Summary
이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.
Abstract
Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.
Introduction
Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.
초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.
간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.
다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.
여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비
- 400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선2) 고정
- 재고 솔루션 (참조26수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).
- Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소.
주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게. - SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN2 에 고정 시키고-80 ° c.에
주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다. - 100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속
- 소계 (PTFE) 멤브레인의 동그라미를 잘라 (자료 표 참조) 유리 하단 접시의 안쪽에 맞는 크기를. 70%에 그들을 씻어 EtOH와 다음에 압력가 dH2O. Sterilize UV와 층 류에서 건조. 멸 균 페 트리 접시에 계속. 단일 사용 합니다.
참고: PTFE 가스 교환을 허용 하 고 장기적인 기록 중 증발에서 매체를 방지 하는 다공성 유연한 멤브레인입니다.
2. 시간 경과 현미경 설치
참고: 다음 설치 연동 스캐너 거꾸로 confocal 현미경에 대 한 (자료 표 참조) 갖추고 있다 공명 스캐너 (8000 Hz). 시스템 공명 스캐너 함께 phototoxicity 및 photobleaching를 방지 하는 매우 중요 한 사진 배율 검출기를 포함 되어 있습니다. 온도 및 습도 제어 됩니다 현미경 환경 챔버 내에서 하는 현미경의 대부분을 커버 ( 자료 표참조).
- 무대-가기 습기 장소입니다.
- 25 ° C와 80% 습도에 현미경 챔버 equilibrate를 온도 및 습도 컨트롤러를 켭니다.
- 지속적인 암흑 (DD)에서 실험을 수행, (현미경 챔버는 불투명 재료의 만든) 않으면 불투명 천으로 현미경 환경 챔버를 커버.
- 물 침수 목표를 사용 하 여 목표 위에 물 침수 마이크로 디스펜서 놓고 하는 동안 시간 경과 영상 일정 한 속도로 물 걸 Autoimmersion 목표 컨트롤러 소프트웨어 프로토콜 프로그램.
참고: 물 디스펜서 또는 건조 렌즈 물 침수 목표는 권장 장기 라이브 이미징, 침수 매체의 다른 유형을 건조 것입니다. - 무대, 습도 챔버 내부에 페 트리 접시 홀더를 배치 합니다.
- 현미경 소프트웨어를 실행 하 고 첫 번째 대화 상자에서 스캐너를 공 진 모드를 선택 합니다. 메시지가 표시 되 면 단계를 초기화 하는 확인을 선택 합니다. 구성 탭에 하드웨어 구성 관련 레이저 라인에 스위치를 이동 합니다.
- XY 패널 양방향 모드를 선택 하 고 이미지 수집 매개 변수를 설정 하 고 취득 탭 이동 합니다.
참고: 설명된 영상 설치 여기에 제시 된 (그림 2, 그림 3 과 영화 1) 관찰 circadian 표현의 특정 형광 기자 최적화 됩니다. 다음 매개 변수는 가장 우리의 사양에 맞게 선정 됐다: 40 X 물 침수 목표, 8 X 선 평균 512 × 512 이미지 해상도. 멀티 컬러 이미징에 대 한 순차적 이미지 수집이 필요한 때 한 fluorophore와 다른 중복 (여기, 노란 형광 성 단백질 (YFP) 방출 및 토마토 여기 오버랩의 파장)의 여기 파장의 방출 파장. 그것은 빠른 고 Z 스택의 인수 중 시계 뉴런의 이동은 무시할 수 "스택" 사이 순차 모드를 선택 합니다. 현미경 설정을 각 실험의 목표에 맞게 적응 해야 합니다.
3입니다. 애벌레 두뇌 Explant 문화의 설치
참고: 뇌 explants의 포함 해 부에서 전체 절차 ~ 30 분 걸립니다.
-
문화 후드 시 약의 준비입니다.
- 트 롬 빈의 약 수를 해 동 하 고 (3.3 단계) 포함 단계까지 실내 온도에 유지. 단일 사용 합니다.
- 37 ° C에서 샘의 약 수를 빠르게 해 동 하 고 단일 사용에 대 한 얼음에 계속.
- 10 mg/ml fibrinogen의 약 10 밀리 그램 수로 샘을 추가 하 고 부드럽게 터치 포함 단계 (단계 3.3) 및 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 사용 합니다.
참고: 않습니다 하지 품 어 2 h 이상 fibrinogen 솔루션 유해를 시작으로. - 100 x 재고 페니실린 스의 약 수 동 1 샘의 2.5 mL 준비 페니실린-스 (샘/항생제) x. 실내 온도에서 보관.
참고: 저장소 나머지 100 x 재고 페니실린 스 4 ° C에서 1 달까지. - 나머지 샘에서 500 µ L의 약 수를 준비 합니다. 얼음에 계속.
- 장기적인 이미징에 대 한 유리 하단 접시 (그림 1A)의 바닥의 플라스틱 부분에 압력가 진공 그리스를 적용 하 고 UV 층 류에서 소독.
-
중앙 신 경계와 복 부 신경 코드 절 개가 고
- 청소는 집게와 2 x 3-잘 유리 해 부 요리 70 %EtOH. 4 우물에 DSS의 400 µ L와 한 우물에서 샘의 400 µ L를 붓는 다. 얼음에 계속.
- 애벌레를 포함 하는 비행 중간에 밖으로 푸 고 집게와 방황 아닌 3 탈피 애벌레 (L3)를 선택. 2 DSS 가득 우물에 그들을 연속적으로 린스. 3 DSS 가득 잘 애벌레 anesthetizes 얼음에 그들을 유지.
참고: L3 지속 25 ° c.에 약 2 일 순수 관련 기간에 뇌를 관찰 하 우리는 방황 아닌 L3 유 충을 사용 하기로 결정 했다. L-LNvs, DN3s, 등 시계 뉴런의 다른 하위 방황 L3 단계에서 형성 시작 하지만 그들은 반드시 자전거 아직 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 이미지 수 시계 뉴런 (데이터 표시 되지 않음),이 단계에서 사이클링 그것 이지만 신중 하 게 데이터 분석에 대 한 개발에서 이미 기능 애벌레 시계 신경 세포를 구별 하는 것이 중요 합니다. 비 방황 L3 25 ° c.에 누워 계란 후 약 4.5 4 일 표시 이 프로토콜을 사용 하 여 circadian 리듬을 공부, 하려면 동기화 (끌고가 다)에서 12 h/12 h LD 개발 애벌레 L3 애벌레를 수집 하기 전에 3 일 동안 25 ° C에서 주기. - 4 DSS 가득 잘, 애벌레,27내부 메서드 사용 하 여 세 정을 위해 사용 되지 않은 어떤 좋은 집게와 애벌레 두뇌를 해 부.
- 간단히, 유 충 2에, 부드럽게 입 고리 집게의 쌍 꼬집어 잘라내어 집게, 따라서 뇌를 노출의 다른 쌍을 사용 하 여 몸 벽 내부를 롤. 모든 기도는 시체의 나머지 부분에 연결 된 신경을 절단 하 여 뇌를 무료.
- 20 µ L 피 펫 (DSS 미리 씻어 서)와 DSS의 약 3 µ L에서 뇌를 발음 하 고 샘 가득 잘에서 분배. 최대 7 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다.
주: 해 부 취 애벌레 및 냉장 두뇌 차가운 표면에 수행 되어야 한다. 예를 들어 얼음 냉장 물 순환 펌프에 연결 된 냉각 블록에 해 부 접시를 놓습니다. 해 부 절차 소요 ~ 30의 뇌 당. 그것은 두뇌와 그대로 복 부 신경 코드에 연결 된 눈/더듬이 imaginal 디스크를 유지 하는 것이 중요입니다. 이러한 부분을 찢 어 두뇌를 손상 하 고 문화의 질을 줄일 것입니다. 또한, 공기에 머리를 노출 하지 마십시오. 첫 번째 뇌 해 부 애벌레의 부분을 포함 하는 DSS 위아래로 피 펫을 발음 하기 전에 그것으로 두뇌에서 방지 팁의 벽에 고정 합니다.
-
3 차원 매트릭스에 장착 (~ 20 분) 뇌 explants의 포함.
- 잠수함 fibrinogen 작업 솔루션 (fibrinogen 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌 당 10.5 µ L)에서 해 부 두뇌 다음과 같습니다.
- (동일한 팁 섹션 3.2.3에서에서 사용)와 샘/항생제의 3.5 µ L 발음. 동일한 피 펫 팁으로 잘 해 부 해 부 두뇌에 있는 샘/항생제 매체를 분배 하지 않고 발음.
- 분배는 두뇌와 멸 균 페 트리 접시의 뚜껑에 매체. 두뇌를 포함 하는 드롭에 샘/항생제의 또 다른 3.5 µ L와 따뜻한 fibrinogen/샘 10 mg/mL 해결책의 3.5 µ L를 추가 합니다. 20 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 뇌 주변의 솔루션을 부드럽게 혼합.
참고:이 단계에서 겸 자 보다는 피 펫을 사용 하 여 강조 하는 두뇌 피 한다. - 2 µ L에서에서 fibrinogen 작업 솔루션의 고 작은 원으로 유리 하단 접시의 coverslip에 적용. 트 롬 빈의 0.8 µ L을 추가 하 고 피 펫 팁 매우 신속 하 게 혼합. fibrinogen 섬유 소에 변환 되 고 유해 하기 시작.
- 두뇌 fibrinogen 작업 솔루션 (단계 3.3.1) 집게의 쌍 사이에서 앉아 고 섬유 소의 흰색 매트릭스 표시 되는 행렬에 위치. (시계 신경 세포 이미징)에 대 한 뇌 앞쪽 측면 아래로 동양. 밀어 최대한 가까이 커버 유리에. 섬유 소 응고 섬유 소의 레이어의 구성 됩니다. 한 레이어를 선택 하 고 매트릭스를 분리 하지 않고 작고 부드러운 움직임을 뇌 위에 접어.
- 뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다.
참고: 때 집게와 두뇌를 처리, 건조 또는 물리적 스트레스 부과 주의 해야 합니다.
- 뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다.
- 트 롬 빈의 행동을 막으려고 포함된 뇌 위에 샘/항생제의 20 µ L를 추가 합니다.
- 나머지 머리를 탑재 하는 절차를 반복 합니다. 그것은 최대 5 유리 하단 접시에 6 두뇌를 포함 수 있습니다.
- 장기 라이브 이미징에 대 한 내부 잘 (유리 부분)에서 샘/항생제의 600 µ L를 추가 합니다. 매체 위에 미리 잘라 PTFE 멤브레인을 하단 (3.1.5) (그림 1A)의 플라스틱 부분에 적용 하는 진공 그리스에 그것을 막대기.
- 약리학 적인 분석에 대 한 샘/항생제 (그림 1B)의 2 개 mL로 접시를 채우십시오.
매체의 osmolality은 신경 세포의 생존에 중요 한 참고: 그것을 매체의 증발을 피하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 장기 이미징 실험에 대 한 그것은 문화 접시 PTFE 막으로 밀봉 하는 데 필요한입니다. 반면 단기 실험, 멤브레인 씰링 필요 하지 않습니다 접시 중간의 2 개 mL 가득 고 습도 챔버에 모니터링.
4. 시간 경과 이미지 수집
- 페 트리 접시 홀더 무대 최고 습도 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 놓습니다.
- 인식 탭에서 z-스택 패널에가 고 현미경 소프트웨어 (2 µ m × 40에서 그림 2 와 그림 3, 영화 1에 표시 된 실험)에서 z-섹션 단계를 설정. coverslip와는 coverslip 가까이 뇌 explant의 표면에 끝에서 멀리 비행기에서 z 스택의 시작 부분을 설정 합니다. 비록 뇌 움직임 무시할 수 있습니다, 그리고 시작 및 z 스택의 끝 부분에서 여분의 z-섹션 추가.
- 마크 & 패널 설정 다 위치 이미지 수집을 찾을로 이동 합니다. 40 X 목표 1 두뇌 반구 보기의 필드 내에서 캡처할 수 있습니다.
- 수집 모드 패널 및 선택 xyzt (z-스택 시간 경과)로 이동 합니다. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 주파수 매개 변수 설정.
참고: 원하는 주파수와 시간 경과 이미지를 취득 합니다. Note 시간 경과 간격 2 시간 보다 짧은 장기 라이브 영상 (24-72 h) 적은 자전거 신경에 있는 결과 경향이 아마도 때문에 뉴런의 생존 능력을 감소 시킨다. 데이터 볼륨 확장 시키는 데이터 분석 및 저장 더 도전 이미지 수집 증가의 비율으로.
5. 약리 치료 단기 라이브 영상으로 뇌 Explants의
참고: 다음 절차는 본질적으로 동일 장기 이미징에 대 한 하지만 PTFE 멤브레인을 필요 하지 않습니다. 화학 물질 문화에 추가 될 때 빛을 파랑 머리 노출 피하려고 현미경 붉은 빛으로 어두운 방에 두어야 한다.
- 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 약물 응용 프로그램 전에 초기 계획 데이터를 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.
- 베이스 후 검사가 완료 되 면, 현미경 시스템의 스캔 헤드를 리프트. 무대 최고 습도 컨트롤러의 뚜껑을 제거 하 고 매우 신중 하 게 그것을 이동 하지 않고 유리 하단 접시의 뚜껑을 제거 합니다.
- 필요한 경우 적절 한 양의 문화 매체를 제거 합니다. 매체에서 실험적인 솔루션을 추가 하 고, 신중 하 게, 아주 부드럽게 조화를 살 균 파스퇴르 피 펫 두뇌 explants 건드리지 않고.
참고: PDF의 목욕 용, (10 %DMSO)에서 2 µ M PDF 재고 솔루션을 사용 합니다. - 유리 바닥 접시와 습 한 챔버 스캔 머리 뚜껑을 교체 합니다. 사용 하 여, 현미경 챔버 주위 검은 불투명 천으로 재조 정할.
- 라이브 스캔 모드에서 그들의 원래 위치에서 두뇌 인지 확인 하십시오. 필요한 경우 조정 합니다.
- 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.
참고: 여기 우리가 테스트 시간 경과 이미지 최대 10 h에 대 한 모든 시간을 획득.
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Representative Results
여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.
비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 부 되었고 마지막 동안 장기 문화에 대 한 설정 그냥 사전 LD 주기의 단계 빛 어두운 단계 (그림 1A 와 2B). 시간 경과 영상 DD에서 수행 하 고 뇌 explants 64 h에 대 한 모든 2 h 몇 군데 있었다. 관심의 뉴런을 포함 하는 합계 스택 창조 되 고 배경 빼기8후 신경에 해당 하는 영역의 평균 형광 강도 측정 했다. 기자 표현의 rhythmicity를 결정 하려면 최대 엔트로피 스펙트럼 분석 (메사) 및 수동 검사 사용된8했다. Circadian 리듬의 기간을 표시 하는 두 개의 DN2s ~ (그림 2A, 2c, 및 영화 1) 26 h 당 TDT 수준에 여기에 표시 됩니다.
본질적으로 같은 문화 설치 (그림 1B)를 사용 하 여, 당 TDT의 표현에 neuropeptide PDF의 효과 연구 했다. 동일한 유전자 형의 방황 아닌 애벌레의 머리 위에서 설명한 대로 했다 해 부 ZT1에서 (Zeitgeiber 시간 1, 빛에 LD에서 후 1 시간) 또는 ZT13 (조명에서 후 1 시간). 애벌레를 포함 하는 튜브 즉시 얼음 인큐베이터에서가지고 간 후에 차게 했다. ZT13에서 튜브도 블루 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 포장 했다. 뇌 해 부 얼음에서 수행 하 고 해 부 두뇌 얼음에 보관 했다. ZT13에서 찍은 두뇌 가능한 알루미늄 호 일로 덮여 있었다. 따라서,이 절차는 자연 채광으로 조명 연구실에서 수행 되었다, 하지만 고분자 합성 및 대사에 빛 노출의 효과 최소 이었다. 두뇌는 초기 계획 데이터를 1 시간 간격으로 두 번 검사 되었다. PDF 또는 차량 (DMSO) 문화 매체에 추가 되었습니다 하 고 시간 경과 이미지 후속 6 헤 당 TDT에 대 한 모든 1 시간을 인수 했다 식 프로필 높아졌습니다 하루 종속의 시간 LNvs와 DN1s, 그리고 ZT13에서 PDF 추가 시 형광 강도 낮은 범위는 DN2s에 (그림 3)8.
이 결과 이미징 기술과 문화 방법을 여기에 설명 된 사용 당 TDT 리듬에서 눈에 띄는 phototoxicity, photobleaching 또는 초점 드리프트 없이 단일 셀 해상도의 녹화를 나타냅니다.
참고: 이미지 분석 했다 고 피지28를 사용 하 여 처리. 10 X 반복 deconvolution AutoQuant와 Imaris 수행 되었다. 시간 경과 이미지에 사소한 드리프트 ImageJ의 정확한 3D 드리프트 플러그인 수정 했다.
그림 1: L3 애벌레 두뇌와 두뇌 explant 문화 설치에 시계 뉴런의 해부학. (A 와 B) 뇌 문화 설치 장기 이미징 (A) 및 단기 이미징 (B) 약리 분석 실험의 회로도. (A), 진공 기름 (노란색)는 PTFE 멤브레인 연결할 유리 하단 접시의 플라스틱 부분에 적용 되었다. (C) ZT2에서 LD 최 L3 애벌레 뇌의 대표 이미지. 분자 시계 기자 당 TDT (마젠타) 표현 Clk (856)-gal4에 의해 구동 하는 UAS-mCD8::YFP(green) 이라고 표시 된 시계 뉴런에 표시 됩니다. L3에서 차별화 된 시계 뉴런의 3 그룹이 있다: 5 LNvs (를 포함 하 여 PDF를 표현 하지 않는다 5 LNv), 2 DN1s 및 2 DN2s, 흰색 화살촉으로 표시. 시계 신경 세포의 핵에 당 TDT 표현의 note YFP 부정 당 TDT 양성 세포는 명과 및 아직도 발전 시계 뉴런의 다른 하위 그룹. 눈금 막대 = 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 장기의 대표적인 결과 라이브 이미징 애벌레 시계 뉴런의. (A) 교양된 뇌의 장기 시간 경과 영상에서 DN2s의 보기를 확대. 뇌 explants는 ZT11에서 해 부 LD 최 L3 애벌레에서 준비 되었다. 이미지 CT17에서 매 2 시간을 촬영 했다 (Circadian 시간 17, DD에서 벗어나 주관적 빛 후 5 h) dd. 결합 된 64 h에 대 한 당-TDT (마젠타색) 및 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (녹색)에 의해 구동의 이미지는 각 패널의 왼쪽에는 고 당-TDT 수준으로 표현 블루 그라데이션으로 heatmap 오른쪽에 있습니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 만 표현, 이미지 3D 보정 드리프트와 10 X 반복 deconvolution 처리 했다. (B) 실험의 타이밍. (C) 상대 형광 강도 나타내는 그래프 정규화 t = 0의 두 DN2s (파란색과 빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 약리 실험에 대 한 라이브 이미징의 대표적인 결과. LD 최 애벌레 머리 해 부 되었고 ZT1 또는 ZT13, 및 PDF에서 탑재 (2 µ M) 또는 DMSO는 ZT2 또는 ZT14에 적용 되었다. 두뇌 explants 당 TDT 식 시간 경과 현미경 매 시간 모니터링 했다. (해당 ZT1 또는 ZT13) 이미징의 시작 값으로 정규화 의미 형광 강도 ± SEM 표시 됩니다. 빨간색 화살표는 PDF 또는 차량 응용 프로그램을 (ZT2 또는 ZT14)의 시간을 나타냅니다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001와 * * * p < 0.0001 여러 비교 Sidak의 보정으로 양방향 ANOVA에 의해. 32 LNvs, 18 DN1s 및 16 DN2s 최소 각 데이터 요소에 대 한 분석 했다. 이 그림은 참조8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 애벌레 DN2 시계 뉴런의 장기 라이브 영상. 시간 경과 영화 교양된 애벌레 두뇌의 ZT11에서 해 부 그리고 dd. 확대 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4에 의해 구동 단일 반구에 DN2s의 표시에 몇 군데. 이미지 64 헤 당 TDT에 대 한 모든 2 h (마젠타)을 인수 했다 및 YFP (녹색) 왼쪽에는 고 당-TDT 레벨 heatmap (블루 그라데이션)로 표시 오른쪽에 있다. 눈금 막대 = 10 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 단계 | 시 약 | 농도 |
| 1. 혼합 시 약. | KH2포4 | 4.18 m m |
| CaCl2 | 1.05 m m | |
| MgSO4.7H2O | 0.7 m m | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0.7 mg/ml | |
| 포도 당 | 2 mg/ml | |
| 트 레 할 로스 | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric 산 | 0.35 mg/ml | |
| Fumaric 산 성 | 60 μ g/ml | |
| 금산 | 0.6 mg/ml | |
| 호박 산 | 60 μ g/ml | |
| 효 모 추출 물 | 2 mg/ml | |
| 열 비활성화 FCS | 20% | |
| dH2O, 압력가 마로 소독 | ||
| 2. 소독 0.22 μ m 필터. | ||
| 3. 72 h. 보육에 대 한 어둠 속에서 25 ° C에서 세포 배양 세균 이나 곰 팡이 오염 없는 것으로 대 한 인큐베이터에서 품 어. | ||
| 4. 시 약을 추가 합니다. | 인슐린 | 2 μ g/ml |
| 두번째-트리 스 pH 6.8, 0.22 μ m 필터와 소독 | 5 mM | |
| 5. pH 6.8 6.9를 조정 합니다. | NaOH (10 N) | ~ 8 방울 |
| 6. 0.22 μ m 필터와 소독. | ||
| 7. 약 5 ml 플래시를 수-80 ° c.에 LN2 저장소에 고정 Whithin 60 일 사용 하십시오. | ||
| 참고: 큰 볼륨에 대 한 진공에 의해 필터 최고 병 소독, 그렇지 않으면 주사기 필터를 사용 하 여. 문화 후드에서 오픈 aliquots입니다. 단일 사용 합니다. | ||
표 1: 샘 매체 (1x)의 초파리 뇌 문화에 대 한 준비. 문화 두뇌 explant에 매체입니다. 모든 단계는 매체의 인큐베이션을 제외한 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
| 단계 | 시 약 | 농도 |
| 1. 혼합 시 약. | HEPES-코, pH 7.4 | 99 m m |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 54mm | |
| NaH2포4 | 1.7 m m | |
| KH2포4 | 2.2 m m | |
| 포도 당 | 33 m m | |
| 자당 | 438 m m | |
| 압력가 dH2O | ||
| 2. 0.45 μ m 필터와 소독. | ||
| 3. 4 ° C에서까지 저장할 6 개월. | ||
| 참고: 실험적인 사용을 위해: 압력가 dH2O와 X 1로 희석 하 고 진공으로 0.45 μ m 필터 최고 병 또는 필터 주사기 소독. 4 ° c.에 계속 오픈 문화 후드, 여러 사용. | ||
표 2: DSS의 준비 (10 배). 염 분 솔루션 초파리 두뇌를 해 부입니다. 문화 후드에서 준비 합니다.
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Discussion
여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 뇌 explant의 동원 정지 가스 교환을 방해 수도. 따라서, 연구에서 현상에 대 한 (말 장난 의도) 중 찾는 성공적인 프로토콜 열쇠입니다. 여기 설명 하는 방법은 일 시간 규모에서 형광 circadian 기자의 식 모니터링 최적화 됩니다. 그것은 또한 중요 한 프로세스는 불변 하 고 주의 실행 초파리 신경 생물학에 다른 과목 공부에 적용 됩니다.
이 프로토콜에서 뇌 explants는 3D 매트릭스를 생성 하는 섬유 소 응고에 움직일 수 있습니다. 비록 동원 정지에 대 한 다른 방법 존재, 폴 리 또는 커버 유리의 laminin 코팅 등이 천천히 애벌레 머리29 의 개발 하 고 따라서 그들의 생리 적인 견고성을 손상 수 있습니다. 자연, 섬유 소 뇌 explant 도달 하는 영양분을 허용 하도록 충분히 느슨한 이며 뇌16그것을 부 수 없이 커버 유리에 가까운가 대 한 충분 한 끈 적 한 우수한 매트릭스를 제공 합니다. 이러한 장점 때문에 섬유 소 응고 방법 세포 배양에 대 한 다양 한 프로토콜에 고용 되어 및 뇌 explant 문화14,,1729,30,31,32 ,,3334. 이상 몇 시간 마지막 비교적 단기 실험에도 애벌레 뇌 문화에 대 한 섬유 소 3 차원 매트릭스를 사용 하는 것이 좋습니다. 3 차원 매트릭스 없이 애벌레 뇌 문화 두뇌 개발에 필요한 실제 지원의 부족으로 인해 엉뚱한 결과 (데이터 표시 되지 않음), 아마 제공 합니다.
그것은 신중 하 게 전에, 고통의 어떤 표시 든 지 감지 하 시간 경과 영상 중는 explant와 조직에 세포의 형태를 관찰 하는 것이 중요. 여기에 제시 된 실험에서 막 도약 mCD8::YFP의 표현 했다 뉴런의 본래 형태와 뇌 explant 실용적이 고 내내 건강 한 남아를 나타내는 예상 대로 당 TDT 세포질과 핵 감지 되었습니다. 화상의 기간입니다. Circadian rhythmicity는 최대 72 h에 대 한 하지만 그 두뇌 explants 최대 5 일 동안 신경 세포와 뇌 (데이터 표시 되지 않음)의 무결성을 악화 하지 않고 교양 수 있습니다 관찰. neurites 될 점이 나 버스트 뉴런의 세포 체,이 일반적으로 phototoxicity의 표시 하 고 쉽게 적응 현미경 설정에 의해 차단 하는 경우 그에 따라. 예를 들어 스마트 이득 및 탐지의 창, 작은 구멍 크기 증가 하면서 레이저 전력을 줄여 보십시오. 그러나, 일반적으로, 기자의 형광 강도 높은 강도 레이저 조명 없이 좋은 신호 대 잡음 비율의 영상을 얻기 위한 제한 요소 이다. 따라서, 기자, fluorophore, 그리고 기자 복사본 수의 선택의 설계는 생존 문제를 해결할 때 고려해 야 할 첫 번째 것 들. (여기에 제시 된 실험에서의 tdt 당 기자 4 복사본 사용 되었다.)
손상 된 뇌 문화의 다른 증상 경과 이미징 및 뇌 explant에서 액체의 움직임 동안 반구의 버스트를 포함합니다. 이것은 마이크로 구멍 두뇌의 해 부 동안 발생으로 인해입니다. 애벌레의 뇌에 연결 된 imaginal 디스크 제거 구멍의 주요 원천입니다, 따라서 우리가 좋습니다 그것.
생물 발광 영상에 형광 circadian 라이브 이미징의 장점은 높은 공간 해상도입니다. 또한, 리듬 기자 함께 세포 마커를 사용 하 여 쉽게 셀 형 특이성의 분석을 촉진 한다. 대조적으로, 생물 발광 우수한 시간적 해상도 우수한 신호 대 잡음 비율19,,2021있다. 그럼에도 불구 하 고, 전반적인 뇌 생물 발광에 의해 몇 군데 당 자전거 뉴런의 수가 아니다 우수한 우리의 방법8,,1921얻은 숫자에 비해. 대부분의 경우, 생물 발광19와 같이 우리의 방법으로 검출 하는 형광 기자의 리듬의 시계 ( 그림 2C참조), 동일한 클러스터 내에서 동기화 됩니다. 시계 신경 클러스터 사이의 위상 차이 형광 및 생물 발광 circadian 이미징8,,1921에서 관찰 되었다. 따라서, 모두 방법론 교양된 두뇌에 circadian 리듬을 관찰에 동등 하 게 유효한 되며 연구의 목적에 따라 개화와 생물 발광 사이 선택 하 여야 한다.
이 방법의 주요 기술적인 어려움 포함 단계입니다. 거꾸로 현미경 confocal 영상 빠른 검색에 대 한 호출 하는 프로토콜 때문에 조직에 깊은 이미징 하는 경우에 특히 뇌 조직에 산란 형광 탐지 감소, 뇌 explants 거치 되어야 한다로 가까이 커버 유리에 가능 합니다. 또한, 이미징 결과의 재현성의 뉴런의 z 위치의 일관성에 따라 달라 집니다. 따라서, 그것은 오리엔트 및 연습을 요구 한다 같은 방식으로, 항상 두뇌를 탑재 하는 것이 중요입니다. 신경 이미지를 클러스터에서 해부학 다른 위치, 다른 뇌 explant 방향으로 별도 실험을 실행 하는 데 필요한 수 있습니다. 두 광자 현미경 및 현미경 검사 법 조명 시트와 같은 조직, 경작 하지 않아도 깊은 조직 라이브 이미징에 대 한 대체 방법이 있습니다. 후자는 성공적으로 사용 되었습니다 라이브 초파리 두뇌22,23이미지 circadian 칼슘 역학. 그러나, 밝은 시트 현미경 confocal 현미경 검사 법 보다 낮은 공간 해상도 있으며 따라서 단일 셀 해상도 이미징에의 응용 도전 남아 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜 애벌레 뇌 explants 형광 기자 일 동안 시간 경과 이미지 수집 및 생물 학적 리듬의 정량 분석을 지 원하는 조건 하에서 간단한 문화 시스템을 결합 한. 있지만 위에서 설명한 특정 제한이 있습니다, 방법론은 애벌레와 성인 초파리 두뇌에서 다른 기자 들에 이미지에 맞게 고 추가 감도 해상도 증가 하도록 수정 수 있습니다. 예를 들어 axonal 계획 두뇌에 깊이 있는 또는 기공을 전송 2 광자 현미경35우리의 두뇌 explant 문화 기술을 결합 하 여 감지 될 수 있습니다. 그, 그것은 여전히 성인 뇌의 미토 콘 드리 아 등 세포의 라이브 이미지를 수행할 수 explants이 프로토콜 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여. 우리는 또한 약리 분석 실험에서 실험 솔루션의 응용 프로그램 목욕이이 프로토콜의 변화를 제시. 하나 수동으로 대체 약물을 배양 하거나 관류 챔버18,36을 사용 하 여 "펄스-체이스" 실험을 수행 하기 위해이 프로토콜을 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
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