Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Overflade Functionalization af Hepatitis E Virus nanopartikler ved hjælp af kemiske konjugation metoder

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

Vi har manipuleret kapsid proteiner af hepatitis E virus som en theranostic nanopartikel (HEVNP). HEVNP samler selv i en stabil ikosaedriske bur i slimhinden levering. Her beskriver vi ændring af HEVNPs for tumor målretning af muterer overflade-eksponerede rester til cysteines, som konjugat syntetiske ligander, der specifikt binder tumorceller.

Abstract

Viruslignende partikler (VLPs) har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler i detektion og behandling af forskellige sygdomme. Dette program er baseret på genetisk modifikation, samlesæt, og cystein konjugation at opfylde tumor-targeting anvendelsen af rekombinante VLPs. sammenlignet med genetiske modifikation alene, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLPs tilbyder en væsentlig fordel fordi det giver mulighed for en række forskellige enheder, såsom syntetiske peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en differentieret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.

Her, viser vi hvordan man bruger hepatitis E virus nanopartikel (HEVNP), et modulopbygget theranostic kapsel, som multifunktionelle levering transportør. Funktioner af HEVNPs omfatter målretning af væv, billedbehandling og terapeutiske levering. Baseret på veletablerede strukturelle forskning af HEVNP, blev strukturelt uafhængig og overflade-eksponerede rester udvalgt til cystein udskiftning som konjugation websteder for maleimide i forbindelse med kemiske grupper via thiol-selektiv forbindelser. En bestemt cystein-modificeret HEVNP (Cys udskiftning af asparagin på 573 aa (HEVNP - 573C)) blev konjugeret med et bryst kræft celle-specifikke ligand, LXY30 og mærket med nær-infrarødt (NIR) Fluorescens dye (Cy5.5), gengivelse af tumor-målrettet HEVNPs som effektivt diagnostiske kapsler (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Lignende engineering strategier kan være ansat med andre makromolekylære komplekser med velkendte atomic strukturer til at udforske potentielle anvendelser i theranostic levering.

Introduction

Udvikling af nano-størrelse vektorer i terapeutiske og diagnostiske levering, kendt som nanotheranostics, har flyttet meget af den biomedicinske felt fra generaliseret behandlinger mod målrettet levering1. Målrettede nanotheranostic levering integrerer nano-størrelse vektorer (nanopartikler) med theranostic molekyler til stabilt direkte theranostic molekyler til en specifik sygt væv eller biokemisk pathway2,3,4 . Nanomedicin er kommet i forgrunden af målrettet levering fordi optimalt mellemstore nanopartikler har kapacitet til at stabilisere cirkulation af theranostic molekyler og selektivt målrette cellens overflade molekyler præsenteret på syge væv. Mange nanotheranostic platforme stadig lider af passive celle optagelse, pre-moden nedbrydning, toksicitet og utilstrækkelig association med theranostic molekyler. VLPs overvinde mange af disse hindringer i målrettet levering. De har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler: et regime, der kan bruges til at bekæmpe mange sygdomme1. Dette program bygger primært på egenskaben i samlesæt og lethed af genetiske modifikationer, at opfylde programmet designet til den givne VLP. Sammenlignet med genteknologi, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLP viser en betydelig fordel, fordi det giver mulighed for en lang række enheder, såsom peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en moduleret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.

HEVNPs, afledt af af rekombinante HEV kapsid proteiner, 2nd åben læsning frame (ORF2), er ikke-infektiøse, selv samle capsids i stand til celle-bindende og post. Fordi HEV udviklet sig til slimhinden transmission, er forsamlede kapsid proteiner ligeledes stabil i proteolytiske og sure slimhinde betingelser5. HEVNPs danner en hule, T = 1 ikosaedriske kapsid, der består af 60 identiske enheder6,7 i ORF2, gør det yderst stabil i opbevaring og barske fysiologiske forhold. Mangler enhver viral genetiske elementer, er effektive og højt udbytte produktion opnået gennem baculovirus ekspressionssystem i insekt celler. På grund af deres proteolytiske stabilitet, er selvsamlede HEVNPs udvindes og renset fra celle supernatanten, betydeligt reducere nødvendige rensning trin. Derudover besidder HEVNPs en overflade udsat fremspring domæne (P domæne) tilsluttet via en fleksibel hængsel til en stabil ikosaedriske base. Domænet P danner overfladen-eksponerede pigge på toppen af den ikosaedriske base mens den fleksibel hængsel gør det muligt at væsentligt ændre domænet P uden at kompromittere den base ikosaedriske struktur. Med 60 gentagne enheder, enkelt lokationsspecifikke ændring resulterer i 60 symmetrisk websteder for kemiske graduering. For nylig har vi foreslået en nano-platform ved hjælp af HEVNP, der kan kemisk konjugat ligander eller små molekyler til theranostic applikationer. Dette blev opnået ved at udskifte en enkelt aminosyre med cystein på domænet fremspring af HEV-VLP som en reaktion site med maleimide-linked peptider eller molekyler. Baseret på tidligere strukturel analyse af HEV-VLP og velundersøgte immunogen epitoper8,9, de følgende fem HEV-VLP aminosyrer blev erstattet med cystein som potentielle kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C og T586C ( Figur 1). Efter proteinekspression og -oprensning fra insekt celler, deres VLP formationer blev bekræftet af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) observation (figur 2), og de udsatte cystein websteder blev analyseret af Western duppes efter maleimide-linked biotin konjugering (figur 2). Blandt de fem mutanter, HEVNP - 573C vises det stærkeste signal om maleimide-biotin konjugering (figur 2) og blev brugt til opfølgning demonstration som nanocarrier for bryst kræftcelle målretning4 (figur 3).

Denne protokol skildrer kemiske konjugation metoder for at tillægge HEVNPs tumor-targeting molekyler gennem overfladen cystein konjugering. Vi detalje konjugation af tumor målretning og sporing molekyler til tumor levering med rekombinante HEVNPs indeholdende en cysteine på N573 (HEVNP - 573C). Vi fokuserede på en to-trins Klik kemi konjugation proces til at binde en bryst kræft tumor målretning peptid, LXY3010 til HEVNPs form LXY30-HEVNP (figur 4). Efterfølgende, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 blev konjugeret til separat Lys-webstedet på HEVNPs at bygge LXY30-HEVNP-Cy5.5 til registrering af fluorescerende både in vitro- (figur 5) og in vivo4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HEVNP produktion i insekt celler

Bemærk: Alle følgende trin skal udføres i en celle kultur hætte. Henvise til vores tidligere publikation for mere detaljerede HEVNP produktion procedurer11.

  1. Kultur Sf9 celler i insekt cell media (Se Tabel af materialer) til 50-75% sammenløbet i 6-godt plader.
  2. Brug insekt celle Transfektion reagenser ifølge producentens protokoller, transfect Bacmids med HEVNP - 573 C ORF2 i Sf99 celler til at producere rekombinante baculovirus. Inkubér transfected cellerne på 27 ° C i 3-6 dage, afhængigt af levedygtigheden af celler.
  3. Indsamle supernatanten på 3-6 dage efter infektionen (efter de transfected celler er mængden på grund af baculovirus infektion) som P0 baculovirus lager.
  4. Fjerne næringssubstratet før du anvender 200 µL af P0 bestand på 50-75% sammenflydende Sf9 celler i en 25 cm2 éncellelag kolbe. Rock kolbe hver 15 min til at sikre den fulde dækning af inokulat. Gentag 4 gange, for i alt 60 min.
  5. Kolben tilsættes 2 mL af insekt cellekulturmedium og holde på 27 ° C i 3-6 dage, afhængigt af levedygtigheden af celler, til at forstærke baculovirus til et højere titer.
  6. Udføre plaque assays til at opnå baculovirus titer læsning12.
  7. Kultur de suspenderede Tn5 insekt celler (Tabel af materialer) med 100 mL af insekt celle medium i 250 mL målekolbe og rystes i 27 ° C ved 150 rpm til en titer af 0,5 x 105 - 1 x 106 til podning.
  8. Tilføj baculovirus på en mangfoldighed af infektion (MOI) 5-10 til 100 mL Tn5 celler i en 250 mL kolbe. Efter podning, omrystes i 27 ° C ved 150 rpm i 5-7 dage.
  9. Når de fleste celler vises at have blærer og 70-90% af celler er døde under optisk mikroskop observation, indsamle Tn5 cellerne og overføre til 33 mL ultracentrifuge rør. Sted ultracentrifuge rør i svinge spanden rotorer, balance og spin-ned celle debris og rekombinante baculoviruses på 10.000 x g i 90 min ved 25 ° C.
  10. Holde supernatanten, der indeholder de frigivne HEVNPs ved 4 ° C for yderligere rensning. Til opbevaring af baculovirus supernatanten, tilføje proteasehæmmere.

2. HEVNP rensning

  1. Pellet og isolere HEVNPs ved hjælp af cæsium chlorid (CsCl) gradient adskillelse:
    1. Overføre de indsamlede supernatanten (fra trin 1,10) og tilsættes 20% NP-40 i hver tube til at foretage en endelig koncentration på 0,5% NP-40 til at opløse alle resterende cellulære membran. Forsigtigt mix af pipettering og Inkuber i mindst 30 min. ved 25 ° C.
    2. Ultracentrifuge HEVNPs på 112,400 x g i svinge spanden rotorer i 2 timer ved 4 ° C til at pille ned HEVNPs fra supernatanten. Supernatanten efter centrifugering og forsigtigt genopslæmmes i rå pellet i 200 µL af 10 mM MES buffer pH 6.2 i hver tube natten over (O/N) ved 4 ° C. Køre SDS-PAGE (trin 3.1) for at bekræfte tilstedeværelsen af HEVNP ORF2 i den rå pellet som en 52 kDa band.
    3. Forbered en 38,5% (w/v) CsCl graduering af blanding 1.96 g CsCl, re suspenderede rå pellet og ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6.2 i 5 mL ultracentrifuge rør. Balance mellem rørene og sted i en swingende spand rotor. Ultracentrifuge på 147,000 x g i 16 timer ved 4 ° C.
  2. Indsamle fraktioner efter CsCl gradient:
    1. Kassér den top 500 µL fraktion, som er primært letvægts-celle membran rester. Indsamle 500 µL fraktioner, startende fra toppen af røret, og ændre tips i mellem hver fraktion. Læg hver fraktion i nummereret/mærket 1,5 mL rør.
      Bemærk: Tilstedeværelse af HEVNP ORF2 i brøkdele adskilt fra CsCl forløb ikke kan påvises ved at køre SDS side geler på grund af den høje koncentration af CsCl. CsCl i hver fraktion kan fjernes eller fortyndet ved at følge en CsCl oprydning procedure. Alternativt, CsCl gradient kan erstattes af en 10-40% saccharose gradient13 at undgå CsCl resterende.
    2. Overføre hver fraktion til et 5 mL ultracentrifuge rør og fortyndes CsCl med 4,5 mL af 10 mM MES, pH 6.2. Balance mellem rørene og sted i en swingende spand rotor. Ultracentrifuge på 147,000 x g i 2 timer ved 4 ° C til at pille ned i HEVNPs.
    3. Supernatanten og forsigtigt genopslæmmes i HEVNPs i 100 µL af 10 mM MES pH 6.2 i hver tube. Dække rør for at undgå fordampning og inkuberes O/N ved 4 ° C.
    4. Optage A280 læsning og A260/A280 nm ratio hjælp et spektrofotometer. Bestemme den omtrentlige koncentration af ORF2 som:
      Equation
      Hver ORF2 indeholder 1 Cys site og 1 Lys site for kemiske konjugering.
      Bemærk: Molær ekstinktion koefficient af HEVNP ORF2 er 60,280, svarende til 1.019 mg/mL × A280. Dette er så tæt på 1:1, koncentrationen af HEVNPs (i mg/mL) kan estimeres ved A280, og derfor koncentrationen af ORF2 af den ovenstående ligning. For eksempel, en HEVNP med en A280 læsning af 1 vil have en koncentration af 1 mg/mL, svarende til 18,8 µM ORF2.
    5. Forberede en SDS-PAGE. Bruge en 6 µL prøve fra hver fraktion til at bestemme de fraktioner, der indeholder 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (trin 3.1). HEVNPs skulle findes i fraktioner 3-5, med en massefylde på ~1.25 g/mL.
    6. Bekræfte tilstedeværelsen og renheden af HEVNPs TEM observation. Forberede eller fortyndet HEVNP prøver til 0,5 - 2,0 mg/mL for TEM. HEVNPs vises i TEM som Tom ikosaedriske proteiner, ~ 27 nm i diameter (figur 2). Nogle protein forureninger kan forblive i fraktioner og vil blive observeret under TEM (trin 3.2).
  3. I det tilfælde, at urenheder er til stede under TEM, Gentag trin 2.1.3 - 2.2.6 for bedre renhed af HEVNPs.
    Bemærk: Ekstra rensning gennem CsCl gradient kan medføre udbyttetab af af HEVNPs. Alternativt, CsCl gradient rensning kan erstattes af en 10-40% saccharose gradient at undgå resterende CsCl13.

3. HEVNP karakterisering

  1. Forberede SDS side 4-12% Bis-Tris Protein geler, 1,0 mm, 17-brønde (Se Tabel af materialer) efter brugerens manuel14:
    1. Tilføj 2 µL af 4 x loading bufferen til 6 µL af protein prøve. Inkuber prøve blandingen i en varme blok i 10 min. ved 100 ° C at denaturerer proteiner. Indlæse protein prøver på gelen.
    2. Køre SDS-PAGE ved at angive DC strømforsyning på 100 V i 10 min., derefter 150 V for 45 min før prøverne kørt til omkring 1 cm over bunden af gelen.
    3. Pletten SDS side gel med Coomassie blå (0,25% (w/v) Coomassie strålende blå R250, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) eddikesyre), for 1 h.
    4. Efter proceduren for farvning, Fjern Coomassie blå plet og anvende de-farvning buffer (30% (v/v) metanol, 10% (v/v) eddikesyre) på protein gel for > 12 timer ved stuetemperatur.
    5. Dokumentere gel under hvidt lys til at bekræfte tilstedeværelsen af HEVNP ORF2 på 52 kDa band.
  2. Overholde HEVNPs ved hjælp af TEM.
    1. Forberede eller fortyndet HEVNP prøver til 0,5 - 2 mg/mL med 10 mM MES pH 6.2 for TEM billeddannelse.
    2. Ionisere de CO2-belagt gitre med 40 mA glød decharge for 30 s til at producere en hydrofil carbon overflade. Glød decharge udstyr er beskrevet i Tabel af materialer.
      Bemærk: Hydrofile carbon overfladen af nettene kan kun sidst i 30 min efter glød decharge behandling.
    3. Hold i pincet og tilføje 2 µL af HEVNP prøve til gitteret, vente på 15-30 s og duppes med filtrerpapir.
    4. Straks vaske gitter med ddH20 og skamplet med filtrerpapir.
    5. Straks tilføje 2 µL af 2% uranyl acetat til gitteret, vent 15 s derefter skamplet med filtrerpapir. Tør prøve gitre ved at sætte dem i en elektronisk dehumidify tør kabinet for O/N.
    6. Overføre gitteret til et TEM og billede på 10-80k forstørrelse. HEVNPs vises i TEM som Tom ikosaedriske proteiner, som er ~ 27 nm i diameter, på grund af manglende viral RNA.

4. kemiske konjugering af HEVNPs med Biotin, kræft målretning Ligand og Fluorophores

  1. Udføre en skridt konjugering af HEVNPs og maleimide i forbindelse med biotin.
    1. Buffer ændring: anvende HEVNPs i mini dialyseenheder og dialyze mod 0,01 M PBS pH 7,4 ved stuetemperatur i 1 time efter producentens protokol (Tabel af materialer). Overførsel af HEVNPs til 1,5 mL rør og måle proteinkoncentration på 280 nm med et spektrofotometer.
    2. Bland HEVNP til 1 mg/mL, svarende til 18,8 µM Cys reaktion steder (Se detaljer i trin 2.2.4), med en lige mængde maleimide-biotin (100 µM) i 0,01 M PBS, pH 7,4, at lave en 1:5 molære forhold; reagere O/N ved 4 ° C. Fjerne ubundne maleimide-biotin med en 40 K MWCO Spin Desalting kolonne procedure efter producentens protokol (Tabel af materialer).
    3. Analysere prøver gennem en standard at reducere SDS-PAGE (trin 3.1).
    4. Bruger standard procedurer, forberede en kemiluminescens Western Blot ved hjælp af HRP-knyttet Streptavidin. Fange den kemiluminescens signal af X ray film (figur 2).
  2. Udføre to skridt LXY30 konjugation til overfladen-eksponerede cystein på HEV NPs (figur 5).
    1. Buffer exchange: anvende HEVNPs i mini dialyseenheder og dialyze mod 0,01 M PBS pH 7,4 ved stuetemperatur for 1 h. overførsel af HEVNPs til 1,5 mL rør og måle proteinkoncentration på 280 nm med et spektrofotometer.
    2. Tilføje 650 µM maleimide-indeholder og 650 µM alkyn-LXY3010 i 0,01 M PBS pH 7,4 med 200 µM CuSO4 og 1 mM ascorbinsyre til at danne maleimide i forbindelse med LXY30 (Mal-LXY30) på 650 µM. Inkuber blanding på 4 ° C for O/N.
    3. Bland HEVNP til 1 mg/mL, svarende til 18,8 µM af Cys reaktion websted (Se detaljer i trin 2.2.4), med omkring 10% volumen af Mal-LXY30 (650 µM) i 0,01 M PBS pH 7,4, at gøre en kindtand forholdet 1:3; reagere O/N ved 4 ° C.
      Bemærk: På grund af den relativt høje koncentration af Mal-LXY30, er de endelige koncentrationerne af reaktanter, såsom CuSO4, reduceret omkring 10 gange efter blanding, for at undgå deres skader på HEVNPs. En anden mulighed er Cu-fri konjugation metode15.
    4. Fjern ubundne maleimide-Klik-LXY30 med en 40 K MWCO Spin afsaltning kolonne efter producentens protokol (Se Tabel af materialer). Holde LXY30 i forbindelse med HEVNPs (LXY30-HEVNPs) ved 4 ° C.
  3. Udføre en skridt konjugering af LXY30-HEVNPs og Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5)
    1. Bland LXY30 i forbindelse med HEVNPs (LXY30-HEVNPs) til 1 mg/mL, svarende til 18,8 µM af webstedet Cys reaktion (Se detaljer i trin 2.2.4), med lige saa stort volumen af NHS-Cy5.5 (100 µM) i 0,01 M PBS pH 7,4 at lave en 1:5 molære forhold; reagere O/N ved 4 ° C.
    2. Fjern ubundne Cy5.5-NHS med en 40K MWCO Spin afsaltning kolonne procedure efter producentens protokol (Se Tabel af materialer). Holde LXY30, Cy5.5 i forbindelse med HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) ved 4 ° C.

5. HEVNP Binding til og internalisering i MDA-MB231 brystkræftceller

  1. Frø MDA-MB231 brystkræftceller i et 35-mm glas bund retter (5 x 104 per parabol) O/N i et pattedyr cellekultur kabinet.
  2. For celle bindende eksperiment, forberede LXY30-HEVNP-Cy5.5 af følgende trin 4.2-4.3. Fortynd LXY30-HEVNP-Cy5.5 til 0,01 mg/mL, hvilket svarer til 0.188 µM af HEVNP ORF2 (Se trin 2.2.4), i 250 µL af 0 - 1% FBS/DMEM.
    1. Forberede negativ kontrolprøve på 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 ved at følge trin 4.3 men konjugeret med NHS-Cy5.5 farvestof kun, (HEV-Cy5.5). Fortynd HEVNP-Cy5.5 til 0,01 mg/mL, hvilket svarer til 0.188 µM af HEVNP ORF2 (Se trin 2.2.4), i 250 µL af 10% FBS suppleret med DMEM.
  3. Vaske cellerne en gang ved at anvende 250 µL 1 M PBS buffer, pH 7,4. Fjerne PBS buffer efter vask, samtidig med at nogle buffer i celle kultur parabol.
  4. Anvende 250 µL af LXY30-HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS suppleret med DMEM eller HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS suppleret med DMEM til de kulturperler MDA-MB231 brystkræftceller. Skjold cellen kulturperler retter fra lys med aluminiumsfolie.
  5. Holde celle kulturperler retter i et 37 ° C cellekultur kabinet for 1 h for internalisering.
  6. Vask de dyrkede celler på isen 3 gange, 5 min pr. vask, med 250 µL 1 M PBS, pH 7,4.
  7. Fix celler i 4% PFA i 1 M PBS, pH 7,4 for 20 min og derefter vaskes en gang med 250 µL 1 M PBS, pH 7,4.
    Bemærk: Cellerne er nu klar til afbildning af Konfokal mikroskop. Repræsentative data er vist i figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beslægtet med HEV-VLPs, alle Cys modificerede HEVNPs dannet opløselige ikosaedriske capsids og samlet ikke i løsning under produktion eller rensning. Før og efter trinvis maleimide-biotin konjugering, hver af Cys modificerede var HEVNPs umulig at skelne fra HEV-VLPs i den negative pletten EM (figur 2). Maleimide-biotin konjugation effektivitet til Cys modificerede HEVNPs blev først testet med Western blotting via kemiluminescens streptavidin bindende. Efter maleimide-biotin konjugering ændrede Cys HEVNPs vises streptavidin bindende signaler (figur 2).

Effektiv totrins cystein konjugation var påvirket af den rækkefølge, hvori konjugation blev udført. Fordi α3β1 integrin er være overexpressed i bryst kræft tumorceller, en syntetisk ligand, LXY30, med specifik affinitet til α3β1 blev10, valgt som en tumor-targeting konjugat molekyle. Direkte maleimide (MaI) functionalization af LXY30 var ikke mulig, fordi LXY30 er genindvundet gennem en intermolekylære disulfid obligation; Derfor var der en bekymring for self-reactivity. I stedet, LXY30 var functionalized med en alkyn gruppe og bundet til maleimide-indeholder gennem et klik kemi reaktion. Når HEV - 573C NPs var bundet til maleimide-indeholder først, syntes efterfulgt af et klik kemi reaktion på LXY30-alkyn, HEV - 573C NPs at demontere under TEM observation (figur 4 c). En indledende Klik kemi reaktion mellem LXY30-alkyn og maleimide-indeholder form MaI-LXY30, efterfulgt af MaI-LXY30 konjugation til Cys-modificeret HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) påvirkede imidlertid ikke sin struktur (figur 4B). Figur 4 viser en skematisk af LXY30-functionalization af HEVNPs for tumor celle målretning.

HEVNPs konjugeret med brystkræft målretning ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) bundet og blev internaliseret i kulturperler brystkræftceller. For fluorescerende opdagelse, LXY30-HEVNPs og ubundne HEVNP-573Cs var mærket med NHS functionalized Cy5.5 fluorescerende farvestof (NHS-Cy5.5) gennem primære Amin kobling af lysin på HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 og HEVNP-Cy5.5 blev anvendt til kulturperler brystkræft celler (MDA-MB-231) og observeret af Konfokal mikroskopi. NIR fluorescens billeder af Konfokal mikroskop tyder på LXY30-HEVNP-Cy5.5 havde højere bindende affinitet for og øget internalisering i MDA-MB-231 brystkræftceller sammenlignet med HEVNP-Cy5.5 (figur 5).

Figure 1
Figur 1: cystein udskiftning på domænet overflade fremspring af hepatitis E virus nanopartikel. Cystein mutationer blev foreslået for restkoncentrationer Y485, T489, S533, N573 og T586 på fleksible coil-regionen til at minimere forstyrrelser i HEV ORF2 sekundær struktur (A). Alle de valgte rester til cystein mutation er placeret på overfladen af domænet fremspring (P) (grå; de øvrige domæner er shell (S) - domæne i blå og midten (M) - domæne i pink), rester Y485 (cyan), T489 (gul), T586 (orange) på den yderste overflade, og rester S533 (magenta) og N573 (rød) på den side vender den fem gange akse af HEVNP (B). Tallet er blevet ændret fra Chen et al. 20164 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af HEVNP transporterer N573C som et eksempel for alle Cys modificeret HEVNPs. HEVNP - 573C optrådte som sfæriske fremskrivninger på elektron micrographs (A) og forblev intakt partikler efter Mal-biotinylating konjugering (B). Repræsentative resultater af Cys-modificerede HEVNPs konjugering og epitop eksponering. De var bundet til maleimide-biotin via cystein-maleimide kobling og efterfølgende analyseres gennem vestlige skamplet for streptavidin bindende. Cystein mutation på N573 tilladt effektive biotinylation til HEVNP i forhold til de andre mutation websteder, dvs., Y485, T489, S533 og T586 (C). Bar er lig med 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af brystkræftceller der er specifikt målrettet med Cy5.5-mærket LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 binde selektivt til brystkræftceller (magenta) på grund af LXY30's særlige affinitet til α3β1, som er en over udtrykt integrin på bryst kræft cellemembranen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: en skematisk af to-trins kemiske konjugation processer, herunder en thiol-selektiv reaktion og en kobber katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition eller 'Klik kemi' reaktion på opbygge LXY30-HEVNPs. To metoder er blevet testet. Metode 1: kobber katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition reaktion mellem Mal-indeholder og alkyn-LXY30 form Mal-knyttet LXY30 (Mal-LXY30) blev udført først. Derefter blev Mal-LXY30 tilføjet til at reagere med webstedet Cys af HEV - 573C NPs (A). LXY30 og Cy5.5 indrettet HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) forblev intakt efter alle disse kemiske konjugation processer (B). Metode 2: konjugation processen begynder ved mærkning Mal-linked indeholder (Mal-indeholder) på webstedet Cys af HEV - 573C NPs gennem en thiol-selektiv reaktion at bygge indeholder-knyttet HEVNPs (indeholder-HEVNPs), fulgte ved at tilføje LXY30-alkyn, ascorbinsyre og CuSO4 at danne LXY30 i forbindelse med HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A). Men de fleste LXY30-HEVNPs var beskadiget eller afmonterede fra konjugation processer, som kan være forårsaget af de reaktive reagenser, herunder indeholder, ascorbinsyre og CuSO4 (C). Mal: Maleimide. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al. 20164 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentative resultater af celle bindende og internalisering af mærket fluorescently LXY30-HEVNPs, som binder til MDA-MB-231 brystkræftceller. NIR fluorescens billeder af LXY30-HEVNP-Cy5.5 målretning til MDA-MB-231 celler. Signal af cellekerner, som var plettet af DAPI (blå), og Cy5.5 (rød)-signalet er anskaffet ved hjælp af en Konfokal fluorescens mikroskop. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al. 20164 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I modsætning til den tidskrævende genteknologi procedure, som normalt tager uger, her vi demonstrere simpel totrins og one-step kemiske konjugation procedurer, som kan være afsluttet inden for 3 dage, for at tilføje kræft målretning ligand og/eller Fluorescens påvisning farvestof til Cys/Lys steder i HEVNPs. Teknikken kan bruges til at screene for bedste ligand målet fra en pulje af ansøgere, og dermed tager fordel af de tilgængelige peptid/lille molekyle syntese tjenester til en rimelig pris og levering tid.

I modsætning til traditionelle genteknologi, hvilket kan kun indsætte polypeptider i proteiner af interesse, den kemiske konjugation kan forbinde forskellige materialer herunder polypeptider, små kemiske molekyler og nanopartikler på overfladen af den protein af interesse, så længe der er en Cys eller Lys rester skal bruges som den reaktive site. Hvis der er ingen sådanne rester på webstedet kemiske konjugering, kan enkle Cys/Lys udskiftning genetisk modificeret på protein af interesse at gøre det kemisk activatable, som det fremgår tidligere forskning4.

For at kontrollere at den kemiske konjugation kun opstår på selektiv reaktion websteder, strukturen i både konjugat molekyle og protein konjugeret behov skal undersøges grundigt for at undgå intramolekylære reaktivitet. Som vist heri med brystkræft målretning peptid LXY3010, stabiliserer en kritisk disulfid obligation cyklisk ligand kropsbygning. Givet thiol-reaktivitet af maleimide, direkte maleimide-functionalization af LXY30 ligander vil sandsynligvis resultere i intramolekylære reaktivitet. I stedet blev to trin konjugering (trin 4.2) udført ved at reagere på maleimide-linked indeholder med alkyn-knyttet LXY30 gennem Klik kemi reaktion. Rækkefølgen af klik kemi reaktion og thiol-udvalgte reaktion er imidlertid afgørende for den konformationelle handelsformer af LXY30-HEVNPs (figur 4). Gennem en CuSO4 katalyseret Klik-kemi reaktion, blev LXY30 indirekte bundet til maleimide at bygge MaI-LXY30. Efterfølgende, er MaI-LXY30 konjugeret til HEVNP - 573C således, at de dannede LXY30-HEVNPs kan beholde deres oprindelige ikosaedriske struktur (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender sponsorering af finansieringen til RHC af NIH yde #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Statens Institut for fødevarer og landbrug samt Finland Distinguished Professor program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 cystein udskiftning kemiske konjugering hepatitis E viruslignende partikler multivalent ligand display målretning ligand
Overflade Functionalization af Hepatitis E Virus nanopartikler ved hjælp af kemiske konjugation metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter