Summary
Цель настоящего Протокола заключается в создании ex vivo дрозофилы личиночной мозга культуры оптимизированы для мониторинга суточного молекулярной ритмы с долгосрочным флуоресценции покадровой изображений. Также обсуждается применение этого метода для фармакологических проб.
Abstract
Контуре суточного кардиостимулятор оркеструет художественной поведенческие и физиологические выходы, координироваться с экологическими подсказки, например циклов день/ночь. Молекулярные часы, в течение каждого нейрона кардиостимулятор генерирует циркадные ритмы в экспрессии генов, которые лежат в основе художественной нейрональных функций, необходимых для функционирования схемы. Исследование свойств индивидуальных молекулярных осцилляторов в различные подклассы кардиостимулятор нейронов и их взаимодействие с нейронов сигнализации дает, лучшего понимания контуре суточного кардиостимулятора. Здесь мы представляем покадровой флуоресцентной микроскопии подход, разработанный для мониторинга молекулярных заводной будильник нейронов культивировали дрозофилы личиночной мозга. Этот метод позволяет записывать многодневные ритмов генетически закодированный флуоресцентные суточного Репортеры разрешением одной ячейки. Эта установка может сочетаться с фармакологическими манипуляции внимательно анализировать реального времени отклика молекулярных часов для различных соединений. За пределами циркадные ритмы этот универсальный метод в сочетании с мощным дрозофилы генетических методов дает возможность для изучения различных нейронов или молекулярных процессов в живой мозговой ткани.
Introduction
Суточный часы помогают организмов приспособиться к периодических изменений в окружающей среде, порожденных 24 h вращения Земли. Блокируемые transcriptional поступательные обратной часто лежат в основе молекулярного механизма суточного часы различных видов1. Контуре суточного кардиостимулятор состоит из будильник содержащих нейронов интегрирует время день информацию, передаваемую по экологической подсказки, например Светлый/темный (LD) и температурных циклов, чтобы организовать ритмы множество ежедневных физиологические и поведенческих процессов2,3. Координация молекулярных ритмов с нейронов входов и выходов является критически важное значение для функционирования суточного цепи, но остается лишь отчасти понятными.
В дрозофилы, суть молекулярные часы, гетеродимера такт (CLK/CYC) активирует транскрипцию период (за) и вневременной (Тим). % И Тим образуют комплекс и введите ядра, где они подавляют транскрипционный анализ деятельности CLK/CYC и, следовательно, свои собственные транскрипции. POST-transcriptional и столб-поступательные правила приводят к задержкам между CLK/CYC-опосредованной транскрипции и репрессии, % / Тим, обеспечение поколения около 24-h молекулярных колебаний1,3,4 . Около 150 нейронов, содержащие эти молекулярные часы форме схемы управления суточного поведение взрослых мух5. Гораздо проще, но полностью функциональный суточного цепь состоит из 3 групп нейронов будильник - 5 вентральной боковых нейронов (окн; 4 PDF-позитивных окн и один LNv PDF-отрицательные, см. ниже), 2 спинной нейрон 1s (DN1s) и 2 спинной нейрон 2s (DN2s) - присутствует в личиночной мозг6,7.
Простой личинок суточного цепи предлагает отличную модель для изучения взаимодействия между нейронные связи и молекулярных заводной. С помощью нашего недавно разработанных флуоресцентные репортер %-TDT, который имитирует уровни на белок и расположению субклеточном, мы стремились охарактеризовать динамику молекулярных заводной в разные часы нейрон подгрупп в контуре личиночной суточный 8. Кроме того, зная ключевую роль нейропептида пигмент диспергирующие фактора (PDF), производимые 4 окн в регулировании циркадные ритмы в нейрональных уровня9,10,11, мы хотели бы изучить прямой влияние PDF на молекулярные часы. С этой целью мы разработали метод мониторинга суточного ген выражение ритмы в личиночной мозга explant через несколько дней, покадровой confocal микроскопии. Протокол также был адаптирован для фармакологических проб для проверки эффекта PDF или других соединений на уровне %-TDT. Таким образом адаптация состоит из доступности культуры экспланта мозга для применения наркотиков, увеличение временного разрешения и изображений на более короткий срок.
Ex vivo культуры дрозофилы мозги различных этапов развития были ранее установленных12,13,14,,1516,17 ,18. Эти протоколы используются для визуализации различных биологических явлений, в то время как некоторые из них не совместимы с изображений разрешением одной ячейки или не поддерживают культуру для более чем несколько часов. Альтернативные методы для выполнения долгосрочных живых изображений суточного нейронов в дрозофилы включают биолюминесценции изображений молекулярной ритмы19,,2021 и флуоресценции изображений кальция индикатор с легкими лист микроскопии22,23. Хотя биолюминесценции изображений можно добиться более высоких временное разрешение и легких лист микроскопии могут быть адаптированы для изображений в естественных условиях , они ограничены на пространственное разрешение и требуют специализированных Микроскоп систем.
Метод, описанный здесь предназначена для визуализации флуоресцентные сигналов в культуре весь мозг в резолюции одноклеточных в течение нескольких дней. Этот снисходительный и универсальный метод может быть адаптирована для взрослых летать мозги культурный образ и фармакологические эксперименты для изучения многих различных проблем в области нейробиологии дрозофилы .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. подготовка запасов решений под капотом культуры
- Подготовка 400 мл 1 x Шнайдер активной среды (SAM) оптимизирован для ex vivo культуры личиночной мозги (с изменениями от24,ссылку25) (Таблица 1). Алиготе до 5 мл и flash замораживание в жидком азоте (2л), хранить в - 80 ° C.
- Подготовка 1 x Dissecting солевой раствор (DSS) путем разбавления 10 x Стоковый раствор (изменение ссылки26) (Таблица 2).
- Аликвота фибриноген 10 мг и хранить при 4 ° C для одноразового использования.
Предупреждение: Весят фибриногена под ламинарным потоком, носить перчатки, как это вредно. - Подготовить Раствор тромбина в Сэм (1500 NIH блок/мг) и аликвота по 10 мкл, вспышки заморозить в пер2 и хранить при температуре-80 ° C.
Предупреждение: Надевайте перчатки при обработке тромбиновое, как это вредно. - Аликвота Стоковый раствор 100 x пенициллина и стрептомицина. Хранить при температуре от-20 ° C.
- Вырезать круги из политетрафторэтилена (ПТФЭ) мембраны (см. таблицу материалы) до размера, который приспосабливает внутри блюдо дно стекла. Промойте их в 70% EtOH и затем газобетона dH2O. Стерилизируй-отпусти и сухой под ламинарным потоком с УФ. Держите в стерильных Петри. Одноразовые.
Примечание: PTFE является пористой гибкой мембраны, которая позволяет обмен газа и предотвращает испарение во время длительной записи средних.
2. покадровой микроскопии установки
Примечание: Следующие установки для тандем сканера Перевернутый конфокального микроскопа (см. таблицу материалов) оснащен резонансный сканер (8000 Гц). Система включает в себя высокочувствительный фото множитель детектор, который вместе с резонансный сканер предотвращает Фототоксичность и Фотообесцвечивание. Температура и влажность находятся под контролем в рамках экологических камеры микроскопа (см. Таблицу материалов), охватывает большую часть микроскопа.
- Поместите камеру этап Топ влажности.
- Поверните на контроллерах температуры и влажности, чтобы сбалансировать камеры микроскопа до 25 ° C и 80% влажности.
- Для выполнения экспериментов в постоянном тьмы (DD), охватывать экологические камеры микроскопа с непрозрачной тканью (если микроскоп камера состоит из непрозрачного материала).
- При использовании цель погружения в воду, позиция микро погружной рукомойник поверх цели и программа протокол с программным обеспечением Autoimmersion цель контроллер отказаться воды с постоянной скоростью во время промежуток времени визуализации.
Примечание: Цели погружения в воду вместе с дозатором воды или сухого объектива рекомендуется для долгосрочных живых изображений, как другой тип погружения среды будет высыхать. - Поместите держатель Петри на сцене, внутри камеры влажности.
- Запуск программного обеспечения микроскоп и выберите режим резонансный сканер из первого диалогового окна. Выберите OK для инициализации стадии при появлении соответствующего запроса. Перейдите на вкладку Конфигурация и конфигурация оборудования для переключения на соответствующих лазерные линии.
- Перейти к закладке приобретение и XY панель для выбора двунаправленный режим и установить изображение приобретения параметры.
Примечание: Описанные установки изображений, представленные здесь (рис. 2, рис. 3 и 1 кино) оптимизирован для наблюдать суточного выражения конкретных флуоресцентные репортеров. Следующие параметры были выбраны для наилучшего нашим спецификациям: 40 X воды погружение цель, 8 X средняя линия с 512 × 512 пикселей изображения. Для многоцветной изображений, приобретение последовательные изображения требуется длина волны излучения одной Флюорофор и длина волны возбуждения другой перекрытия (здесь, длин волн рекламы Жёлтый флуоресцентный белок (ЯФП) выбросов и помидор возбуждения параллелизма). Выберите последовательный режим «между стека», как это самый быстрый и движение часы нейронов является незначительным во время приобретения Z-стека. Микроскопия параметры должны быть адаптированы с учетом цель каждого эксперимента.
3. Установка личиночной мозга экспланта культуры
Примечание: Вся процедура от вскрытия для встраивания мозга эксплантов занимает ~ 30 мин.
-
Подготовка реагентов под капотом культуры.
- Оттепель Алиготе тромбина и держать при комнатной температуре до внедрения шаг (Шаг 3.3). Одноразовые.
- Быстро разморозить Алиготе Сэм при 37 ° C и держать на льду для одноразового использования.
- Добавить Сэм 10 мг Алиготе фибриногена до 10 мг/мл, Флик мягко и инкубировать при 37 ° C, по крайней мере 30 минут и на этапе внедрения (шагу 3.3). Одноразовые.
Примечание: Не инкубировать раствор фибриногена, больше чем 2 h, как он начинает полимеризоваться. - Оттепель Алиготе акций 100 x пенициллина и стрептомицина. Подготовить 2,5 мл Сэма, содержащие 1 x пенициллин-стрептомицином (SAM/антибиотики). Храните при комнатной температуре.
Примечание: Магазин оставшиеся 100 x складе пенициллина и стрептомицина при температуре 4 ° C до 1 месяца. - Подготовьте Алиготе 500 мкл из оставшихся Сэм. Держите на льду.
- Для долгосрочное изображений, применяют автоклавный вакуумный смазка для пластиковых частью нижней части стекла дно блюдо (рис. 1A) и стерилизовать под ламинарным потоком с УФ.
-
Рассечение центральной нервной системы и вентральных нерва шнура.
- Очистить щипцы и 2 x 3 ну стекла рассечение блюда с 70% EtOH. Залейте 400 мкл DSS в 4 скважины и 400 мкл Сэма в одной скважиной. Держите на льду.
- Вычерпывать летать носитель, содержащий личинок и выбрать-Блуждающие 3 (L3), instar личинки с щипцами. Промойте их последовательно в 2 скважины, DSS-заполнены. Держите их в 3-DSS-заполнены хорошо на льду, который anesthetizes личинки.
Примечание: L3 длится около 2 дней при температуре 25 ° C. Для наблюдения за мозг в физиологически соответствующие сроки мы решили использовать-Блуждающие L3 личинки. Другие подгруппы нейронов Будильник, такие как l окн и DN3s, начинают формироваться на блуждающих L3 стадии, но они еще не обязательно Велоспорт (данные не показаны). Таким образом хотя это возможно изображение Велоспорт будильник нейронов на данном этапе (данные не показаны), важно различать тщательно уже функциональных личиночной будильник нейроны от развивающихся стран для анализа данных. Non Блуждающие L3 появляются приблизительно 4-4,5 дней после откладки яиц при температуре 25 ° C. Чтобы использовать этот протокол для изучения циркадные ритмы, синхронизировать (увлекают) развивающихся личинок в 12 h/12 h LD циклов при 25 ° C для 3 дней, прежде чем собирать личинок L3. - Вскрыть личиночной мозги с тонкой щипцами в 4 DSS-заполнены колодец, который не был использован для ополаскивания личинки, используя метод наизнанку27.
- Кратко пополам личинка, нежно щепотка рот крючки с парой щипцов и закатать наизнанку стенки тела, используя другой пары щипцов, таким образом подвергая мозга. Бесплатно мозг вырезанием трахеи и нервы, которые крепятся к остальной части тела.
- Аспирационная мозга в около 3 мкл DSS с 20 мкл пипетки (предварительно промыть DSS) и распределять в SAM-заполнены хорошо. Повторите эту процедуру для до 7 мозги.
Примечание: Рассечение должны выполняться на холодной поверхности держать личинки под наркозом и мозг охлажденным. Например Поместите блюдо рассечение на блок охлаждения, подключенных к насоса распространить льда охлажденной воды. Рассечение процедура занимает ~ 30 сек на мозг. Важно держать глаз/усиков имагинальных дисков, мозги и воспалении брюшины шнур нетронутыми. Срывать эти части повреждения мозга и снижает качество культуры. Кроме того Избегайте, подвергая мозги в воздух. Перед аспирационных первый мозга, Пипетка вверх и вниз по DSS, содержащие части расчлененных личинок, как это предотвращает прилипание к стенкам кончика мозги.
-
Встраивание мозга эксплантов в матрице 3D и монтажа (~ 20 мин).
- Опускайте расчлененных мозга в рабочий раствор фибриногена (фибриноген конечная концентрация ~3.3 мг/мл, 10.5 мкл в мозг) следующим образом:
- Аспирационная 3.5 мкл Сэм/антибиотиков (кончиком же используется в раздел 3.2.3). Аспирационная расчлененных мозг от вскрытия и в тот же Совет пипеткой без выдачи средство SAM/антибиотики в кончик.
- Отказаться от мозга и среднего на крышке стерильных Петри. Добавьте еще один 3,5 мкл Сэм/антибиотиков и 3,5 мкл раствора 10 мг/мл теплой фибриногена/Сэм на капли, содержащие мозга. Осторожно перемешать раствор вокруг мозга, дозирование с кончиком пипетки 20 мкл.
Примечание: С помощью пипетки, а не щипцов на этом шаге избегает, подчеркивая мозга. - Возьмите 2 мкл рабочего раствора фибриноген от падения и применить его на coverslip блюдо дно стекла, как небольшой круг. 0,8 мкл тромбина и очень быстро перемешать с кончиком пипетки. Фибриноген преобразуется в фибрин и начинает полимеризоваться.
- Возьмите мозг, который сидит в фибриноген рабочего раствора (Шаг 3.3.1) между парой щипцов и поместите его на матрице после белый матрица фибрина является видимым. Ориентируйте на передней стороне мозга вниз (для визуализации будильник нейронов). Протолкните его вниз как можно ближе к покровным стеклом. Сгусток фибрина состоит из слоев фибрина. Выбрать один слой и сложить его на верхней части мозга с малого и нежные движения без отсоединения матрицы.
- Повторяйте 2-3 раза из разных частей сгусток стабилизировать мозга.
Примечание: При обработке мозга с щипцами, будьте осторожны, чтобы не сушить или навязывать его физического стресса.
- Повторяйте 2-3 раза из разных частей сгусток стабилизировать мозга.
- 20 мкл/антибиотиков, Сэм поверх встроенного мозга, чтобы остановить действием тромбина.
- Повторите процедуру для монтирования оставшиеся мозги. Это позволяет вставлять до 5-6 мозги на блюдо дно стекла.
- Для долгосрочной живых изображений, мкл 600 Сэм/антибиотиков в внутренний колодец (часть стекла). Позиционировать предварительно нарезанные PTFE мембраны поверх среды и придерживаться его в вакуум смазка применяется в пластиковые части нижней (3.1.5) (рис. 1A).
- Для фармакологических проб заполните блюдо с 2 мл Сэм/антибиотиков (рис. 1B).
Примечание: Это очень важно избежать испарения среды, как осмотического давления среды имеет решающее значение для жизнеспособности нейронов. Таким образом для долгосрочных экспериментов изображений, необходимо запечатать культуры блюдо с PTFE мембраны. В то время как для кратковременных экспериментов, уплотнения мембраны не требуется до тех пор, как блюдо заполнены с 2 мл среды и контролироваться в камере увлажненной.
4. промежуток времени изображения приобретение
- Поместите блюдо дно стекла на держателе Петри в камере этап Топ влажности.
- Перейдите на панель z стека в закладке приобретение и z разделе шаги от Микроскоп программного обеспечения (2 мкм × ~ 40 в экспериментах показано на рисунке 2 и на рисунке 3и 1 кино). Установите в начале z стека в плоскости габаритной ширины coverslip и в конце на поверхности мозга экспланта, недалеко от coverslip. Хотя мозг движения являются незначительными, добавить дополнительные z секции в начале и конце z стека.
- Перейти к Марк и найти группы и настройки приобретение изображением многопозиционных. С 40 X цели 1 полушария мозга могут быть захвачены в поле зрения
- Перейти к панели режим приобретения и выберите xyzt (z стек промежуток времени). Пойдите к пульту время приобретения и предпочтительное время значения параметров интервал и частоты.
Примечание: Приобрести промежуток времени изображения с требуемой частотой. Обратите внимание, что долгосрочные живых изображений (24-72 ч) с интервалом промежуток времени меньше, чем 2 h, как правило, результаты в меньшее количество велосипедных нейронов, вероятно потому что оно уменьшает жизнеспособности нейронов. Объем данных расширяется как ставка увеличивается приобретения изображений, которая затрудняет анализ данных и хранения.
5. медикаментозное лечение мозга эксплантов с краткосрочной Live изображений
Примечание: Следующая процедура является по существу же, как для долгосрочных изображений, но не требуют ламинирования мембрана из ПТФЭ. Чтобы избежать разоблачения мозги для синий свет, когда химическое вещество добавляется в культуре, Микроскоп следует находиться в темной комнате с красный свет.
- Пойдите к пульту время приобретения и установите желаемый временной интервал и количество сканирования для получения исходных данных перед применением препарата. Запустите проверку.
- После базовой сканирование завершено, поднять головку сканирования системы микроскопа. Снимите крышку контроллера этап Топ влажности и очень осторожно снимите крышку блюдо дно стекло без его перемещения.
- При необходимости удалите соответствующее количество питательной среды. Экспериментальный решение добавить в средне- и, тщательно и очень нежно, смешать с стерильные пипетки Пастера без касатьться эксплантов мозга.
Примечание: Для применения Ванна PDF, используйте 2 мкм PDF раствор (в 10% ДМСО). - Замена крышки блюдо дно стекла и влажной камере и сканирования головы. Если используется, переместите черной непрозрачной ткани вокруг камеры микроскопа.
- Проверьте, если мозги на их первоначальные позиции в режиме живой сканирования. При необходимости отрегулируйте.
- Пойдите к пульту время приобретения и установите желаемый временной интервал и количество сканирования. Запустите проверку.
Примечание: Здесь мы тестировали покадровой изображения, полученные каждый час до 10 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем представитель результаты длительной записи суточного флуоресцентные репортер в ex vivo личиночной мозга культуры и живой визуализации результатов применения PDF Ванна репортер выражения.
Non Блуждающие L3 личинки, выражая молекулярные часы репортер %-TDT и бла mCD8::YFP driven часы нейрон водитель, Clk (856)-gal4 (рис. 1 c) были увлекаемого LD. мозги были расчлененные и для долгосрочные культуры во время последнего легкие фаза цикла LD просто предварительного этапа темный (рис. 1A и 2B). Промежуток времени изображений была исполнена в DD и мозга эксплантов были образы каждые 2 ч для 64 h. СУММА стек, содержащий нейрон интерес был создан и интенсивность средняя флуоресценции области, соответствующей нейрон была измерена после вычитания фон8. Чтобы определить ритмичности репортер выражения, Максимальная энтропия спектрального анализа (MESA) и ручной проверки были используется8. Два DN2s, которые отображают циркадные ритмы с периодом ~ 26 h в %-TDT уровни представлены здесь (рисунок 2A, 2 C и фильм 1).
С помощью по существу же культуры установки (рис. 1B), было изучено влияние нейропептида PDF на выражение %-TDT. Мозги не бродил личинки же генотипа, как описано выше были расчленены на ZT1 (Zeitgeiber время 1, 1 ч после огни на в LD) или ZT13 (1 час после выключенным). Флаконы, содержащие личинки были немедленно охлаждается на льду после того, как из инкубатора. В ZT13 флаконы также были завернуты в фольгу избежать воздействия голубой свет. Рассечение мозга была выполнена на льду и расчлененных мозги хранились на льду. Мозги, принятым на ZT13 были покрыты алюминиевой фольги, когда это возможно. Таким образом хотя эта процедура была выполнена в лаборатории, освещены естественным светом, эффект воздействия света на макромолекулярных синтеза и метаболизм был минимальным. Мозги были проверены дважды с интервалом 1 ч для получения исходных данных. PDF или транспортного средства (ДМСО) был добавлен к питательной среды и промежуток времени изображения были приобретены каждый 1 час для последующих 6 h. %-TDT выражение профиль показал время в день зависимой увеличение интенсивности флуоресценции после сложения PDF на ZT13 в окн и DN1s и меньшей степени-на DN2s (рис. 3)8.
Эти результаты показывают, что тепловизионная техника и культуры метод, описанный здесь включена запись %-TDT ритмов в одну ячейку резолюции без заметных Фототоксичность, Фотообесцвечивание или фокус дрейфа.
Примечание: Изображения были проанализированы и обработаны с помощью Фиджи28. 10 X итеративный деконволюция была выполнена с AutoQuant и Imaris. С правильной 3D дрейф плагинов ImageJ были исправлены незначительные сугробы в промежуток времени изображения.
Рисунок 1: Анатомия будильник нейронов в L3 личиночной мозг и мозг экспланта культуры установки. (A и B) Схема установки культуры мозга для долгосрочное изображений (A) и фармакологических проб с краткосрочными изображений (B). (A) вакуумные смазка (желтый) был применен на пластмассовые части блюдо дно стекла для присоединения PTFE мембраны. (C) представитель изображение LD-увлекаемого L3 личиночной мозга на ZT2. Выражение молекулярные часы репортер %-TDT (пурпурный) видна в часы нейронов, которые помечены UAS-mCD8::YFP(green), движимый Clk (856)-gal4. Есть 3 групп дифференцированной будильник нейронов в L3: 5 окн (включая 5 LNv, который не выразить PDF), 2 DN1s и 2 DN2s, обозначается белым стрелок. Обратите внимание на выражение %-ТДТ в ядрах будильник нейронов. Рекламы ЯФП отрицательных %-ТДТ положительных клеток являются глии и другие подгруппы нейронов часы, которые все еще развивается. Шкалы бар = 25 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты долгосрочных живут изображений личиночной будильник нейронов. (A) увеличенное представление DN2s от долгосрочного покадровой изображений искусственного мозга. Мозг эксплантов были подготовлены от личинки LD-увлекаемого L3, расчлененные на ZT11. Изображения были взяты из CT17 каждые 2 ч (суточного времени 17, 5 h после субъективные выключенным в DD) для 64 h в DD. Merged изображения %-TDT (пурпурный) и бас mCD8::YFP, движимый Clk (856)-gal4 (зеленый) слева от каждой группы и уровни %-TDT представлены как справа расположены Heatmap с голубой градиент. Шкалы бар = 10 мкм. Для представления только изображения были обработаны с 3D коррекции дрейф и 10 X итеративный деконволюции. (B) время эксперимента. (C) графа, представляющий относительный флуоресценции интенсивности нормализуется при t = 0 двух DN2s (синий и красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты live образов для фармакологические эксперименты. LD-увлекаемого личиночной мозги были расчленены и смонтированы на ZT1 или ZT13 и PDF (2 мкм) или ДМСО была применена в ZT2 или ZT14. %-TDT выражение в мозг эксплантов контролируется каждый час покадровой микроскопии. Отображается средняя флуоресценции интенсивности ± SEM нормализовано к значению в начале обработки изображений (соответствующий к ZT1 или ZT13). Красные стрелки показывают время приложения PDF или транспортного средства (ZT2 или ZT14). * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 и *** p < 0,0001, двусторонний ANOVA Sidak по коррекции для нескольких сравнений. Минимум 32 окн, 18 DN1s и 16 DN2s были проанализированы для каждой точки данных. Эта цифра была изменена ссылка8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: Долгосрочный живых изображений личиночной DN2 будильник нейронов. Промежуток времени фильм культивировали личиночной мозга расчленены на ZT11 и отражаться в DD. Magnified показаны виды DN2s в одном полушарии, выражая %-TDT и бла mCD8::YFP, движимый Clk (856)-gal4 . Изображения были приобретены каждые 2 ч для h. 64%-TDT (пурпурный) и рекламы ЯФП (зеленый) слева и справа расположены %-TDT уровнях в виде heatmap (голубой градиент). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Шаги | Реактивы | Концентрация |
| 1. смешать реактивы. | KH2PO4 | 4.18 мм |
| CaCl2 | 1.05 мм | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 мм | |
| NaCl | 116 мм | |
| NaHCO3 | 0,7 мг/мл | |
| Глюкоза | 2 мг/мл | |
| Трегалоза | 2 мг/мл | |
| Альфа-кетоглутаровая кислота | 0,35 мг/мл | |
| Фумаровая кислота | 60 мкг/мл | |
| Яблочная кислота | 0,6 мг/мл | |
| Янтарная кислота | 60 мкг/мл | |
| Экстракт дрожжей | 2 мг/мл | |
| Номера тепло инактивированная FCS | 20% | |
| dH2O, газобетона | ||
| 2. стерилизации с 0,22 мкм фильтром. | ||
| 3. Инкубируйте в инкубаторе для культуры клеток при 25 ° C в темноте за 72 ч. инкубатор должен быть свободным от бактериальной или грибковой загрязнения. | ||
| 4. Добавьте реагентов. | Инсулин | 2 мкг/мл |
| Бис-трис рН 6,8, стерилизовать с 0,22 мкм фильтром | 5 мм | |
| 5. Отрегулируйте pH 6.8-6.9. | NaOH (10 N) | ~ 8 капель |
| 6. стерилизовать с 0,22 мкм фильтром. | ||
| 7. Алиготе до 5 мл вспышки заморозить в магазине LN2-80 ° c. Используйте включенной 60 дней. | ||
| Примечание: Для больших объемов стерилизовать с верхней бутылки фильтр вакуум, в противном случае использовать фильтр шприц. Открытые аликвоты в капюшоне культуры. Одноразовые. | ||
Таблица 1: подготовка среднего Сэм (1 x) для культуры мозга дрозофилы . Носитель культуры мозга экспланта. Все действия должны выполняться в капот культуры за исключением инкубации среды.
| Шаги | Реактивы | Концентрация |
| 1. смешать реактивы. | HEPES-Кох, рН 7,4 | 99 мм |
| NaCl | 1,37 М | |
| KCl | 54 мм | |
| NaH2PO4 | 1,7 мм | |
| KH2PO4 | 2.2 мм | |
| Глюкоза | 33 мм | |
| Сахароза | 438 мм | |
| газобетона dH2O | ||
| 2. стерилизации с 0,45 мкм фильтром. | ||
| 3. хранить при 4 ° C до 6 месяцев. | ||
| Примечание: Для экспериментального использования: развести 1 X с газобетона dH2O и стерилизации с 0,45 мкм фильтр верхней бутылки вакуум или фильтр шприца. Хранить при 4° C. Открытый в культуре капот, многократного использования. | ||
Таблица 2: подготовка DSS (10 x). Физиологический раствор для того чтобы рассечь мозги дрозофилы . Подготовьте в капюшоне культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описал метод для долгосрочного покадровой микроскопии флуоресцирования культивировали личиночной мозги. Успех такого рода экспериментов зависит от нескольких факторов, например, здравоохранения, культуры, метод для иммобилизации экспланта мозга, интенсивности флуоресценции и соотношение сигнал шум репортер, временного и пространственного разрешения, и доступность для экспланта. Эти факторы могут быть взаимоисключающими. Например покадровой чаще влияет на здоровье культуры, и иммобилизации экспланта мозга может препятствовать газообмена. Таким образом найти золотую середину (не каламбур, предназначенных) для явления под исследование является ключом к успешной протокол. Метод, описанный здесь оптимизирована для наблюдения за выражение флуоресцентные суточного репортеров в масштабе часов до суток. Это также применимо к изучать другие предметы в нейробиологии дрозофилы , пока критических процессов в неизмененном виде и выполнен с осторожностью.
В этом протоколе мозг эксплантов карданной передачи были заблокированы сгусток фибрина, который создает матрицу 3D. Хотя существуют другие методы для иммобилизации, таких как поли лизин или Ламинин покрытие крышки стекла, эти замедлить развитие личинок мозги29 и таким образом может поставить под угрозу их физиологической устойчивости. По своей природе фибрина обеспечивает отличную матрицу, которая является достаточно свободно, чтобы позволить питательных веществ для достижения мозга экспланта и достаточно липким для мозга, чтобы быть рядом с покровным стеклом без давя это16. Благодаря этим преимуществам фибринового сгустка метод работал в различных протоколов для культуры клеток и мозга explant культуры14,17,29,,3031,32 ,,33-34. Мы рекомендуем использовать фибрина 3D-матрицы для личинок мозга культуры даже для относительно краткосрочных экспериментов, которые более чем на несколько часов. Личинок мозга культуры без 3D матрицы дает результаты неустойчивой (данные не показаны), вероятно из-за отсутствия физической поддержки, необходимой для разработки мозги.
Важно тщательно соблюдать морфологию клеток в тканях экспланта и до и во время промежуток времени изображений для обнаружения любых признаков бедствия. В экспериментах, представленные здесь выражение mCD8::YFP мембраны прыгните показал нетронутыми морфологии нейронов и %-TDT был обнаружен в цитоплазмы и ядра, как и ожидалось, указав, что мозг экспланта оставалась жизнеспособной и здоровыми на протяжении Продолжительность обработки изображений. Суточный ритмичности было изучено до 72 часов, но мы наблюдали, что мозг эксплантов можно культивированный на срок до 5 дней без ухудшения целостность нейронов и мозг (данные не показаны). Если невритов стать Дотти или клетки тела нейронов лопнул, эти, как правило, признаки Фототоксичность и легко предотвратить путем адаптации Микроскоп параметры соответственно. Например уменьшите мощность лазера, увеличивая размер обскуры, смарт выгоды и окно обнаружения. Однако как правило, интенсивность флуоресценции репортер является ограничивающим фактором для получения изображения хорошее соотношение сигнал шум без высокой интенсивности лазерного света. Таким образом дизайн репортер, выбор Флюорофор и копировать количество репортер являются первые вещи, чтобы рассмотреть при устранении неполадок жизнеспособности. (В эксперименте, представленные здесь, 4 копии за tdt репортер были использованы).
Другие признаки культуры скомпрометированных мозга включают всплеск полушария во время промежуток времени обработки изображений и движение жидкости из мозга экспланта. Это, вероятно, из-за микро проколы, причиненный во время вскрытия головного мозга. Удаление имагинальных дисков, придает личиночной мозга является основным источником проколов, таким образом мы советуем против него.
Преимуществом флуоресценции суточного живых изображений над биолюминесценции изображений является его высокое пространственное разрешение. Кроме того легкость использования клеточных маркеров вместе с репортером ритм облегчает анализ специфики типа клеток. В отличие от биолюминесценции имеет улучшенный временное разрешение и отличное соотношение сигнал шум19,,2021. Тем не менее общее количество велосипедных нейронов в мозг, образы биолюминесценции не Улучшенный по сравнению с числом, полученные с наших метод8,19,21. В большинстве случаев ритмы флуоресцентные репортеров, обнаружены с нашим методом будут синхронизированы в течение того же кластера будильник нейронов (см. рис. 2 c), как показано биолюминесценция19. Фаза различия между кластерами нейрон часов наблюдались в флуоресценции и биолюминесценции суточного изображений8,19,21. Поэтому как методологии одинаково допустимы в соблюдении циркадные ритмы в искусственный мозг, и выбор между цветения и биолюминесценции должны производиться в соответствии цель исследования.
Основные технические трудности этого метода находится на этапе внедрения. Поскольку протокол требует быстрого сканирования конфокальная томография с инвертированным микроскопом, и рассеяние света в ткани мозга уменьшает флуоресцентным обнаружением, особенно при визуализации глубоко в ткани, эксплантов мозг должен быть установлен как можно ближе Возможно покрытие стекла. Кроме того воспроизводимость результатов изображений зависит от последовательности z позиции нейронов интересов. Таким образом важно ориентировать и смонтировать мозги всегда таким же образом, что требует практики. Для изображения нейронов кластеры расположен в анатомически различных позиций, это может потребоваться для выполнения отдельных экспериментов с различными мозга экспланта ориентации. Существуют альтернативные методы для глубоких тканей живых изображений, не требующих культивирование ткани, такие как двух Фотон микроскопии и легких лист микроскопии. Последний успешно используется для изображения динамика суточного кальция в живой дрозофилы мозги22,-23. Однако свет лист микроскопии Нижняя пространственное разрешение чем confocal микроскопии и таким образом его применение к изображений разрешением одноклеточных остается проблемой.
Таким образом этот протокол сочетает в себе простой культуры системы эксплантов личиночной мозга в условиях, которые поддерживают приобретение покадровой изображения флуоресцентных репортеров в течение дней и количественного анализа биологических ритмов. Хотя есть определенные ограничения, как обсуждалось выше, методология могут быть адаптированы различных журналистам изображения в личинок и взрослых дрозофилы мозги и дальнейшие изменения для увеличения чувствительности и пространственным разрешением. Например аксональное прогнозы расположен глубоко в головном мозге или везикулярный транспорт может быть обнаруживаемыми, объединив наш мозг экспланта культуры технику с двух Фотон микроскопии35. Что, как говорится, это еще возможно для выполнения жить изображений как митохондрии органеллы в взрослого мозга эксплантах, используя этот протокол (данные не показаны). Мы также представили вариации этого протокола для приложения Ванна экспериментальной решения в фармакологических проб. Одно может продлить этот протокол для выполнения «пульс Чейз» эксперименты вручную замене культуры среднего промыть препарата или с использованием камеры18,перфузии36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Майкла Rosbash за его наставничества и поддержки на начальном этапе разработки этого метода. Эта работа финансировалась программой JST PRESTO, Швейцарский Национальный научный фонд (31003A_149893 и 31003A_169548), Совет Европы исследований (ERC-StG-311194), фонд Новартис лечебно-биомедицинских исследований (13A39) и Женевского университета .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
