Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.
Abstract
המעגל קוצב לב היממה האחראית פלטי פיזיולוגיים ורגשיים קצבית מתואמת עם רמזים סביבתיים, כגון מחזורי יום/לילה. השעון המולקולרי בתוך כל נוירון קוצב לב יוצר השעון הביולוגי בביטוי גנים, אשר מושתתות הפונקציות עצביים קצבית חיוני לפעולה של המעגל. חקירת המאפיינים של הפרט מולקולרית של מחלקות שונות של קוצב לב נוירונים ודן האינטראקציה שלהם עם אותות עצביים התשואות הבנה טובה יותר של המעגל היממה קוצב לב. כאן, אנו מציגים בגישה מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות פותח על מנת לנטר את שעון מולקולרי בנוירונים שעון מהמוח זחל דרוזופילה בתרבית. שיטה זו מאפשרת הקלטת הנמשך של חמשת המקצבים של מקודדים גנטית עיתונאים היממה פלורסנט ברזולוציה תא בודד. תוכנית התקנה זו יכול להיות משולב עם מניפולציות תרופתי לנתח באופן הדוק תגובה בזמן אמת של השעון המולקולרי תרכובות שונות. מעבר מקצבים השעון הביולוגי, שיטה זו תכליתי בשילוב עם טכניקות עוצמתיות דרוזופילה גנטי מציעה את האפשרות ללמוד מגוון תהליכים עצביים או המולקולריות ברקמת המוח בשידור חי.
Introduction
שעונים היממה לעזור אורגניזמים להסתגל לשינויים סביבתיים תקופתיים שנוצר על ידי 24 שעות הסיבוב של כדור הארץ. לולאות משוב תעתיק translational בזו ביסוד נפוץ המנגנון המולקולרי של היממה שעונים על פני מינים1. המעגל היממה קוצב הלב מורכב המכיל שעון נוירונים משלב זמן-של-יום המידע הנמסר על ידי רמזים סביבתיים, כגון/כהה (LD) ומחזורי טמפרטורה, שיתכנן את מקצבי שפע של יומי פיזיולוגיים, תהליכים התנהגותיים2,3. התיאום של מקצבים מולקולרית עם עצביים התשומות והתפוקות חשובה קריטית עבור הפעולה של מעגל היממה אך שרידים הבין באופן חלקי בלבד.
דרוזופילה, בליבה של השעון המולקולרי, heterodimer מחזור/שעון (CLK/CYC) מפעיל שעתוק של התקופה (לאדם), נצחית (tim). לכל וטים יוצרים קומפלקס והזן את הגרעין, שבו הם לעכב פעילות גנים ברמת השעתוק של CLK/CYC וכתוצאה מכך שעתוק משלהם. Post-transcriptional ו- post-translational לגרום לעיכובים שעתוק CLK/CYC-מתווכת בין דיכוי על ידי לכל / טים, המבטיח את הדור של בערך 24 שעות ביממה תנודות מולקולרית1,3,4 . נוירונים כ-150 המכיל טופס אלה שעונים מולקולרית מעגל הבקרה להתנהגות היממה של מבוגר טסה5. כמה פשוטים אך פונקציונליים לחלוטין היממה מעגל חשמלי המורכב 3 קבוצות של נוירונים שעון - 5 נוירונים לרוחב הגחון (LNvs; 4 LNvs PDF-חיובי, LNv PDF-שלילי אחד, ראה להלן), 2 1s נוירון הגבי (DN1s) ו- 2 2s נוירון הגבי (DN2s) - נמצא הזחל המוח6,7.
המעגל פשוט היממה זחל מציע מודל מצויין ללמוד את האינטראקציות בין תקשורת בין-עצביים של שעון מולקולרי. באמצעות הכתבת פלורסנט פיתח לכל-TDT, אשר מחקה את הרמות לכל חלבון ומיקומו subcellular, חיפשנו לאפיין את הדינמיקה של המכני מולקולרית ב שעון שונות תת-קבוצות נוירון במעגל היממה זחל 8. יתר על כן, לדעת תפקיד מפתח של neuropeptide פיזור פיגמנט הגורם (PDF) המיוצר על ידי LNvs 4 בוויסות מקצבים השעון הביולוגי-ברמה העצבית9,10,11, רצינו לבדוק הישירות השפעת PDF על השעונים מולקולרית. לשם כך, פיתחנו שיטה כדי לפקח על ביטוי גנים היממה מקצבים במוח זחל explant על פני ימים מרובים על-ידי קונפוקלית זמן לשגות. הפרוטוקול הותאמה גם עבור מבחני תרופתי לבחון את ההשפעה של PDF או תרכובות אחרות ברמה של פי-TDT. לפיכך, ההסתגלות מורכב לנגישים התרבות explant המוח ליישום סמים, הגדלת רזולוציה טמפורלית, הדמיה עבור משך קצר יותר.
Ex-vivo תרבות של דרוזופילה מוחותיהם של שלבים התפתחותיים שונים היו שנקבעו קודם12,13,14,15,16,17 ,18. והואיל פרוטוקולים אלה שימשו הדמיה תופעות ביולוגיות שונות, חלקם אינם תואמים דימות ברזולוציה תא בודד או אינם תומכים התרבות יותר מאשר מספר שעות. שיטות אלטרנטיביות לביצוע הדמיה חיים לטווח ארוך של היממה נוירונים בדרוזופילה כוללים ביולומינסנציה הדמיה מולקולרית מקצבים19,20,21 קרינה פלואורסצנטית הדמיה של מחוון סידן עם22,של מיקרוסקופ אור גיליון23. למרות ביולומינסנציה הדמיה ניתן להשיג רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להתאמה עבור הדמיה ויוו , הם מוגבלים על הרזולוציה המרחבית, דורשים מערכות מיקרוסקופים מיוחדים.
השיטה המתוארת כאן המותאמים באופן חזותי אותות פלואורסצנט בתרבות כל המוח ברזולוציה תא בודד על פני ימים מרובים. שיטה זו נתיישב ופסיביות יכול להיות מותאם כדי התמונה תרבותי המוח לטוס למבוגרים ו לניסויים תרופתי ללמוד הרבה בעיות שונות מצאו דרוזופילה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מלאי פתרונות ברדס תרבות
- להכין 400 מ של 1 x בינוני הפעיל שניידר (SAM) אופטימיזציה עבור ex-vivo תרבות של המוח זחל (שונה ההתייחסות24,25) (טבלה 1). Aliquot ל מ ל ו- flash להקפיא במצב חנקן נוזלי (LN2), לאחסן ב- 80 מעלות צלזיוס.
- להכין 1 x Dissecting, תמיסת (DSS) על-ידי המדללת 10 x מניות פתרון (שונה ההתייחסות26) (טבלה 2).
- פיברינוגן aliquot 10 מ ג, חנות ב 4 ° C לשימוש בודד.
התראה: שוקלים פיברינוגן תחת זרימה שכבתית, לבש כפפות, כפי שהוא מזיק. - להכין פתרון מניות תרומבין סאם (1500 NIH יחידה/mg) aliquot כדי 10 µL, פלאש להקפיא LN2 , לשמור ב-80 מעלות צלזיוס.
התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול תרומבין כמו זה מזיק. - Aliquot מניות פתרון של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור ב-20 ° C.
- חותכים עיגולים של ממברנות טפלון (PTFE) (ראה טבלת חומרים) בגודל שמתאים בתוך צלחת תחתית זכוכית. יש לשטוף אותן ב- 70% EtOH ולאחר מכן כניסה בלוק dH2O. Sterilize ויבש תחת זרימה שכבתית עם UV. להשאיר צלחת פטרי סטריליות. שימוש אחד.
הערה: PTFE היא קרום נקבובי גמיש זה מאפשר חילוף הגזים ומונעת בינוני מתאדים במהלך ההקלטה לטווח ארוך.
2. זמן לשגות מיקרוסקופ ההתקנה
הערה: ההגדרה הבאה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הפוכה טנדם (ראה טבלת חומרים) מצויד עם סורק תהודה (8,000 Hz). המערכת כוללת גלאי צילום-מכפיל מאוד רגיש, המונע יחד עם סורק תהודה של phototoxicity ו- photobleaching. טמפרטורה ולחות מבוקרות בתוך תא סביבתיים מיקרוסקופ זה (ראה טבלת חומרים) מכסה את רוב המיקרוסקופ.
- במקום חדר לחות הבמה-העליון.
- הפעל את בקרי טמפרטורה ולחות כדי equilibrate את התא מיקרוסקופ כדי 25 ° C ו- 80% לחות.
- ביצוע ניסויים בחשכה קבוע (DD), מכסה תא סביבתיים מיקרוסקופ בד אטום (אלא אם כן התא מיקרוסקופ מורכב של חומר אטום).
- אם משתמש מטרה טבילה במים, מיקום מתקן מיקרו טבילה מים מעל המטרה, תוכנית פרוטוקול עם התוכנה Autoimmersion המטרה בקר כדי לוותר על מים בקצב קבוע במהלך דימות זמן לשגות.
הערה: טבילה במי מטרות יחד עם מתקן מים או עדשה אובייקטיבית יבשה של מומלצים עבור הדמיה חיים לטווח ארוך, כמו סוג אחר של טבילה בינוני להתייבש. - במקום בעל פטרי על הבמה, בתוך תא לחות.
- להפעיל את התוכנה מיקרוסקופ ובחר את מצב סורק תהודה מתוך תיבת דיאלוג הראשון. בחר ב'אישור ' כדי לאתחל את הבמה כאשר תתבקש לעשות זאת. לכי אל הכרטיסיה ' תצורה ' תצורת החומרה כדי לעבור על הקווים הרלוונטיים לייזר.
- לעבור ללשונית ידרשו לחלונית XY בחר מצב דו-כיווני ולהגדיר את התמונה רכישה פרמטרים.
הערה: מתואר הדמיה ההגדרה המובאת כאן (איור 2, איור 3 וסרט 1) ממוטבת להתבונן ביטוי היממה של עיתונאים פלורסנט ספציפיים. הפרמטרים הבאים נבחרו מיטבית שלנו מפרט: 40 X מים טבילה אובייקטיבי, X 8 קו ממוצע עם רזולוציית התמונה × 512 512. עבור הדמיה ססגוניות, ייבוא תמונות רציפים נדרש כאשר אורך הגל פליטה של fluorophore אחד, אורך הגל עירור חפיפה אחר (כאן, אורכי הגל של החלבון הניאון צהוב (YFP) פליטה ו עגבניות עירור חפיפה). לבחור את מצב סדרתית "בין מחסנית" הוא הכי מהיר, התנועה של נוירונים השעון היא זניחה במהלך רכישת Z-במחסנית. מיקרוסקופ הגדרות צריכות להיות להתאים בהתאם מטרת ניסוי.
3. התקנה של המוח זחל Explant תרבות
הערה: כל התהליך מן דיסקציה להטבעת של המוח explants לוקח ~ 30 דקות.
-
הכנת ריאגנטים ברדס תרבות.
- להפשיר את aliquot של תרומבין ולשמור בטמפרטורת החדר עד השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.
- הפשרת במהירות של aliquot של סאם ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור בקירור לשימוש בודד.
- הוסף סם aliquot 10 מ ג של פיברינוגן כדי 10 מ"ג/מ"ל, קפיצי בעדינות ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות, במהלך השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.
הערה: לא דגירה של פיברינוגן פתרון יותר 2 h שזה יתחיל פולימריזציה. - להפשיר aliquot של x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין. להכין 2.5 מ של סם המכיל 1 x פניצילין-סטרפטומיצין (סאם/אנטיביוטיקה). לשמור בטמפרטורת החדר.
הערה: חנות הנותרים x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין ב 4 ° C עד חודש. - להכין את aliquot של 500 µL מסם הנותרים. לשמור על הקרח.
- עבור הדמיה לטווח ארוך, למרוח משחה ואקום בלוק לחלק התחתון של המנה התחתון זכוכית (איור 1 א') פלסטיק ולחטא תחת זרימה שכבתית עם UV.
-
דיסקציה של חוט עצבי במערכת העצבים המרכזית ו הגחוני /.
- לנקות את המלקחיים ו- 2 x כלי חיתוך הזכוכית שלוש-. טוב עם 70% EtOH. יוצקים µL 400 של DSS לתוך בארות 4 ו- 400 µL של סאם היטב אחד. לשמור על הקרח.
- לקצוץ לטוס בינוני המכיל הזחלים ולבחור שאינם נודדים השלישית לחלל הזחלים (L3) עם מלקחיים. לשטוף אותם במרוכז בבארות 2 מלא DSS. שמור אותם הבאר השלישית DSS מלא בקרח זה anesthetizes את הזחלים.
הערה: L3 נמשכת כ 2 ימים ב- 25 ° C. להתבונן המוח בתוך פרק זמן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בחרנו להשתמש שאינם נודדים הזחלים L3. קבוצות אחרות של השעון הנוירונים, כגון l-LNvs, DN3s, מתחילים להיווצר על נדודים L3 הבמה אבל הם לא בהכרח רכיבה על אופניים עדיין (נתונים לא מוצג). לכן, למרות שפעולה זו אפשרית על תמונת אופניים שעון נוירונים בשלב זה (נתונים לא מוצג), חשוב להבחין היטב הנוירונים פונקציונלי כבר שעון זחל מלפתח אלה לניתוח נתונים. Non-נודד L3 מופיעים כ- 4-4.5 ימים לאחר ביצה הנחת ב 25 º C. כדי להשתמש בפרוטוקול זה ללימוד השעון הביולוגי, לסנכרן (entrain) הרימות מתפתחות ב 12 h/12 h LD מחזורי 25 ° c 3 ימים לפני איסוף L3 הזחלים. - לנתח את המוח זחל עם מלקחיים בסדר בתוך הבאר 4 מלא DSS, אשר לא נעשה שימוש עבור שטיפה הזחלים, באמצעות שיטה הפוכה27.
- בקצרה, לחתוך הזחל לשתיים, ברכות לצבוט את הווים הפה עם זוג מלקחיים, סכם מבפנים ומבחוץ הקיר הגוף באמצעות זוג מלקחיים, ובכך חושף בפני המוח אחרים. חינם המוח על ידי חיתוך כל קנה הנשימה ואת העצבים לצרף אותו לשאר חלקי הגוף.
- תשאף המוח ב- 3 µL של DSS עם פיפטה 20 µL (מראש שטפה עם DSS), לוותר על הבאר מלא סם. חזור על התהליך עבור המוח עד 7.
הערה: ניתוח צריכה להתבצע על משטח קר לשמור את הזחלים ומורדמת והמוח מקורר. לדוגמה, במקום המנה לנתיחה על בלוק קירור מחוברת משאבה לזרום מים מקורר-קרח. דיסקציה ההליך לוקח ~ 30 הוא לכל המוח. חשוב לשמור את הדיסקים דמותי העין/antennal המצורפת את המוח ואת חוט עצבי הגחון ללא פגע. קורעת את החלקים הבאים נזק למוח, להפחית את האיכות של התרבות. כמו כן, למנוע חשיפת המוח לאוויר. לפני כ רפה בעברית המוח הראשון, פיפטה למעלה ולמטה DSS המכילים חלקים של הזחלים גזור, כפי שהוא מונע את השכל נצמדים לקיר של הקצה.
-
הטבעה של המוח explants במטריצה תלת-ממד, הרכבה (~ 20 דקות).
- להטביע מוח ביתור הפתרון עובד פיברינוגן (פיברינוגן הריכוז הסופי ~3.3 מ"ג/מ"ל, µL 10.5 לכל המוח) כדלקמן:
- האחות µL 3.5 של סאם/אנטיביוטיקה (עם עושה שימוש בסעיף 3.2.3). האחות מוח גזור מן הקרע היטב לתוך קצה פיפטה אותו בלי dispensing המדיום סאם/אנטיביוטיקה בקצה.
- לוותר על המוח ועל המדיום על המכסה של צלחת פטרי סטריליות. מוסיפים עוד 3.5 µL של סאם/אנטיביוטיקה µL 3.5 של פיברינוגן חמים/סאם 10 מ"ג/מ"ל פתרון על המסירה המכיל את המוח. לערבב בעדינות את הפתרון סביב המוח על ידי pipetting עם טיפ פיפטה 20 µL.
הערה: באמצעות פיפטה ולא מלקחיים בשלב זה מונע והדגיש את המוח. - לקחת 2 µL של הפתרון עובד פיברינוגן מהמסירה ולהחיל אותו על coverslip של המנה התחתון זכוכית בצורת מעגל קטן. מוסיפים µL 0.8 של תרומבין ומערבבים מהר מאוד עם טיפ פיפטה. פיברינוגן מומר פיברין, יתחיל פולימריזציה.
- לקחת את המוח יושב של פיברינוגן עובד פתרון (שלב 3.3.1) בין זוג מלקחיים ומקם אותה על המטריקס פעם מטריצה לבן של פיברין הוא גלוי. אוריינט אל הצד הקדמי של המוח למטה (עבור הדמיה שעון נוירונים). לדחוף למטה קרוב ככל האפשר אל הזכוכית המכסה. Clot פיברין מורכב שכבות של פיברין. בחר שכבה אחת ומקפלים אותו מעל המוח בתנועות עדינות וקטנות ללא ניתוק של המטריקס.
- חזור על פי 2 עד פי 3 מחלקים שונים של קריש הדם כדי לייצב את המוח.
הערה: בעת טיפול המוח עם מלקחיים, יש להיזהר לא לייבש אותו או לכפות אותו הלחץ הפיזי.
- חזור על פי 2 עד פי 3 מחלקים שונים של קריש הדם כדי לייצב את המוח.
- הוסף 20 µL של סאם/אנטיביוטיקה על המוח מוטבע כדי להפסיק את הפעולה של תרומבין.
- חזור על הפעולות כדי לטעון את השכל הנותרים. . זה ניתן להטביע עד 5 עד 6 המוח על צלחת תחתית זכוכית.
- הדמיה חיה לטווח ארוך, הוסיפו 600 µL של סאם/אנטיביוטיקה בבאר הפנימי (החלק זכוכית). מקם חתוכות מראש PTFE קרום על גבי המדיום ולתקוע אותו לגריז ואקום חלה על חלק הפלסטיק התחתון (3.1.5) (איור 1 א').
- עבור מבחני תרופתי, למלא קערה עם 2 מ"ל של סאם/אנטיביוטיקה (איור 1B).
הערה: חשוב מאוד למנוע אידוי של המדיום, osmolality של המדיום הוא קריטי הכדאיות של נוירונים. לכן, לניסויים הדמיה לטווח ארוך, יש צורך לאטום את המנה תרבות עם PTFE קרום. ואילו לניסויים לטווח קצר, איטום ממברנה אינה נדרשת עוד המנה הוא מלא עם 2 מ"ל של מדיום, בפיקוח תא humidified.
4. ייבוא תמונות בצילום מואץ
- הצב את הצלחת התחתונה זכוכית בקופסת פטרי תא לחות הבמה-העליון.
- עבור z-מחסנית לוח בכרטיסיה ידרשו ולהגדיר את השלבים z-סעיף מתוך התוכנה מיקרוסקופ (2 מיקרומטר × ~ 40 בניסויים שמוצג באיור 2 , איור 3ו 1 סרט). לקבוע את תחילת z-מחסנית המטוס המרוחק ביותר את coverslip ואת הקצה על פני השטח של explant המוח, קרוב coverslip. למרות המוח תנועות הם זניחים, להוסיף תוספת z-סעיפים ההתחלה ואת הסוף של הערימה-z.
- ללכת לסמן ומצא ייבוא תמונות במקומות מרובים בחלונית והתקנה. עם מטרה X 40, 1 האונה במוח יכולה להילכד בתוך תצוגה של שדה
- ללכת xyzt בחירה (z-מחסנית בצילום מואץ) ובחלונית מצב של רכישה. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את הפרמטרים של מרווח זמן ותדירות הזמן המועדף.
הערה: לרכוש תמונות בצילום מואץ בתדירות הרצויה. שימו לב כי הדמיה חיים לטווח ארוך (24-72 שעות) עם זמן לשגות מרווח זמן קצר יותר מאשר 2 h נוטה תוצאות בנוירונים אופניים פחות, כנראה משום שהיא מקטינה את הכדאיות של נוירונים. הנפח מרחיב כמו קצב רכישת התמונה עולה, מה שהופך ניתוח נתונים ואחסון מאתגרת יותר.
5. טיפול תרופתי של המוח Explants עם Short-term לחיות הדמיה
הערה: ההליך הבא מיועד בעיקרו של דבר זהה לזה הדמיה לטווח ארוך אך אינה דורשת PTFE קרום. למנוע חשיפת המוח כדי אור כחול כאשר החומר הכימי מתווסף אל התרבות, המיקרוסקופ יוצב בחדר חשוך עם אור אדום.
- עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר סריקה כדי להשיג את נתוני התוכנית הבסיסית לפני יישום סמים. הפעל סריקה.
- לאחר התוכנית הבסיסית השלמת הסריקה, וכשמרימים את הראש סריקה של המערכת מיקרוסקופ. הסר את המכסה של בקר לחות הבמה-העליון, בזהירות להסיר את המכסה של המנה התחתון זכוכית מבלי להזיזו.
- הסר את הכמות המתאימה של תרבות בינוני במידת הצורך. מוסיפים את הפתרון ניסיוני במדיום ומערבבים, בזהירות, בעדינות רבה, עם פיפטה פסטר סטרילי מבלי לגעת explants את המוח.
הערה: עבור יישום אמבט של PDF, השתמש 2 מיקרומטר פתרון PDF מניות (ב 10% דימתיל סולפוקסיד). - החלף את המכסים את הצלחת התחתונה זכוכית תא לח, ואת הראש הסריקה. אם משתמש, למקם מחדש את הבד אטום שחור סביב התא מיקרוסקופ.
- בדוק אם המוח נמצאים במיקום המקורי שלהן במצב סריקה בשידור חי. התאם במידת הצורך.
- עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר הסריקה. הפעל סריקה.
הערה: כאן בדקנו תמונות בצילום מואץ רכשה כל שעה עבור עד 10 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מראים את התוצאות נציג של ההקלטה לטווח ארוך של עיתונאי פלורסנט היממה ב- ex-vivo המוח זחל תרבות, ואת תוצאות הדמיה בשידור חי של PDF יישום אמבטיה על הכתב ביטוי.
Non-נודדים הזחלים L3 לבטא את שעון מולקולרי כתב לכל-TDT ואת UAS-mCD8::YFP מונע על ידי נהג נוירון שעון Clk (856)-gal4 (איור 1C) היו entrained במוח LD. היו גזור ולהגדיר לתרבות לטווח ארוך במהלך האחרון אור שלב של מחזור LD רגע לפני השלב כהה (איור 1A ו- 2B). הדמיה בצילום מואץ בוצעה ב DD, המוח explants היו עם תמונה כל 2 h עבור 64 h. סכום-מחסנית המכילה נוירון עניין נוצר ולא עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של האזור המקביל הנוירון נמדדה לאחר רקע חיסור8. כדי לקבוע rhythmicity של הביטוי העיתונאי, מקסימום אנטרופיה ספקטרלי ניתוח (מסה) והן בדיקה ידנית היו בשימוש8. DN2s שני המציגים את השעון הביולוגי מקצבים עם תקופה של ~ h 26 רמות לכל-TDT מוצגים כאן (איור 2 א, 2 C, וסרט 1).
שימוש בעיקרון באותה תרבות ההתקנה (איור 1B), השפעת neuropeptide PDF על הביטוי של פי-TDT נחקר. המוח של שאינם נודדים הזחלים של גנוטיפ באותה כפי שתוארה לעיל היו גזור גם ב- ZT1 (Zeitgeiber הזמן 1, h 1 לאחר אורות על LD) או ZT13 (1h אחרי האורות). הבקבוקונים המכיל הזחלים היו מיד צונן על הקרח לאחר שהוצאנו החממה. ב ZT13, הבקבוקונים גם היו עטופים נייר אלומיניום כדי להימנע מחשיפה אור כחול. . הקרע המוח בוצעה על קרח, והטרף המוח הוחזקו על קרח. המוח שצולמו ZT13 היו מכוסים ברדיד אלומיניום במידת האפשר. לכן, למרות הליך זה בוצע במעבדה מואר באור טבעי, ההשפעה של חשיפה קלה על חילוף החומרים, סינתזה macromolecular היה מינימלי. המוח נסרקו פעמיים עם מרווח 1 h כדי לקבל את הנתונים של תוכנית בסיסית. PDF או רכב (דימתיל סולפוקסיד) נוספה המדיום תרבות, תמונות בצילום מואץ נרכשו בכל 1h לציון עוקבות 6-אייץ פי-TDT פרופיל ביטוי הראו עלייה זמן-של-יום-תלוי בעוצמת זריחה על תוספת PDF ב- ZT13 LNvs, DN1s, וכדי במידה פחותה ב- DN2s (איור 3)8.
תוצאות אלו מצביעות על טכניקת דימות ואת שיטת תרבות המתוארים כאן זמין את ההקלטה של מקצבים לכל-TDT ברזולוציה תא בודד בלי להיסחף phototoxicity, photobleaching או המוקד מורגש.
הערה: נותחו ותמונות מעובד באמצעות פיג'י28. 10 X deconvolution איטרטיבי בוצעה עם AutoQuant ו- Imaris. נשתל מינור של תמונות בצילום מואץ תוקנו עם תוסף להיסחף 3D הנכונה של ImageJ.
איור 1: אנטומיה של השעון נוירונים במוח זחל L3 ו המוח explant תרבות ההתקנה. (A ו ב) . השרטוטים של ההתקנה תרבות המוח עבור הדמיה לטווח ארוך (א) ו עבור מבחני תרופתי עם לטווח קצר הדמיה () ב- (א), (צהוב) ואקום גריז הוחל על החלק פלסטיק של המנה התחתון זכוכית לצרף קרום PTFE. (ג) תמונת הנציגה של מוח זחל LD-entrained L3-ZT2. הביטוי של הכתב שעון מולקולרי לכל-TDT (מגנטה) מוצגת ב שעון נוירונים, אשר מסומנים על-ידי UAS-mCD8::YFP(green) מונע על ידי Clk (856)-gal4. ישנן 3 קבוצות של השעון הבדיל נוירונים ב- L3: 5 LNvs (כולל את LNv ה-5, אשר ואינה מבטאת PDF), 2 DN1s, 2 DN2s, המצוין על-ידי ראשי חץ לבן. שימו לב הביטוי של פי-TDT ב הגרעינים של נוירונים שעון. תאים לכל-TDT-חיובי שלילי YFP הם עכשיו, דונלד השני תת-חבורה של נוירונים שעון זה עדיין מתפתח. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג תוצאות לטווח ארוך לחיות הדמיה של נוירונים שעון זחל. (א) מוגדל הנוף של DN2s ההדמיה זמן לשגות לטווח ארוך של מוח בתרבית. Explants המוח הוכנו של הזחלים L3 LD-entrained גזור-ZT11. התמונות צולמו כל 2 h מ CT17 (היממה זמן 17, 5 שעות לאחר לכיבוי אורות סובייקטיבית בדמוקרטיה) עבור 64 ח ב DD. ממוזג תמונות של פי-TDT (מגנטה) UAS-mCD8::YFP מונע על ידי Clk (856)-gal4 (ירוק) הם בצד השמאל של כל לוח, לכל-TDT רמות מיוצג heatmap עם הצבע הכחול נמצאים בצד הימין. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. רק לייצוג, תמונות עובדו ועם תיקון 3D הסחף של 10 X deconvolution איטרטיבי. . התזמון של הניסוי (B) . (ג) הגרף המייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי מנורמל ב t = 0 של שני DN2s (כחול ואדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תוצאות נציג הדמיה חיים לניסויים תרופתי. המוח זחל LD-entrained היו גזור, שנטענה ב- ZT1 או ZT13, ו- PDF (2 מיקרומטר) או דימתיל סולפוקסיד הוחלה ZT2 או ZT14. ביטוי לכל-TDT explants המוח נוטרה כל שעה על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. קרינה פלואורסצנטית רשע בעוצמה ± SEM מנורמל לערך בתחילת הדמיה (תואם ל- ZT1 או ZT13) מוצג. חצים אדומים מציינים את הזמן של יישום PDF או רכב (ZT2 או ZT14). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * p < 0.0001 מאת אנובה דו כיוונית עם התיקון של Sidak להשוואות מרובות. מינימום של 32 LNvs, 18 DN1s ו- 16 DN2s נותחו עבור כל נקודת נתונים. דמות זו שונתה הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: הדמיה חיים לטווח ארוך של נוירונים שעון DN2 זחל. הסרט בצילום מואץ של המוח זחל בתרבית גזור-ZT11, עם תמונה ב- DD. Magnified נופי DN2s בחצי הכדור יחיד להביע לכל-TDT ו UAS-mCD8::YFP מונע על ידי Clk (856)-gal4 מוצגים. תמונות נרכשו כל 2 h עבור ה 64 לכל-TDT (מגנטה) ו YFP (ירוק) נמצאים משמאל לכל-TDT רמות שמיוצגות על heatmap (צבע כחול) הם בצד הימין. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
| צעדים | ריאגנטים | ריכוז |
| 1. מערבבים ריאגנטים. | 2פו ח'4 | 4.18 מ מ |
| CaCl2 | מ מ 1.05 | |
| MgSO4.7H2O | 0.7 מ מ | |
| NaCl | 116 מ מ | |
| NaHCO3 | 0.7 מ"ג/מ"ל | |
| גלוקוז | 2 מ"ג/מ"ל | |
| טרהלוז | 2 מ"ג/מ"ל | |
| חומצה α-Ketoglutaric | 0.35 מ"ג/מ"ל | |
| חומצה פומרית | 60 μg/ml | |
| חומצה מאלית | 0.6 מ"ג/מ"ל | |
| חומצה סוקסינית | 60 μg/ml | |
| תמצית שמרים | 2 מ"ג/מ"ל | |
| FCS ללא חום-לא פעיל | 20% | |
| dH2O, בלוק | ||
| 2. לחטא עם מסנן μm 0.22. | ||
| 3. דגירה באינקובטור תרבית תאים 25 ° c בחושך 72 ה חממה יש להיות זיהום חיידקי או פטרייתי. | ||
| 4. מוסיפים נוגדנים. | אינסולין | 2 μg/ml |
| Bis-טריס pH 6.8, לחטא עם מסנן μm 0.22 | 5 מ מ | |
| 5. להתאים את ה-pH ל 6.8-6.9. | NaOH (10 N) | ~ 8 טיפות |
| 6. לחטא עם מסנן μm 0.22. | ||
| 7. aliquot עד 5 מ"ל פלאש להקפיא בחנות LN2 ב-80 מעלות צלזיוס. השתמש תוך 60 ימים. | ||
| הערה: עבור אמצעי אחסון גדולים, לחטא עם מסנן בקבוק העליון על ידי ואקום, אחרת להשתמש במסנן מזרק. Aliquots פתוחה בשכונה תרבות. שימוש אחד. | ||
טבלה 1: הכנת סם בינוני (1 x) לתרבות המוח דרוזופילה . בינוני תרבות המוח explant. כל השלבים צריכה להתבצע בשכונה תרבות חוץ הדגירה של המדיום.
| צעדים | ריאגנטים | ריכוז |
| 1. מערבבים ריאגנטים. | HEPES-קו, pH 7.4 | 99 מ מ |
| NaCl | 1.37 מטר | |
| אשלגן כלורי | 54 מ מ | |
| 2PO NaH4 | 1.7 מ מ | |
| 2פו ח'4 | 2.2 מ"מ | |
| גלוקוז | 33 מ מ | |
| סוכרוז | 438 מ מ | |
| בלוק dH2O | ||
| 2. לחטא עם מסנן μm 0.45. | ||
| 3. לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. | ||
| הערה: לשימוש ניסיוני: למהול 1 X עם בלוק dH2O ולחטא עם העליון-בקבוק 0.45 של μm מסנן, על ידי ואקום או עם מסנן מזרק. לשמור על 4 מעלות צלזיוס. פתוח בשכונה תרבות, שימוש מרובים. | ||
בטבלה 2: הכנת DSS (10 x). תמיסת לנתח את המוח דרוזופילה . להכין בשכונה תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנחנו תיאר את שיטת עבור קרינה פלואורסצנטית לטווח ארוך זמן לשגות מיקרוסקופ של המוח זחל בתרבית. ההצלחה של ניסויים מסוג זה תלויה גורמים רבים, כגון הבריאות של התרבות, שיטת הנייח של המוח explant, עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחס אות לרעש של הכתב, הזמני, רזולוציה מרחבית, ו נגישות explant. גורמים אלה יכולים להיות קשורים זה לזה. לדוגמה, זמן לשגות בתדירות הולכת וגוברת משפיעה על הבריאות של התרבות, הנייח של explant המוח עלול לעכב חילוף הגזים. לפיכך, מציאת מדיום שמחה (לא משחק מלים המיועד) על התופעות שנבחנה היא המפתח פרוטוקול מוצלח. השיטה המתוארת כאן ממוטבת כדי לנטר את הביטוי של פלורסנט עיתונאים היממה ב היקף שעות עד ימים. הוא גם החל ללמוד מקצועות דרוזופילה גמור כל עוד תהליכים קריטיים מסקרן ובוצע בזהירות.
ב פרוטוקול זה, explants המוח הם מרותק למיטה בטיפול קריש פיברין, אשר יוצר מטריצה תלת-ממד. למרות שיטות נוספות הנייח קיימים, כגון פולי-ליזין או ציפוי laminin של הזכוכית המכסה, אלה להאט התפתחות המוח זחל29 ובכך עשוי לסכן את החוסן פיזיולוגיים שלהם. במהותה, פיברין מספק של מטריקס מעולה רחבים מספיק כדי לאפשר מזינים להגיע explant את המוח ולא מספיק דביק על המוח להיות קרובים הזכוכית המכסה בלי מועך אותו16. בשל יתרונות אלו, שיטת קריש פיברין ננקטה פרוטוקולים שונים עבור תרבית תאים, המוח explant תרבות14,17,29,30,31,32 33, ,34. אנו ממליצים להשתמש מטריצה תלת-ממד פיברין לתרבות המוח זחל אפילו לניסויים לטווח קצר יחסית מעמד יותר מכמה שעות. המוח זחל תרבות ללא מטריצה תלת-ממד נותן תוצאות בלתי צפויות (נתונים לא מוצג), כנראה עקב חוסר תמיכה פיזיות נדרש לפתח את המוח.
חשוב להתבונן בזהירות את המורפולוגיה של explant ואת התאים ברקמה לפני ובמהלך זמן לשגות הדמיה לזהות סימנים של מצוקה. בניסויים המובאת כאן, ביטוי של mCD8::YFP קרום מכורך הראה מורפולוגיה תקין של הנוירונים, לכל-TDT זוהה הציטופלסמה ואת הגרעין כצפוי, המציין כי explant המוח נותר קיימא ובריא לאורך כל משך הזמן של הדמיה. Rhythmicity היממה נחקר במשך עד 72 שעות אך נצפו explants המוח יכול להיות תרבותי עד 5 ימים ללא מתדרדר את השלמות של הנוירונים במוח (נתונים לא מוצג). אם neurites להיות דוטי או לגוף התא של הנוירונים פרץ, אלה בדרך כלל סימנים של phototoxicity, למנוע בקלות על ידי התאמת הגדרות מיקרוסקופ בהתאם. לדוגמה, נסה להפחית את עוצמת הלייזר תוך הגדלת גודל חריר, החלון של זיהוי ורווח חכם. אולם, באופן כללי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכתב היא הגורם המגביל של קבלת תמונות של יחס אות לרעש טוב ללא תאורה לייזר בעוצמה גבוהה. לכן, העיצוב של הכתב, מבחר של fluorophore, ואת המספר עותק של הכתב הן הדבר הראשון שיש לקחת בחשבון בעת פתרון בעיות הקיום. (בהניסוי המוצג כאן, 4 עותקים של כתב לכל-tdt שימשו.)
סימנים אחרים של תרבות המוח פרוץ כוללים פרץ זה של הכדור במהלך דימות זמן לשגות, תנועה של נוזל מתוך explant המוח. . זה כנראה עקב מיקרו-דקירות שנגרם במהלך ניתוח של המוח. הסרת דמותי הדיסקים המחוברים למוח הזחל הוא המקור העיקרי של דקירות, ובכך אנו מייעצים נגד זה.
היתרון של הדמיה חיה היממה זריחה מעל ביולומינסנציה הדמיה הוא שהרזולוציה המרחבית גבוהה. בנוסף, להקל על שימוש סמנים הסלולר יחד עם הכתבת קצב מקלה על הניתוח היחודיות סוג התא. לעומת זאת, ביולומינסנציה יש רזולוציה טמפורלית מעולה, יחס אות לרעש מעולה19,20,21. ובכל זאת, הכולל מספר הנוירונים אופניים לכל המוח עם תמונה מאת ביולומינסנציה הוא לא מעולה לעומת המספר שהושג עם שלנו השיטה8,19,21. ברוב המקרים, מקצבי הכתבים פלורסנט מזוהה עם השיטה שלנו מסונכרנים בתוך האשכול זהה של נוירונים השעון (ראה איור 2C), כפי שמוצג עם ביולומינסנציה19. שלב ההבדלים בין שעון נוירון אשכולות נצפו פלורסצנטיות והן היממה ביולומינסנציה ממוחשב הדמיה8,19,21. לכן, מתודולוגיות תקפות באותה מידה להתבונן מקצבים השעון הביולוגי במוח תרבותי וגם הבחירה בין florescence לבין ביולומינסנציה צריכה להיעשות על פי מטרת המחקר.
הקושי הטכני העיקרי של שיטה זו הוא שלב ההטבעה. כי הפרוטוקול מצריך הדמיה קונפוקלי סורק מהיר עם מיקרוסקופ הפוכה, פיזור אור בתוך רקמת המוח מפחית את זיהוי קרינה פלואורסצנטית במיוחד כאשר הדמיה עמוק בתוך רקמת המוח explants צריך להיות מותקן הכי קרוב אפשרי הזכוכית המכסה. יתר על כן, הפארמצבטית של תוצאות הדמיה תלויה בעקביות של z-העמדות של נוירונים של אינטרסים. לכן, חשוב אוריינט והר המוח תמיד באותה דרך, אשר דורש תרגול. לשיקוף עצביים אשכולות ממוקם עמדות שונות מבחינה אנטומית, זה ייתכן שתידרש להפעיל ניסויים נפרדים עם אוריינטציה explant מוח שונים. ישנם שיטות אלטרנטיביות עבור הדמיה חיה רקמות עמוק שאינם מצריכים culturing הרקמה, כגון על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים מיקרוסקופ אור גיליון. האחרון בהצלחה שימש דיינמיקס סידן היממה תמונה חיה דרוזופילה המוח22,23. אולם, מיקרוסקופ אור גיליון יש רזולוציה מרחבית נמוכה יותר מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ובכך ליישומו הדימות ברזולוציה תא בודד נותר אתגר.
לסיכום, פרוטוקול זה משלב מערכת פשוטה תרבות של המוח זחל explants בתנאים התומכים ייבוא תמונות בצילום מואץ של עיתונאים פלורסנט בימים וניתוח כמותי של מקצבים ביולוגיים. אמנם יש מגבלות מסוימות כמתואר לעיל, המתודולוגיה ניתן להיות מותאמת תמונת כתבים שונים במוח דרוזופילה זחל, למבוגרים, לשינוי נוסף כדי להגדיל את הרגישות והרזולוציה המרחבית. לדוגמה, עצב תחזיות הממוקם עמוק בתוך המוח או תחבורה vesicular לזיהוי על ידי שילוב הטכניקה התרבות שלנו המוח explant עם מיקרוסקופ שני הפוטונים35. נאמר, שזה עדיין אפשרי לבצע הדמיה חיה של organelles כגון המיטוכונדריה במוח למבוגרים explants באמצעות פרוטוקול זה (נתונים לא מוצג). גם הצגנו את הווריאציה של פרוטוקול זה עבור אמבט יישום של פתרון נסיוני מבחני תרופתי. אחד יכול להרחיב את פרוטוקול זה ביצוע ניסויים "דופק. צ'ייס" באופן ידני מחליף המדיום תרבות לשטוף את התרופה או באמצעות זלוף קאמרית18,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים מייקל Rosbash על ההדרכה שלו ותמיכה במהלך השלב הראשוני של ההתפתחות של שיטה זו. עבודה זו מומן על-ידי JST פרסטו התוכנית, שוויצרי הקרן הלאומית למדע (31003A_149893 ו- 31003A_169548), המועצה האירופית למחקר (ERC-StG-311194), נוברטיס קרן מחקר ביו-רפואי (13A39), באוניברסיטת ג'נבה .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
