Summary
Målet med denne protokollen er å etablere ex vivo Drosophila larver hjernen kultur optimalisert for å overvåke circadian molekylær rytmer med langsiktige fluorescens tidsinnstilt bildebehandling. Bruk av denne metoden å farmakologiske analyser er også diskutert.
Abstract
Circadian pacemaker krets orkestrerer rytmisk atferdsmessige og fysiologiske utganger koordinert med miljømessige stikkord, for eksempel natt. Molekylær klokken i hver pacemaker Nevron genererer døgnrytme i genuttrykk, som ligger til grunn de rytmisk neuronal funksjonene som er avgjørende for driften av kretsen. Undersøkelse av egenskapene til den personlige molekylære oscillatorer i forskjellige underklasser av pacemakeren neurons og deres samspill med neuronal signalering gir en bedre forståelse av circadian pacemaker krets. Her presenterer vi en time-lapse fluorescerende mikroskopi tilnærming utviklet for å overvåke molekylær urverk i klokken nevroner i kulturperler Drosophila larver hjernen. Denne metoden tillater flerdags innspillingen av rytmene av genetisk kodet fluorescerende circadian journalister på encellede oppløsning. Dette oppsettet kan kombineres med farmakologiske manipulasjoner nøye analysere sanntid svar av molekylære klokken på ulike forbindelser. Utover døgnrytme tilbyr denne multipurpose metode i kombinasjon med kraftige Drosophila genetisk teknikker muligheten til å studere ulike neuronal eller molekylære prosesser i live hjernevev.
Introduction
Circadian klokker hjelp organismer å tilpasse seg de periodiske miljøendringer generert av 24 h rotasjonen av jorden. De sammenstøt transcriptional-translasjonsforskning tilbakemeldingssløyfer ligger vanligvis molekylær maskiner av circadian klokker over arter1. Circadian pacemaker krets består av klokke inneholder neurons integrerer tid-til-dag informasjonen de miljømessige signaler, som lys/mørke (LD) og temperaturen sykluser, å organisere rytmene av en mengde daglig fysiologiske og atferdsmessige prosesser2,3. Samordning av molekylære rytmer med nevrale innganger og utganger er kritisk viktig for driften av circadian krets, men fortsatt bare delvis forstått.
I Drosophila, kjernen i molekylær klokken KLOKKESYKLUS (CLK/CYC) heterodimer aktiverer transkripsjon av perioden (per) og tidløs (tim). PER og TIM danner et kompleks og angi kjernen, hvor de hemme transcriptional aktivitet av CLK/CYC og dermed egne transkripsjon. Post-transcriptional og post-translasjonell forårsake forsinkelser mellom CLK/CYC-mediert transkripsjon og undertrykkelse av PER / TIM, sikrer generasjonen av ca 24-h molekylær svingninger1,3,4 . 150 nerveceller som inneholder disse molekylær klokker skjema flyr en krets å administrere circadian opptreden av voksen5. En mye enklere og fullt funksjonelt circadian krets bestående av 3 grupper av klokken neurons - 5 ventrale Lateral Neurons (LNvs; 4 PDF-positive LNvs og en PDF-negativ LNv, se nedenfor), 2 Dorsal Nevron 1s (DN1s) og 2 Dorsal Nevron 2s (DN2s) - er til stede i den larver hjernen6,7.
Enkel larver circadian krets tilbyr en utmerket modell for å studere interaksjonen mellom Inter neuronal kommunikasjon og molekylære urverk. Bruke vår nylig utviklede fluorescerende reporter PER-TDT, som etterligner nivåer av PER protein og subcellular plassering, søkt vi å karakterisere dynamikken i molekylær urverk i forskjellige klokke Nevron undergrupper i larver circadian krets 8. videre å vite den viktigste rollen neuropeptide pigment-spre faktoren (PDF) produsert av 4 LNvs i å regulere biologiske rytmer på neuronal nivå9,10,11, ønsket vi å undersøke direkte effekten av PDF på molekylære klokker. Dette utviklet vi en metode for å overvåke circadian genuttrykk rytmer i larver hjernen explant over flere av time-lapse AC confocal mikroskopi. Protokollen ble også tilpasset farmakologiske analyser å teste effekten av PDF eller andre forbindelser på nivået av PER-TDT. Dermed består tilpasning av gjør hjernen explant kulturen tilgjengelig medikament programmet, øke midlertidig løsning og imaging for en kortere varighet.
Ex vivo kulturen i Drosophila hjernen til forskjellige utviklingsstadier har vært tidligere etablert12,13,14,15,16,17 ,18. Mens disse protokollene er brukt for imaging ulike biologiske fenomener, noen av dem er ikke kompatible med imaging encellede oppløsning eller støtter ikke kulturen i flere timer. Alternative metoder for å utføre langsiktige live bildebehandling circadian neurons i Drosophila inkluderer bioluminescens bildebehandling molekylær rytmer19,20,21 og fluorescens avbilding av kalsium indikator med lys ark mikroskopi22,23. Selv om bioluminescens bildebehandling kan oppnå høyere timelige oppløsning og lys ark mikroskopi kan tilpasses i vivo bildebehandling, de er begrenset på romlig oppløsning og krever spesialisert mikroskop systemer.
Metoden beskrevet her er skreddersydd for å visualisere fluorescerende signaler i hele hjernen kultur encellede oppløsning over flere dager. Denne lettvinte og allsidige metoden kan tilpasses til bildet kultivert voksen fly hjerner og farmakologiske eksperimenter for å studere problemer i Drosophila nevrobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av lager løsninger Under kultur hette
- Forberede 400 mL 1 x Schneider aktive Medium (SAM) optimalisert for ex vivo kultur larver hjerner (endret referanse24,25) (tabell 1). Aliquot til 5 mL og flash fryse i flytende nitrogen (LN2), lagre på - 80 ° C.
- Klargjør 1 x Dissecting saltvannsoppløsning (DSS) ved utvannende 10 x lagerløsning (endret referanse26) (tabell 2).
- Aliquot fibrinogen til 10 mg og butikk på 4 ° C for en enkelt bruker.
Forsiktig: Veie fibrinogen under laminær strømning, bærer hansker, som det er skadelig. - Forberede trombin lagerløsning i SAM (1500 NIH enhet/mg) og aliquot til 10 µL, flash fryse i LN2 og holde på-80 ° C.
Forsiktig: Bruk hansker når du håndterer trombin som det er skadelig. - Aliquot lager løsning av 100 x Penicillin-Streptomycin. Holde på 20 ° C.
- Skjær sirkler av polytetrafluoroethylene (PTFE) membran (se materialer tabell) til størrelsen som passer innsiden av et glass bunnen rett. Skyll i 70% EtOH og deretter i autoklaveres dH2O. Sterilize og tørr under laminær strømning med UV. Vær et sterilt Petriskål. Enkel bruk.
Merk: PTFE er en porøs fleksibel membran som gjør gassutveksling og hindrer medium fordamper langsiktige innspillingen.
2. time-lapse mikroskopi oppsett
Merk: Følgende oppsett for tandem skanner invertert AC confocal mikroskop (se materialer tabell) utstyrt med en resonant skanner (8000 Hz). Systemet inneholder en svært følsom Foto-multiplikator detektor, som sammen med resonans skanneren hindrer Phototoksisitet og photobleaching. Temperatur og fuktighet er kontrollert i et mikroskop miljømessige kammer (se Materialer tabell) som dekker det meste av mikroskopet.
- Plass en scene-top fuktighet kammer.
- Slå på temperatur og fuktighet kontrollerne til equilibrate mikroskop kammeret til 25 ° C og 80% fuktighet.
- For å utføre eksperimenter i konstant mørke (DD), dekk mikroskop miljømessige kammer med en ugjennomsiktig klut (med mindre mikroskop kammeret er laget av en ugjennomsiktig materiale).
- Hvis bruker en vann-nedsenking målsetting, plasserer en vann nedsenking mikro Dispenser på målet og programmet en protokoll med den Autoimmersion målet programvaren til å dispensere vann konstant under tidsinnstilt bildebehandling.
Merk: Vann nedsenking mål en vannbeholder eller tørr linsen er anbefalt for langsiktig live bildebehandling, som andre typer nedsenking medium ville tørke ut. - Plass en Petriskål holder på scenen, i luftfuktighet kammeret.
- Start mikroskop programvaren og velg resonans skanner modusen første dialogboksen. Velg OK for å initialisere scenen når du blir spurt. Gå til konfigurasjon-kategorien og maskinvarekonfigurasjon for å slå på relevante laser linjene.
- Gå til anskaffe kategorien og XY-panelet velge toveis modus og angi bilde oppkjøpet parametere.
Merk: Beskrevet tenkelig oppsettet presenteres her (figur 2, Figur 3 og film 1) er optimalisert for å observere circadian uttrykk for bestemte fluorescerende journalister. Følgende parametere ble valgt som best passer våre spesifikasjoner: 40 X vann nedsenking mål, 8 X linje gjennomsnitt med 512 × 512 bildeoppløsning. Flerfarget bildebehandling, sekvensielle bildeopptak kreves når utslipp bølgelengden til en fluorophore og eksitasjon bølgelengden til en annen overlapping (her, bølgelengder av gule fluorescerende Protein (YFP) utslipp og tomat eksitasjon overlapping). Velg sekvensiell modus "mellom stack" som det er den raskeste og bevegelse av klokken neurons er ubetydelig under oppkjøpet av en Z-stabel. Mikroskopi innstillingene bør være tilpasset sikte på hvert eksperiment.
3. oppsett av larver hjernen Explant kultur
Merk: Hele prosedyren fra disseksjon til innebygging av hjernen explants tar ~ 30 min.
-
Forberedelse av reagenser under kultur hette.
- Tine en aliquot av trombin og holde ved romtemperatur før innebygging trinnet (trinn 3.3). Enkel bruk.
- Tine raskt en aliquot av SAM på 37 ° C og holde på is en enkel bruk.
- Legge til SAM en 10 mg aliquot av fibrinogen til 10 mg/mL, sveip forsiktig og ruge på 37 ° C i minst 30 min og under innebygging trinnet (trinn 3.3). Enkel bruk.
Merk: Ikke ruge fibrinogen løsning mer enn 2t som det begynner å danner. - Tine en aliquot av 100 x lager Penicillin-Streptomycin. Forberede 2,5 mL av SAM som inneholder 1 x Penicillin-Streptomycin (SAM/antibiotika). Holde ved romtemperatur.
Merk: Store resterende 100 x lager Penicillin-Streptomycin i 4 ° C opptil 1 måned. - Forberede en aliquot av 500 µL fra gjenværende SAM. Hold på is.
- For langsiktige bildebehandling, autoklaveres vakuum fett gjelder delen plast i bunnen av glasset bunnen rett (figur 1A) og sterilisere under laminær strømning med UV.
-
Disseksjon av det sentrale nervesystem og ventrale nerve ledningen.
- Tang og 2 x tre-og glass disseksjon retter med 70% EtOH. Hell 400 µL av DSS i 4 brønner og 400 µL av SAM i en brønn. Hold på is.
- Scoop ut fly medium som inneholder larver og velge ikke-vandrende 3dje skikkelsen Larvene (L3) med tang. Skyll suksessivt i 2 DSS-fylt brønner. Oppbevar dem i 3 DSS-fylte brønnen på isen anesthetizes larver.
Merk: L3 varer ca 2 dager på 25 ° C. Å hjernen fysiologisk relevante tidsramme vi valgte å bruke ikke-vandrende L3 larver. Andre undergrupper av klokken neurons, som l-LNvs og DN3s, begynner å dannes på vandrende L3 scenen, men de er ikke nødvendigvis sykling ennå (data ikke vist). Derfor, selv om det er mulig å bilde sykling klokke neurons på dette stadiet (data ikke vist), det er viktig å nøye skille allerede funksjonelle larver klokke neurons fra utviklingsland for dataanalyse. Non-vandrende L3 vises rundt 4 til 4,5 dager etter egglegging på 25 ° C. For å bruk denne protokollen for å studere biologiske rytmer, kan du synkronisere (entrain) utvikle Larvene i 12 h/12 h LD sykluser ved 25 ° C for 3 dager før samle L3 larver. - Dissekere larver hjernen med fine tang i 4 DSS-fylte brønnen, som ikke har vært brukt i skylle larvene, bruker de innsiden ut metode27.
- Kort klipp Larven i to, forsiktig knip munnen kroker med en tang og rulle opp innsiden ut kroppen veggen med andre par pinsett, dermed utsette hjernen. Gratis hjernen ved å kutte ut alle trachea og nerver som knytter det til resten av kroppen.
- Sug opp hjernen i ca 3 µL av DSS med en 20 µL pipette (pre skylles med DSS) og dispensere SAM-fylte brønnen. Gjenta på opptil 7 hjernen.
Merk: Disseksjon skal utføres på en kald overflate å holde Larvene anesthetized og hjernen kjølt. For eksempel plass disseksjon rett på kjøling blokk koblet til en pumpe å sirkulere is-kjølt vann. Disseksjon prosedyren tar ~ 30 s per hjernen. Det er viktig å holde øye/antennal imaginal plater knyttet til hjernen og ventrale intakt. Rive av disse delene vil skade hjernen og redusere kulturen. Også unngå å utsette hjernen til luft. Før aspirating første hjernen, pipette opp og ned DSS som inneholder deler av dissekert larvene, som det hindrer hjernen stikker til veggen tips.
-
Innebygging av hjernen explants i en 3D matrise og montering (~ 20 min).
- Senk dissekert hjernen i fibrinogen fungerende løsning (fibrinogen siste konsentrasjon ~3.3 mg/mL, 10,5 µL per hjernen) som følger:
- Sug opp 3,5 µL av SAM/antibiotika (med samme spissen brukes i delen 3.2.3). Sug opp dissekert hjernen fra dissection godt inn i samme pipette spissen uten dispensing SAM/antibiotika mediet i spissen.
- Dispensere hjernen og mediet på lokket på en steril Petriskål. Legge til en annen 3,5 µL av SAM/antibiotika og 3,5 µL av varm fibrinogen/SAM 10 mg/mL løsning på miste inneholder hjernen. Bland løsningen rundt hjernen forsiktig ved pipettering med Pipetter 20 µL tips.
Merk: Bruke en pipette i stedet for tang i dette trinnet unngår understreker hjernen. - Ta 2 µL fibrinogen arbeider løsningen fra rullegardinmenyen og bruker den på dekkglassvæske av glass bunnen rett som en liten sirkel. Legg 0,8 µL av trombin og bland raskt med en pipette tips. Fibrinogen konverteres til fibrin og begynner å danner.
- Ta hjernen som sitter i fibrinogen arbeider stoppløsningen (trinn 3.3.1) mellom tang og plasser den på matrisen når en hvit matrise av fibrin er synlig. Plasser siden hjernen fremre ned (for imaging klokke nerveceller). Trykk den ned så nært som mulig til dekket glasset. Fibrin blodpropp består av lag av fibrin. Velg Lag og kaste det på hjernen med små og myke bevegelser uten frakobling matrix.
- Gjenta 2 til 3 ganger fra ulike deler av blodproppen å stabilisere hjernen.
Merk: Når du håndterer hjernen med tang, være forsiktig med å tørke den eller innføre det en fysisk stress.
- Gjenta 2 til 3 ganger fra ulike deler av blodproppen å stabilisere hjernen.
- Legge til 20 µL av SAM/antibiotika over innebygde hjernen til å stoppe handlingen av trombin.
- Gjenta for å montere gjenværende hjernen. Det er mulig å legge opp til 5 til 6 hjerner på et glass bunnen rett.
- For langsiktige live bildebehandling, legge 600 µL av SAM/antibiotika i indre godt (glasset del). Plasser en pre-cut PTFE membran på mediet og holde det til vakuum fett brukes på plast del av bunnen (3.1.5) (figur 1A).
- For farmakologisk analyser, fylle fatet med 2 mL SAM/antibiotika (figur 1B).
Merk: Det er svært viktig å unngå fordampning av medium, som osmolality av mediet er kritisk gjennomførbarheten av neurons. Derfor for langsiktig tenkelig eksperimenter er det nødvendig å forsegle kultur parabol med PTFE membran. Mens for kortsiktige eksperimenter, tetting membranen ikke er nødvendig så lenge parabolen fylles med 2 mL medium og overvåkes i en fuktet kammer.
4. time-lapse bildeopptak
- Plass glass bunnen rett på Petriskål omslag i scene-top fuktighet kammeret.
- Gå til z stabel panelet i kategorien anskaffe og sette z-delen trinnene fra mikroskop programvare (2 µm × ~ 40 eksperimenter som vist i figur 2 og Figur 3og film 1). Angi begynnelsen på en z-stabel på flyet lengst i dekkglassvæske og slutten på overflaten av hjernen explant, nær dekkglassvæske. Selv om hjernen bevegelser er ubetydelig, legge ekstra z-partiene på begynnelsen og slutten av z-stakken.
- Gå til merke & Finn panelet og oppsett bildeopptak multi-posisjon. Med en 40 X mål, kan 1 hjernen halvkule hentes i en synsfelt
- Gå til oppkjøpet modus-panelet og velger xyzt (z-stack time-lapse). Gå til engangskjøp panel og angi ønsket tid intervall og frekvens parametere.
Merk: Hente time-lapse bilder med ønsket frekvens. Merk at langsiktige live bildebehandling (24-72 h) med tidsintervallet forfalle kortere enn 2t gjerne resulterer i færre sykling neurons, sannsynligvis fordi det reduserer levedyktigheten til neurons. Datavolumet utvider som frekvensen av bilde oppkjøpet øker, som gjør dataanalyse og lagring mer utfordrende.
5. farmakologisk behandling av hjernen Explants med kortsiktige Live bildebehandling
Merk: Følgende er egentlig det samme som for langsiktig bildebehandling, men krever ikke en PTFE membran. For å unngå å utsette hjerne til blått lys når kjemiske er lagt til kultur, plasseres mikroskopet i mørke rom med rødt.
- Gå til engangskjøp panel og angi ønskede tidsintervallet og antall scan for å få den opprinnelige data før medikament programmet. Starte skanning.
- Etter grunnlinjen skanningen er fullført, løfte Skannerhodet av mikroskopet. Fjern lokket på scenen-top fuktighet kontrolleren og nøye fjerne lokket av glass bunnen rett uten å flytte den.
- Fjern riktig mengde kultur medium hvis nødvendig. Legg den eksperimentelle løsningen i medium og forsiktig og forsiktig, bland med en bakteriefri Pasteur pipette uten å berøre hjernen explants.
Merk: For bad anvendelse av PDF, kan du bruke 2 µM PDF lagerløsning (i 10% DMSO). - Erstatte lokkene glass bunnen rett og fuktig kammeret og Skannerhodet. Hvis bruker, flytte svart ugjennomsiktig duken rundt mikroskop kammeret.
- Sjekk Hvis hjerner er på de opprinnelige plasseringene i live skannemodus. Juster om nødvendig.
- Gå til engangskjøp panel og angi ønskede tidsintervallet og antall skanning. Starte skanning.
Merk: Her vi testet time-lapse bilder kjøpt hver time i opptil 10 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi representant resultatene av langsiktig innspillingen av en circadian fluorescerende reporter i ex vivo larver hjernen kultur og live bildebehandling resultatene av PDF bad programmet på reporter uttrykk.
Non-vandrende L3 larver uttrykke molekylær klokke reporter PER-TDT og UAS-mCD8::YFP drevet av en klokke Nevron driver Clk (856)-gal4 (figur 1 c) var entrained i LD. Brains ble dissekert og satt opp for langsiktig kultur siste lys fase av LD syklusen bare tidligere den mørke fasen (figur 1A og 2B). Tidsinnstilt bildebehandling ble utført i DD og hjernen explants ble fotografert hver 2t 64 h. En SUM stabel som inneholder Nevron rundt ble opprettet og mener fluorescens intensiteten i området Nevron ble målt etter bakgrunn subtraksjon8. For å bestemme rhythmicity av reporteren uttrykket, ble både maksimum entropi spektral analyse (MESA) og manuell inspeksjon brukt8. To DN2s som viser døgnrytme med en ~ 26 h i PER-TDT nivåer presenteres her (figur 2A, 2 C, og film 1).
Med hovedsakelig samme kultur oppsett (figur 1B), ble effekten av neuropeptide PDF på uttrykk for PER-TDT studert. Hjernen til ikke-vandrende larver av samme genotype som beskrevet ovenfor ble dissekert enten på ZT1 (Zeitgeiber tid 1, 1 time etter lysene på i LD) eller ZT13 (1 h etter lys av). Ampullene inneholder Larvene ble umiddelbart kjølte på is etter tatt ut av inkubatoren. På ZT13, var hetteglass også pakket i aluminiumsfolie å unngå blått lys eksponering. Hjernen dissection ble utført på is og dissekert hjernen ble holdt på is. Hjernen tatt på ZT13 var dekket med aluminiumsfolie når det er mulig. Dermed, selv om denne prosedyren ble utført i laboratoriet tent med naturlig lys, effekten av lys på macromolecular syntese og metabolisme var minimum. Hjernen ble scannet to ganger med 1t intervall å få baseline data. PDF eller kjøretøy (DMSO) ble lagt til kultur medium og time-lapse bildene ble anskaffet hver 1t for påfølgende 6 h. PER-TDT profilen for expression viste en tid-av-dag-avhengige økning i fluorescens intensitet på PDF tillegg på ZT13 i LNvs og DN1s, og til en mindre grad på DN2s (Figur 3)8.
Disse resultatene indikerer at tenkelig teknikken og kultur metoden beskrevet her aktivert opptak av PER-TDT rytmer encellede oppløsning uten merkbar Phototoksisitet, photobleaching eller fokus drift.
Merk: Bilder ble analysert og behandles ved hjelp av Fiji28. 10 X iterativ deconvolution ble utført med AutoQuant og Imaris. Mindre driver i time-lapse bildene ble korrigert med riktig 3D drift plugg av ImageJ.
Figur 1: anatomi av klokken nerveceller i L3 larver hjernen og hjernen explant kultur oppsett. (En og B) Skjematisk av hjernen kultur oppsettet for langsiktig imaging (A) og farmakologiske analyser med kortsiktige imaging (B). I (A), ble vakuum fett (gul) brukt på plast del av glass bunnen rett knytte PTFE membranen. (C) et representativt bilde av en LD-entrained L3 larver hjernen på ZT2. Uttrykk for molekylær klokke reporteren PER-TDT (rosa) er synlig i klokken neurons, hvilke er benevnt av UAS-mCD8::YFP(green) drevet av Clk (856)-gal4. Det er 3 grupper av differensiert klokke nerveceller i L3: 5 LNvs (inkludert de 5 LNv, som ikke uttrykker PDF), 2 DN1s og 2 DN2s, angitt med hvite pilspisser. Merk uttrykk for PER-TDT i kjerner av klokken neurons. YFP-negativ PER-TDT-positiv cellene er glia og andre undergruppe av klokken nevroner som fortsatt utvikler. Skala bar = 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultatene av langsiktig live bildebehandling larver klokke neurons. (A) forstørret visning av DN2s fra den langsiktige tidsinnstilt bildebehandling av en kultivert hjerne. Hjernen explants var forberedt fra LD-entrained L3 Larvene dissekert på ZT11. Bildene ble tatt hver 2t fra CT17 (Circadian gang 17, 5 h etter subjektive lys av i DD) 64 h i DD. fusjonerte bilder av PER-TDT (rosa) og UAS-mCD8::YFP drevet av Clk (856)-gal4 (grønn) er til venstre for hvert panel og PER-TDT nivåer representert som heatmap med blå stigning er til høyre. Skala bar = 10 µm. For representasjon bare, ble bilder behandlet med 3D korreksjon drift og en 10 X iterativ deconvolution. (B) Timing av eksperimentet. (C) grafen representerer relativ fluorescens intensiteten normalisert ved t = 0 av to DN2s (blå og rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultatene av live-imaging for farmakologisk eksperimenter. LD-entrained larver hjernen ble dissekert og montert på ZT1 eller ZT13 og PDF (2 µM) eller DMSO ble brukt på ZT2 eller ZT14. PER-TDT uttrykk i hjernen explants var overvåket hver time av time-lapse mikroskopi. Mener fluorescens intensitet ± SEM normalisert verdi ved starten av imaging (tilsvarende ZT1 eller ZT13) vises. Røde piler indikerer tiden av PDF eller kjøretøy søknad (ZT2 eller ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og *** p < 0,0001 av toveis VARIANSANALYSE med Sidaks korreksjon for flere sammenligninger. Minst 32 LNvs, 18 DN1s og 16 DN2s ble analysert for hvert datapunkt. Dette tallet er endret fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: langsiktig live bildebehandling larver DN2 klokke neurons. Time-lapse filmen av kultivert larver hjernen dissekert på ZT11 og avbildet i DD. Magnified utsikt over DN2s i en enkelt halvkule uttrykke PER-TDT og UAS-mCD8::YFP drevet av Clk (856)-gal4 vises. Bildene ble anskaffet hver 2t for 64 h. PER-TDT (rosa) og YFP (grønn) er til venstre og PER-TDT nivåer representeres som en heatmap (blå gradering) er til høyre. Skala bar = 10 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
| Trinn | Reagenser | Konsentrasjon |
| 1. Bland reagenser. | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1.05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glukose | 2 mg/ml | |
| Trehalose | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric syre | 0,35 mg/ml | |
| Fumaric syre | 60 μg/ml | |
| Eplesyre | 0.6 mg/ml | |
| Succinic syre | 60 μg/ml | |
| Gjærekstrakt | 2 mg/ml | |
| IKKE inaktivert FCS | 20% | |
| dH2O, autoklaveres | ||
| 2. sterilisere 0.22 μm-filteret. | ||
| 3. ruge i en inkubator for cellekultur ved 25 ° C i mørket 72 h. inkubator har å være blottet for bakterier og sopp forurensning. | ||
| 4. Legg reagenser. | Insulin | 2 μg/ml |
| BIS-Tris pH 6.8, sterilisere 0.22 μm-filteret | 5 mM | |
| 5. Juster pH til 6,8-6,9. | NaOH (10 N) | ~ 8 dråper |
| 6. sterilisere 0.22 μm-filteret. | ||
| 7. aliquot til 5 ml Flash fryse i LN2 butikken på-80 ° C. Bruk whithin 60 dager. | ||
| Merk: For store volumer, sterilisere med filteret topp flaske av vakuum, ellers bruke filtere sprøyten. Åpne dele i kultur hette. Enkel bruk. | ||
Tabell 1: Forberedelse av SAM medium (1 x) til Drosophila hjernen kultur. Middels til kultur hjernen explant. Alle trinnene bør utføres i kultur hette unntatt inkubasjonstiden for mediet.
| Trinn | Reagenser | Konsentrasjon |
| 1. Bland reagenser. | HEPES-KOH, pH 7.4 | 99 mM |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1.7 mM | |
| KH2PO4 | 2,2 mM | |
| Glukose | 33 mM | |
| Sukrose | 438 mM | |
| autoklaveres dH2O | ||
| 2. sterilisere 0,45 μm-filteret. | ||
| 3. lagre på 4 ° C opp til 6 måneder. | ||
| Merk: For eksperimentell bruk: fortynne 1 X med autoklaveres dH2O og sterilisere 0,45 μm filter topp flaske av vakuum eller filter sprøyten. Holde på 4° C. Åpne i kultur hette, flere bruk. | ||
Tabell 2: utarbeidelse av DSS (10 x). Saltvann å dissekere Drosophila hjerner. Forberede i kultur hette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi metoden for langsiktig fluorescens time-lapse mikroskopi kulturperler larver hjerner. Suksessen til denne typen eksperimenter avhenger av flere faktorer, for eksempel helse kultur, metode for immobilisering av hjernen explant, fluorescens intensitet og signal-til-støy forholdet reporter, timelige og romlig oppløsning, og tilgjengelighet til explant. Disse faktorene kan være gjensidig utelukkende. For eksempel økende time-lapse frekvens påvirker helsen til kultur og immobilisering av hjernen explant kan hemme gassutveksling. Dermed er finne en gyllen middelvei (ingen ordspill ment) for fenomener under studien nøkkelen til en vellykket protokoll. Metoden beskrevet her er optimalisert for å overvåke uttrykket av fluorescerende circadian journalister i omfanget av timer til dager. Det er også aktuelt å studere andre fag i Drosophila nevrobiologi viktige prosesser er uendret og utføres med forsiktighet.
I denne protokollen, er hjernen explants blokkert i en fibrin blodpropp, som skaper en 3D matrise. Selv om andre metoder for immobilisering finnes, for eksempel poly-lysine eller laminin belegg av dekket glasset, disse avta utviklingen av larver hjerner29 og kan dermed kompromittere sine fysiologiske robusthet. Ved sin natur gir fibrin en utmerket matrisen som er løs nok til å gi næring til nå hjernen explant og seig nok for hjernen å være nær cover glass uten squashing det16. På grunn av disse fordelene, fibrin blodpropp metoden har vært ansatt i ulike protokoller for cellekultur og hjernen explant kultur14,17,29,30,31,32 ,33,34. Vi anbefaler at du bruker en fibrin 3D matrise for larver hjernen kultur selv for relativt kortsiktige eksperimenter som varer mer enn noen få timer. Larver hjernen kultur uten 3D matrix gir uberegnelige resultater (data ikke vist), sannsynligvis på grunn av manglende fysiske støtte som er nødvendig for å utvikle hjernen.
Det er viktig å nøye observere morfologi av explant og cellene i vevet før og under time-lapse imaging for å oppdage alle kvittere av smerte. I eksperimentene presenteres her, uttrykk for membran-bundet mCD8::YFP viste intakt morfologi av neurons og PER-TDT ble oppdaget i cytoplasma og kjernen som forventet, indikerer at hjernen explant forble levedyktig og sunt hele varigheten av bildeprodukter. Circadian rhythmicity ble studert opptil 72 h, men vi observerte at hjernen explants kan kultivert for opptil 5 dager uten svekkes integriteten til neurons og hjernen (data ikke vist). Hvis neurites bli dotty eller celle kroppen av neurons briste, disse er vanligvis tegn for phototoxicity og lett forhindret ved å tilpasse innstillingene for mikroskop tilsvarende. For eksempel prøve å redusere laser makt mens økende pinhole størrelsen, smart gevinst og vinduet gjenkjenning. Vanligvis er imidlertid fluorescens intensiteten av reporteren begrensende faktor for å få bilder av godt signal-til-støy-forhold uten høy intensitet laser lys. Utformingen av reporteren, fluorophore og kopien antall reporteren er derfor de første tingene å vurdere når feilsøking levedyktighet problemer. (I forsøket presenteres her, 4 kopier av per tdt reporter ble brukt.)
Annet underskriver av en svekket hjernen kultur inkluderer utbrudd av en halvkule under tidsinnstilt bildebehandling og bevegelse væske av hjernen explant. Dette er sannsynligvis på grunn av mikro-punkteringer forårsaket under Disseksjon av hjernen. Fjerne imaginal plater knyttet til larver hjernen er den viktigste kilden til gjennomhulling, derfor anbefaler vi mot den.
Fordelen med fluorescens circadian live bildebehandling over bioluminescens imaging er dens høy romlig oppløsning. Dessuten, forenkler enkelt å bruke mobilnettet markører sammen med rytme reporteren analyse av celle-type spesifisitet. I kontrast, har bioluminescens førsteklasses timelige oppløsning og utmerket signal-til-støy-forhold19,20,21. Likevel samlet er antall sykling nevroner per hjernen fotografert av bioluminescens ikke overlegen i forhold til hvor med våre metoden8,19,21. I de fleste tilfeller synkroniseres rytmene av fluorescerende journalistene oppdaget med vår metode i den samme sektorgruppen klokke neurons (se figur 2C), som vist med bioluminescens19. Fase forskjeller mellom klokken Nevron klynger ble observert både fluorescens og bioluminesens circadian tenkelig8,19,21. Derfor både metoder er like gyldig i å observere døgnrytme i kulturperler hjernen, og valget mellom florescence og bioluminesens bør gjøres etter målet av studien.
Viktigste tekniske problemer med denne metoden er i innebygging trinn. Fordi protokollen krever rask-skanning AC confocal bildebehandling med en invertert mikroskop og lysspredning i hjernevevet reduserer fluorescens deteksjon spesielt når imaging dypt i vevet, hjernen explants skal monteres så nær som mulig å dekke glasset. Videre er reproduserbarhet tenkelig resultatene avhenger av konsistensen av z-stillingene av neurons interesser. Derfor er det viktig å orientere og montere hjerner alltid på samme måte som krever praksis. Å image neuronal klynger i anatomisk forskjellige posisjoner, det kan være nødvendig å kjøre egne eksperimenter med ulike hjernen explant retning. Det finnes alternative metoder for dype vev live bildebehandling som ikke krever dyrking vevet, som to-fotonet mikroskopi og lys ark mikroskopi. Sistnevnte har blitt brukt for bildet circadian kalsium dynamikken i live Drosophila hjerner22,23. Men lett ark mikroskopi har lavere romlig oppløsning enn AC confocal mikroskopi og dermed sin søknad til avbilding encellede oppløsning er fortsatt en utfordring.
I sammendraget kombinerer denne protokollen en enkel kultur-systemet av larver hjernen explants under forhold som støtter time-lapse image vinningen av fluorescerende journalister dager og kvantitativ analyse av biologiske rytmer. Men det er visse begrensninger som beskrevet ovenfor, kan metodikken tilpasset bildet ulike journalister i larver og voksne Drosophila hjerner og ytterligere endret for å øke følsomhet og romlig oppløsning. For eksempel axonal anslag ligger dypt i hjernen eller vesicula transport kan være synlig ved å kombinere vår hjerne explant kultur teknikk med to-fotonet mikroskopi35. Som blir sagt, det er fortsatt mulig å utføre live bildebehandling av organelles som mitokondrier i voksen hjernen explants bruker denne protokollen (data ikke vist). Vi har også presentert varianten av denne protokollen for bad anvendelsen av eksperimentelle løsningen i farmakologiske analyser. Man kunne utvide denne protokollen for å utføre "puls-jage" eksperimenter ved å manuelt erstatte kultur medium bleke stoffet eller en perfusjonsmåling kammer18,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Michael Rosbash for sine mentorer og støtte i første fase av utviklingen av denne metoden. Dette arbeidet ble finansiert av JST VIPs programmet, Swiss National Science Foundation (31003A_149893 og 31003A_169548), den europeiske Research Council (ERC-StG-311194), Novartis grunnlaget for medisinsk-biomedisinsk forskning (13A39) og Universitetet i Geneve .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
