertemperatur aufbewahren Sie, bis der einbettenden Schritt (Schritt 3.3). Einmaligen Gebrauch.
- Tauen Sie schnell eine Aliquote von SAM bei 37 ° C und halten Sie auf dem Eis für den einmaligen Gebrauch.
- Eine 10 mg aliquoten von Fibrinogen, 10 mg/mL SAM hinzufügen, wechseln Sie sanft und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten und während der einbettenden Schritt (Schritt 3.3). Einmaligen Gebrauch.
Hinweis: Inkubieren Sie nicht, die Fibrinogen-Lösung mehr als 2 h, wie es beginnt zu polymerisieren. - Eine aliquote 100 X Lager Penicillin-Streptomycin Auftauen. Bereiten Sie 2,5 mL von SAM mit 1 x Penicillin-Streptomycin (SAM/Antibiotika). Bei Zimmertemperatur aufbewahren.
Hinweis: Laden die restlichen 100 X Lager Penicillin-Streptomycin bei 4 ° C bis zu 1 Monat. - Bereiten Sie eine Aliquote von 500 µL aus der verbleibenden SAM. Halten Sie auf dem Eis.
- Für langfristige Belichtung einfetten autoklaviert Vakuum das Kunststoffteil der Unterseite der unteren Glasschale (Abbildung 1A) und unter Laminar-Flow mit UV-Sterilisation.
-
Dissektion des zentralen Nervensystems und ventraler Nervenstrang.
- Reinigen Sie die Zange und 2 x drei-Well Dissektion Glasschalen mit 70 % EtOH. Gießen Sie 400 µL des DSS in 4 Vertiefungen und 400 µL von SAM in einen Brunnen. Halten Sie auf dem Eis.
- Fliege Larven-haltigem Medium aushöhlen Sie und wählen Sie nicht wandern 3. Instar Larven (L3) mit der Pinzette. Spülen Sie sie nacheinander in 2 DSS gefüllten Brunnen. Halten sie in der 3. DSS gefüllten Brunnen auf Eis, das die Larven anesthetizes.
Hinweis: L3 dauert ca. 2 Tage bei 25 ° C. Das Gehirn in physiologisch relevanten Zeitrahmen zu beobachten, die wir nicht wandern L3 Larven verwenden. Andere Untergruppen von Uhr Neuronen, wie l-LNvs und DN3s, beginnen, auf Wanderschaft L3-Stadium gebildet werden, aber sie noch nicht unbedingt Radfahren (Daten nicht gezeigt). Daher, obwohl es möglich, Bild ist unbedingt Uhr Neuronen in diesem Stadium (Daten nicht gezeigt) Radfahren, sorgfältig die Larven bereits funktionale Uhr Neuronen unterscheiden Entwicklungsländer für die Datenanalyse. Non-wandering L3 erscheinen ca. 4 bis 4,5 Tage nach Eiablage bei 25 ° C. Um dieses Protokoll verwenden für das Studium der zirkadianen Rhythmen, synchronisieren (verladen) entwickelnden Larven in 12 h/12 h LD Zyklen bei 25 ° C für 3 Tage vor dem L3 Larven sammeln. - Sezieren Sie Larven Gehirne mit feinen Pinzette im 4. DSS gefüllten Brunnen, die nicht zum Spülen Larven, mit Hilfe der Inside-out-Methode27verwendet wurde.
- Kurz, geschnitten Sie die Larve in zwei Teile, sanft Kneifen Sie die Mund-Haken mit ein paar Zangen und Rollen Sie Inside-out auf-die Körperwand über das andere paar der Zange, damit das Gehirn aussetzen. Kostenlos das Gehirn durch das Ausschneiden der Luftröhre und Nerven, die es mit dem Rest des Körpers zu befestigen.
- Das Gehirn in etwa 3 µL des DSS mit einer 20 µL Pipette (vorher gespült mit DSS) Aspirieren und in der SAM-gefüllte gut verzichten. Wiederholen Sie den Vorgang für bis zu 7 Gehirne.
Hinweis: Dissektion sollte durchgeführt werden, auf eine kalte Oberfläche, die Larven betäubt und das Gehirn gekühlt zu halten. Zum Beispiel legen Sie die Dissektion Gericht auf ein Kühlblock, verbunden mit einer Pumpe Eis gekühltes Wasser zirkulieren. Die Dissektion Verfahren dauert ~ 30 s pro Gehirn. Es ist wichtig, die Augen/Riechzentrum imaginalen Scheiben befestigt die Gehirne und die ventrale Nerv Schnur intakt zu halten. Diese Teile abreißen schädigen das Gehirn und verringern die Qualität der Kultur. Vermeiden Sie auch die Gehirne der Luft auszusetzen. Vor der ersten Gehirn, Pipette auf und ab des DSS mit Teilen der sezierten Larven Absaugen verhindert als es die Köpfe an der Wand der Spitze.
-
Einbettung des Gehirns Explantaten in einer 3D Matrix und Montage (~ 20 min).
- Tauchen Sie ein seziert Gehirn in Fibrinogen Arbeitslösung (Fibrinogen Endkonzentration ~3.3 mg/mL, 10,5 µL pro Gehirn) wie folgt:
- Aspirieren Sie 3,5 µL von SAM/Antibiotika (mit der gleichen Spitze verwendet in Abschnitt 3.2.3). Aspirieren Sie seziert Gehirn aus der Dissektion in die gleichen Pipettenspitze ohne Verzicht auf das SAM/Antibiotika-Medium in der Spitze.
- Das Gehirn und das Medium, auf dem Deckel eine sterile Petrischale zu verzichten. Fügen Sie eine weitere 3,5 µL von SAM/Antibiotika und 3,5 µL warm Fibrinogen/SAM 10 mg/mL Lösung auf den Tropfen, die das Gehirn enthält. Mischen Sie die Lösung um das Gehirn durch Pipettieren mit einer Pipettenspitze 20 µL vorsichtig.
Hinweis: Mit Hilfe einer Pipette als Zange in diesem Schritt wird vermieden, betonend, dass das Gehirn. - Nehmen Sie 2 µL der Arbeitslösung Fibrinogen aus dem Drop- und wenden Sie es auf das Deckglas des unteren Glasschale als kleiner Kreis. 0,8 µL von Thrombin und mischen Sie sehr schnell mit einer Pipettenspitze. Das Fibrinogen in Fibrin umgewandelt und beginnt zu polymerisieren.
- Nehmen Sie das Gehirn, das in dem Fibrinogen arbeiten Lösung (Schritt 3.3.1) zwischen einem Paar von Zange sitzt und positionieren Sie es an die Matrix, sobald eine weiße Fibrin-Matrix sichtbar ist. Richten Sie die Gehirn anterioren Seite nach unten (für imaging-Uhr Neuronen). Schieben sie so nah wie möglich an das Deckglas. Fibrin-Gerinnsel besteht aus Schichten von Fibrin. Wählen Sie eine Ebene und Falten Sie es oben auf das Gehirn mit kleinen und sanften Bewegungen ohne Abnehmen der Matrix.
- Wiederholen Sie 2-bis 3-Mal aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels, das Gehirn zu stabilisieren.
Hinweis: Beim Umgang mit des Gehirns mit der Pinzette seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen oder eine körperliche Belastung zu verhängen.
- Wiederholen Sie 2-bis 3-Mal aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels, das Gehirn zu stabilisieren.
- Fügen Sie 20 µL von SAM/Antibiotika auf das eingebettete Gehirn, um die Aktion von Thrombin zu stoppen.
- Wiederholen Sie den Vorgang um die verbleibenden Gehirne zu montieren. Es ist möglich, bis zu 5 bis 6 Köpfe auf einer Glasschale unten einzubetten.
- Fügen Sie für langfristige live Imaging 600 µL von SAM/Antibiotika im Inneren Brunnen (das Glasteil hinzu). Positionieren Sie eine vorgeschnittene PTFE-Membran auf das Medium zu und kleben Sie es auf das Vakuum Fett auf das Kunststoffteil des Bodens (3.1.5) (Abbildung 1A) angewendet.
- Füllen Sie für pharmakologische Tests die Schale mit 2 mL von SAM/Antibiotika (Abbildung 1 b).
Hinweis: Es ist sehr wichtig um Verdunstung des Mediums zu vermeiden, die Osmolalität des Mediums ist kritisch für die Lebensfähigkeit der Neuronen. Daher ist es für langfristige bildgebende Untersuchungen notwendig, der Kulturschale mit PTFE-Membran zu versiegeln. Während für kurzfristige Experimente Abdichtung Membran nicht erforderlich, solange das Gericht ist mit 2 mL Medium gefüllt und in eine feuchte Kammer überwacht.
(4) Zeitraffer Bildaufnahme
- Legen Sie unten Glasschale auf der Petrischale Inhaber innerhalb der Bühne-Top feuchte Kammer.
- Rufen Sie Z-StackPanel-Element in der Registerkarte "Acquire" und legen Sie die Z-Abschnitt Schritte aus der Mikroskop-Software (2 µm × ~ 40 in den Experimenten, dargestellt in Abbildung 2 und Abbildung 3und Film 1). Beginn des Z-Stapel auf das Flugzeug am weitesten von dem Deckglas und das Ende an der Oberfläche des Gehirns Explant, in der Nähe des Deckglases festgelegt. Obwohl Gehirn Bewegungen sind vernachlässigbar, fügen Sie zusätzliche Z-Profile am Anfang und Ende der Z-Stapel.
- Rufen Sie markieren & Panel und Set-up Multipositionslenker Bildaufnahme zu finden. Mit einem 40 X Objektiv kann 1 Gehirnhälfte innerhalb eines Gesichtsfeldes erfasst werden
- Zum Erwerb Modus Panel und wählen Sie Xyzt (Z-Stack Zeitraffer). Gehen Sie zum Erwerb Panel und die bevorzugte Zeit Intervall und Frequenz-Parameter eingestellt.
Hinweis: Erwerben Sie Zeitraffer Bilder mit der gewünschten Frequenz. Beachten Sie, dass langfristige live Bildgebung (24-72 h) mit Zeitraffer Zeitintervall kürzer als 2 h neigt, Ergebnisse in weniger Radsport Neuronen dazu, wahrscheinlich, weil es die Lebensfähigkeit der Neuronen reduziert. Das Datenvolumen wird erweitert, als die Rate der Bild Akquisition erhöht, die Datenanalyse und Lagerung schwieriger macht.
5. pharmakologische Behandlung des Gehirns Explantaten mit kurzfristigen Live Imaging
Hinweis: Die folgende Prozedur ist im Wesentlichen identisch mit dem für die langfristige Bildgebung aber erfordert keine PTFE-Membran. Um zu vermeiden, setzen die Gehirne um blaues Licht, wenn die Kultur die chemischen hinzugefügt wird, sollte das Mikroskop in den dunklen Raum mit rotem Licht platziert werden.
- Gehen Sie zum Erwerb Panel und legen Sie die gewünschte Zeitintervall und die Anzahl der Scan die Baseline-Daten vor der Droge Anwendung zu erhalten. Starten Sie Scan.
- Nach der Baseline Scan abgeschlossen ist, heben Sie die Scan-Kopf des Mikroskop-Systems. Entfernen Sie den Deckel von der Bühne-Top Feuchtigkeitsregler und sehr vorsichtig den Deckel des unteren Glasschale ohne es zu bewegen.
- Entfernen Sie die entsprechende Menge an Kulturmedium, falls notwendig. Die experimentelle Lösung in das Medium hinzufügen und sorgfältig und sehr vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette ohne Gehirn Explantaten mischen.
Hinweis: Für Bad Anwendung der PDF-Datei, verwenden Sie 2 µM PDF-Stammlösung (in 10 % DMSO). - Ersetzen Sie die Deckel der unteren Glasschale und die feuchte Kammer und die Scan-Kopf. Verwenden, positionieren Sie die schwarze undurchsichtige Tuch um die Mikroskop-Kammer.
- Überprüfen Sie, ob die Gehirne auf ihre ursprünglichen Positionen im live-Bild-Modus sind. Passen Sie bei Bedarf.
- Gehen Sie zum Erwerb Panel und legen Sie die gewünschte Zeitintervall und die Anzahl der Scan. Starten Sie Scan.
Hinweis: Hier haben wir jede Stunde für bis zu 10 h Zeitraffer Aufnahmen getestet.
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Representative Results
Hier zeigen wir die repräsentativen Ergebnisse der langfristigen Aufnahme eines circadianen fluoreszierende Reporter in ex Vivo Larven Gehirn Kultur und bildgebenden Liveergebnisse PDF Bad Anwendung auf Reporter Ausdruck.
Non-wandering L3-Larven Ausdruck der molekularen Uhr Reporter pro-TDT und FH-mCD8::YFP, angetrieben von einem Uhr-Neuron-Fahrer Clk 856-gal4 (Abbildung 1) wurden in LD. Brains mitgerissen wurden seziert und für langfristige Kultur während der letzten eingerichtet leichte Phase des LD-Zyklus kurz vor der dunklen Phase (Abbildung 1A und 2 b). Time-Lapse Bildgebung erfolgte in DD und Gehirn Explantate wurden alle 2 h für 64 h abgebildet. Ein Summe-Stack enthält das Neuron von Interesse entstand und die mittlere Fluoreszenzintensität des Bereichs entspricht das Neuron nach Hintergrund Subtraktion8gemessen wurde. Um Rhythmik des Reporter-Ausdrucks zu ermitteln, wurden maximale Entropie spektrale Analyse (MESA) und manuelle Inspektion verwendeten8. Zwei DN2s, die zirkadianen Rhythmen mit einer Periode von Anzeigen ~ 26 h in Prozent-TDT Ebenen werden hier vorgestellt (Abb. 2A, 2 C und Film 1).
Verwenden im Wesentlichen die gleiche Kultur Setup (Abbildung 1 b), wurde die Wirkung von Neuropeptid PDF auf die Expression von pro-TDT untersucht. Die Gehirne von nicht-wandernden Larven des gleichen Genotyps wie oben beschrieben zerlegt wurden entweder am ZT1 (Zeitgeiber Time 1, 1 h nach leuchtet in LD) oder ZT13 (1 h nach Licht aus). Die Ampullen mit Larven wurden sofort gekühlt auf Eis, nachdem aus dem Inkubator genommen. Bei ZT13 wurden die Fläschchen auch in Alu-Folie, blau-Licht Exposition zu vermeiden verpackt. Das Gehirn sezieren erfolgte auf dem Eis und seziert Gehirne wurden auf Eis gehalten. Die Gehirne auf ZT13 getroffen wurden mit Alu-Folie möglichst bedeckt. Obwohl dieses Verfahren im Labor mit natürlichem Licht beleuchtet durchgeführt wurde, war die Wirkung der Belichtung auf die makromolekulare Synthese und Metabolismus minimale. Die Köpfe wurden zweimal mit 1 h-Intervall zu den Basisdaten gescannt. PDF oder Fahrzeug (DMSO) wurde hinzugefügt, um das Nährmedium und Zeitraffer Bilder erworben wurden jeweils 1 h für nachfolgende 6 h pro-TDT Expressionsprofil zeigte einen Anstieg von-Tag-zeitabhängige Fluoreszenzintensität nach PDF-Zusatz bei ZT13 in der LNvs und DN1s und zu einer geringerem Maße auf die DN2s (Abbildung 3)8.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die bildgebendes Verfahren und die Kultur hier beschriebene Methode die Aufnahme von pro-TDT Rhythmen bei einzelligen Auflösung ohne spürbare Phototoxizität, Immunofluoreszenz oder Fokus Drift aktiviert.
Hinweis: Bilder wurden analysiert und mit Fidschi28verarbeitet. 10 X iterative Dekonvolution wurde mit AutoQuant und Imaris durchgeführt. Geringfügige Abweichungen im Zeitraffer-Bilder wurden mit richtigen 3D Drift Plugin von ImageJ korrigiert.
Abbildung 1: Anatomie der Uhr Neuronen in die L3 Larven Gehirn und das Gehirn Explant Kultur Setup. (A und (B) Schaltpläne des Gehirns Kultur Setups für langfristige Bildgebung (A) und für pharmakologische Tests mit kurzfristigen imaging (B). In (A) wurde auf das Kunststoffteil des unteren Glasschale anfügen die PTFE-Membran Vakuum Fett (gelb) angewendet. (C) ein repräsentatives Bild eines LD mitgerissen L3 Larven Gehirns bei ZT2. Der Ausdruck von der molekularen Uhr Reporter pro-TDT (Magenta) ist sichtbar in Uhr Neuronen, die durch UAS-mCD8::YFP(green) angetrieben von Clk 856-gal4beschriftet sind. Es gibt 3 Gruppen von differenzierten Uhr Neuronen in L3: 5 LNvs (einschließlich der 5. LNv, die nicht die PDF-Datei zum Ausdruck bringt), 2 DN1s und 2 DN2s, gekennzeichnet durch weiße Pfeilspitzen. Beachten Sie den Ausdruck des pro-TDT in den Kernen der Uhr Neuronen. YFP-Negative pro-TDT-positiven Zellen sind Glia und andere Untergruppe der Uhr Neuronen, die noch in der Entwicklung sind. Maßstabsleiste = 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse einer langfristigen Leben Bildgebung von Larven Uhr Neuronen. (A) vergrößert die Ansicht des DN2s aus der langfristige Zeitraffer Bildgebung des Gehirns, kultivierten. Gehirn-Explantaten wurden aus der LD mitgerissen L3-Larven zergliedert an ZT11 vorbereitet. Bilder entnommen wurden alle 2 h CT17 (circadiane Zeit 17, 5 h nach subjektiven Lichter aus in DD) für 64 h in DD. verschmolzen sind Bilder von pro-TDT (Magenta) und FH-mCD8::YFP angetrieben von Clk 856-gal4 (grün) auf der linken Seite jeder Platte und pro-TDT Ebenen dargestellt als Heatmap mit blauen Gradienten sind auf der rechten Seite. Maßstabsleiste = 10 µm. Für die Vertretung nur wurden Bilder mit 3D Korrektur Drift und eine 10 X iterative Dekonvolution verarbeitet. (B) Zeitpunkt des Experiments. (C) Grafik aus der relativen Fluoreszenzintensität normalisiert bei t = 0 von zwei DN2s (blau und rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: repräsentative Ergebnisse live-Imaging für pharmakologische Experimente. LD-mitgerissen Larven Gehirne wurden seziert und montiert am ZT1 oder ZT13 und PDF (2 µM) oder DMSO ZT2 oder ZT14 angewendet wurde. PRO-TDT Ausdruck im Gehirn Explantaten wurde stündlich von Time-Lapse Mikroskopie überwacht. Mittlere Fluoreszenz Intensität ± SEM normiert auf den Wert zu Beginn der Bildgebung (entsprechend ZT1 oder ZT13) wird angezeigt. Rote Pfeile zeigen die Zeit PDF oder Fahrzeug-Anwendung (ZT2 oder ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 und *** p < 0,0001 durch zwei-Wege-ANOVA mit Sidak Korrektur für multiple Vergleiche. Mindestens 32 LNvs, 18 DN1s und 16 DN2s für jeden Datenpunkt analysiert wurden. Diese Zahl wurde von Referenz8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: langfristige live Darstellung der Larven DN2 Uhr Neuronen. Zeitrafferfilm der kultivierten Larven Gehirn seziert an ZT11 und abgebildet in DD Magnified Blick auf die DN2s in einer einzigen Halbkugel Ausdruck pro-TDT und FH-mCD8::YFP angetrieben von Clk 856-gal4 angezeigt werden. Bilder wurden alle 2 h für 64 h. v.-TDT (Magenta) erworben und YFP (grün) sind auf der linken Seite und pro-TDT Ebenen dargestellt als eine Heatmap (blauen Gradienten) sind auf der rechten Seite. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
| Schritte | Reagenzien | Konzentration |
| 1. Mischen Sie Reagenzien. | KH2PO4 | 4,18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| Nahco33 | 0,7 mg/ml | |
| Glukose | 2 mg/ml | |
| Trehalose | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric Säure | 0,35 mg/ml | |
| Fumarsäure | 60 μg/ml | |
| Apfelsäure | 0,6 mg/ml | |
| Bernsteinsäure | 60 μg/ml | |
| Hefeextrakt | 2 mg/ml | |
| NICHT Hitze-inaktivierten FCS | 20 % | |
| dH2O, autoklaviert | ||
| (2) sterilisieren Sie mit 0,22-μm-Filter. | ||
| (3) inkubieren Sie im Brutkasten für Zellkultur bei 25 ° C im Dunkeln für 72 h Inkubator frei von Kontamination bakterielle oder Pilzinfektionen sein muss. | ||
| 4. Fügen Sie Reagenzien. | Insulin | 2 μg/ml |
| BIZ-Tris pH 6.8, Sterilisieren mit 0,22-μm-filter | 5 mM | |
| 5. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 6,9. | NaOH (10 N) | ~ 8 Tropfen |
| (6) sterilisieren Sie mit 0,22-μm-Filter. | ||
| 7. aliquoten bis 5 ml Blitz Einfrieren im LN2-Store bei-80 ° C. Verwenden Sie innerhalb 60 Tagen. | ||
| Hinweis: Für große Mengen Sterilisieren mit Top Filter-Flasche durch Vakuum, ansonsten einen Spritze-Filter verwenden. Offenen aliquoten in eine Kultur-Haube. Einmaligen Gebrauch. | ||
Tabelle 1: Vorbereitung des SAM Mediums (1 X) für Drosophila Gehirn Kultur. Mittel-bis Kultur Gehirn Explant. Alle Schritte sollten in einem Kultur-Haube mit Ausnahme der Inkubation des Mediums durchgeführt werden.
| Schritte | Reagenzien | Konzentration |
| 1. Mischen Sie Reagenzien. | HEPES-KOH, pH-Wert 7,4 | 99 mM |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1,7 mM | |
| KH2PO4 | 2,2 mM | |
| Glukose | 33 mM | |
| Saccharose | 438 mM | |
| autoklaviert dH2O | ||
| (2) sterilisieren Sie mit 0,45 μm-Filter. | ||
| (3) bei 4 ° C bis zu 6 Monate speichern. | ||
| Hinweis: Für Versuchszwecke: 1 X mit autoklaviert dH2O verdünnen und mit 0,45 µm Filter Top-Flasche durch Vakuum oder mit Filter Spritze zu sterilisieren. Bei 4° c halten In einer Kultur Kapuze, mehrfache Verwendung geöffnet. | ||
Tabelle 2: Vorbereitung der DSS (10 X). Kochsalzlösung, Drosophila Gehirne zu zergliedern. Bereiten Sie in einem Kultur-Haube.
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Discussion
Hier haben wir die Methode zur langfristigen Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie kultivierten Larven Gehirne beschrieben. Der Erfolg dieser Art von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, wie die Gesundheit der Kultur, Methode zur Immobilisierung des Gehirns Explant, Fluoreszenzintensität und Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter, zeitliche und räumliche Auflösung und Zugänglichkeit zu den Explant. Diese Faktoren können sich gegenseitig ausschließen. Zum Beispiel Zeitraffer Häufigkeit beeinflusst die Gesundheit der Kultur, und die Immobilisierung des Gehirns Explant Gasaustausch behindern könnte. So ist finden einen Mittelweg (kein Wortspiel beabsichtigt) für die Phänomene unter Studie Schlüssel für ein erfolgreiches Protokoll. Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um die Expression von fluoreszierenden circadiane Reporter in der Größenordnung von Stunden bis Tagen zu überwachen. Es gilt auch für andere Fächer in Drosophila Neurobiologie, solange kritische Prozesse sind unverändert und mit Sorgfalt ausgeführt.
In diesem Protokoll sind Gehirn Explantaten in ein Fibrin-Gerinnsel, schafft eine 3D Matrix immobilisiert. Obwohl andere Methoden zur Immobilisierung, wie Poly-Lysin oder Laminin Beschichtung der Glasabdeckung, diese verlangsamen die Entwicklung der Larven Gehirne29 vorhanden und können somit ihre physiologische Stabilität beeinträchtigen. Naturgemäß bietet Fibrin eine ausgezeichnete Matrix, die locker genug, um Nährstoffe zu erreichen das Gehirn Explant ermöglichen und klebrig genug, für das Gehirn, nah an dem Deckglas ohne Quetschen sie16ist. Aufgrund dieser Vorteile in verschiedenen Protokollen für die Zellkultur Fibrin Gerinnsel Methode beschäftigt und Gehirn explant Kultur14,17,29,30,31,32 ,33,34. Wir empfehlen eine 3D Fibrin-Matrix für Larven Gehirn Kultur auch für relativ kurzfristige Experimente, die mehr als ein paar Stunden dauern. Larval Gehirn Kultur ohne 3D Matrix gibt fehlerhafte Ergebnisse (Daten nicht gezeigt), wahrscheinlich wegen mangelnder körperlicher Unterstützung für die Entwicklung von Gehirn.
Es ist wichtig, sorgfältig die Morphologie der modellabhängigen und die Zellen im Gewebe vor und während der Time-Lapse imaging zu erkennen, Zeichen der Not beobachten. In den hier vorgestellten Experimenten Ausdruck der Membrane-springen mCD8::YFP zeigte intakt Morphologie der Neuronen und pro-TDT im Zytoplasma und Zellkern erkannt wurde, wie erwartet, darauf hinweist, dass das Gehirn Explant lebensfähig und gesund durch blieb, die Dauer der Bildgebung. Circadiane Rhythmik wurde für bis zu 72 h untersucht aber wir beobachteten, dass Gehirn Explantate für bis zu 5 Tage kultiviert werden können, ohne die Integrität der Nervenzellen und des Gehirns (Daten nicht gezeigt) verschlechtert. Wenn die Neuriten dotty oder die Zellkörper der Neuronen platzen, diese sind in der Regel Anzeichen einer Phototoxizität und leicht verhindert durch die Anpassung der Mikroskop-Einstellungen entsprechend. Zum Beispiel versuchen Sie, Verringerung der Laserleistung und erhöht die Lochkamera Größe, smart zu gewinnen und das Fenster der Erkennung. Fluoreszenzintensität des Reporters ist jedoch im Allgemeinen, der limitierende Faktor für den Erhalt der Bilder des gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne hochintensive Laser Beleuchtung. Das Design des Reporters, Wahl der Fluorophor und die Kopienzahl des Reporters sind daher die ersten Dinge zu beachten bei der Problembehandlung der Lebensfähigkeit. (In der hier vorgestellten Experiment wurden 4 Kopien pro Tdt Reporter verwendet.)
Weitere Symptome einer kompromittierten Gehirn-Kultur sind das Platzen einer Halbkugel im Zeitraffer Bildgebung und Bewegung von Flüssigkeit aus dem Gehirn Explant. Dies ist wahrscheinlich auf Mikro-Einstiche während Dissektion des Gehirns verursacht. Entfernen die imaginalen Scheiben befestigt an den Larven Gehirn ist die Hauptquelle der Punktionen, so raten wir von es.
Der Vorteil der Fluoreszenz circadiane live Imaging über Biolumineszenz Bildgebung ist die hohe räumliche Auflösung. Darüber hinaus erleichtert die Leichtigkeit des zellulären Marker zusammen mit dem Rhythmus-Reporter mit die Analyse der Zelltyp Spezifität. Im Gegensatz dazu hat die Biolumineszenz hohe zeitliche Auflösung und ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis19,20,21. Dennoch ist insgesamt Anzahl der Radsport Neuronen pro Gehirn durch Biolumineszenz abgebildet nicht überlegen im Vergleich zu der Anzahl erreicht mit unserer Methode8,19,21. In den meisten Fällen sind die Rhythmen der fluoreszierenden Reporter entdeckt mit unserer Methode in demselben Cluster Uhr Neuronen (siehe Abbildung 2), synchronisiert, sobald mit Biolumineszenz19gezeigt. Phasendifferenzen zwischen Uhr Neuron Clustern beobachtet in Fluoreszenz und Biolumineszenz circadiane bildgebenden8,19,21. Daher sowohl Methoden sind gleichermaßen gültig zirkadianen Rhythmen in kultivierte Gehirne zu beobachten, und die Wahl zwischen Blüte und Biolumineszenz sollte entsprechend dem Ziel der Studie gebildet werden.
Die größte technische Schwierigkeit dieser Methode ist in der einbettenden Schritt. Da das Protokoll schnell scannen konfokale Bildgebung mit einem inversen Mikroskop fordert und Lichtstreuung im Hirngewebe die Fluoreszenz-Detektion, reduziert vor allem, wenn tief im Gewebe imaging, Gehirn Explantaten montiert werden sollte so nah wie möglich, das Deckglas. Darüber hinaus hängt die Reproduzierbarkeit der bildgebenden Ergebnisse auf die Konsistenz der Z-Positionen der Neuronen von Interessen. Daher ist es wichtig, ausrichten und montieren Gehirne immer auf die gleiche Weise, die Übung erfordert. Neuronale Image Cluster befindet sich in anatomisch unterschiedliche Positionen, es erforderlich sein, um eigene Experimente mit verschiedenen Gehirn Explant Orientierung führen. Gibt es alternative Methoden für die tiefen Gewebe live Bildgebung, die keine Kultivierung der Gewebe, wie z. B. durch zwei-Photonen-Mikroskopie und Lichtblattmikroskopie. Letzteres wurde erfolgreich auf Bild circadiane Kalzium Dynamik live Drosophila Gehirn22,23eingesetzt. Aber Lichtblattmikroskopie hat geringeren räumliche Auflösung als konfokalen Mikroskopie und somit seine Anwendung auf die Bildgebung bei einzelligen Auflösung bleibt eine Herausforderung.
Zusammenfassend lässt sich sagen verbindet dieses Protokoll eine einfache Kultursystem der Larven Gehirn Explantaten unter Bedingungen, die Time-Lapse Bildaufnahme von fluoreszierenden Reportern über Tage und Quantitative Analyse von biologischen Rhythmen unterstützen. Zwar gibt es gewisse Einschränkungen, wie oben beschrieben, kann die Methodik an Bild verschiedene Reporter in Larven und Erwachsenen Drosophila Gehirn angepasst und weiter modifiziert, um Empfindlichkeit und räumlicher Auflösung zu erhöhen. Zum Beispiel axonale Projektionen befindet sich tief im Gehirn oder vesikulärer Transport kann durch die Kombination unseres Gehirns Explant Kultur Technik mit zwei-Photonen-Mikroskopie35nachweisbar sein. , Die being said, es immer noch möglich gibt, live-Darstellung der Organellen wie Mitochondrien im erwachsenen Gehirn explants unter Verwendung dieses Protokolls (Daten nicht gezeigt). Wir präsentierten auch die Variation dieses Protokolls für Bad Anwendung der experimentellen Lösung in pharmakologischen Tests. Man könnte dieses Protokoll ausführen "Puls-Jagd" Experimente durch manuell ersetzen das Kulturmedium zum Auswaschen des Medikaments oder die Nutzung einer Perfusion Kammer18,36verlängern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Michael Rosbash für seine Betreuung und Unterstützung während der Anfangsphase der Entwicklung dieser Methode. Diese Arbeit wurde vom JST PRESTO-Programm des Schweizer Nationalfonds (31003A_149893 und 31003A_169548), der Europäische Forschungsrat (ERC-StG-311194), Novartis Stiftung für medizinisch-biomedizinische Forschung (13A39) und der Universität Genf finanziert. .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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