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Bioengineering

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

Nous avons conçu la protéine de capside du virus de l’hépatite E comme une NANOPARTICULE théranostiques (HEVNP). HEVNP auto assemble dans une cage icosaédrique stable en livraison muqueuse. Nous décrivons ici la modification de HEVNPs pour tumeur ciblage par mutation exposés à la surface des résidus cystéines, qui conjugue des ligands synthétiques qui lient spécifiquement les cellules tumorales.

Abstract

Pseudo-particules virales (VLP) ont servi de nanocarriers à afficher des épitopes étrangers et/ou livrer de petites molécules dans la détection et le traitement de diverses maladies. Cette application s’appuie sur la modification génétique, l’auto-assemblage et conjugaison de cystéine pour remplir l’application ciblage tumoral de recombinant VLP. comparés avec génétique modification seul, chimique conjugaison de peptides étrangers les PPV offre une significative avantage car elle permet une variété d’entités telles que les peptides synthétiques ou des oligosaccharides, à être conjugués à la surface du PPV de manière modulée et flexible, sans altération de l’Assemblée VLP.

Ici, nous démontrons comment utiliser la virus de l’hépatite E virus NANOPARTICULE (HEVNP), une capsule de théranostiques modularisée, comme un transporteur livraison multifonctionnel. Les fonctions de HEVNPs incluent ciblage tissulaire, l’imagerie et livraison thérapeutique. Basé sur les recherches structurales bien établie de HEVNP, les résidus structurellement indépendants et exposés à la surface ont été sélectionnés pour le remplacement de la cystéine comme sites de conjugaison pour groupes chimiques maléimide liés par l’intermédiaire de liens thiol-sélective. Une notamment cystéine-modification HEVNP (remplacement de l’asparagine à 573 Cys aa HEVNP - 573C) était conjugué à un ligand spécifique des cellules du cancer du sein LXY30 et marqués par agent de fluorescence proche infrarouge (NIR) (Cy5.5), rendant la tumeur ciblées HEVNPs sous forme de capsules de diagnostics efficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ingénierie des stratégies similaires peuvent être utilisés avec d’autres complexes macromoléculaires avec la structure atomique bien connue à explorer des applications potentielles dans la livraison de théranostiques.

Introduction

Le développement de vecteurs de taille nanométrique dans livraison thérapeutique et diagnostique, connu comme nanotheranostics, a déplacé une grande partie du domaine biomédical, loin des traitements généralisés sur CIBLEE1. Livraison nanotheranostic ciblées intègre des vecteurs de taille nanométrique (nanoparticules) avec des molécules de théranostiques pour diriger stablement théranostiques molécules à un tissu malade spécifique ou voie biochimique2,3,4 . Nanomédecine est venu au premier plan de l’administration ciblée parce que la tailles optimale des nanoparticules ont la capacité de stabiliser la circulation des molécules théranostiques et cibler sélectivement les molécules de surface cellulaire présentés sur les tissus malades. Nombreuses plates-formes nanotheranostic souffrent encore de l’apport des cellules passives, la dégradation prématurée, toxicité et insuffisante association avec des molécules de théranostiques. VLP surmonter bon nombre de ces obstacles dans l’administration ciblée. Ils ont été utilisés comme nanocarriers a representer les épitopes étrangers et/ou livrer de petites molécules : un régime qui peut être utilisé pour lutter contre de nombreuses maladies1. Cette application s’appuie principalement sur la propriété d’auto-assemblage ainsi que la facilité des modifications génétiques, pour remplir l’application conçue pour le PPV donnée. Par rapport au génie génétique, conjugaison chimique des peptides étrangers à VLP affiche un avantage important car il permet une grande variété d’entités, telles que des peptides ou des oligosaccharides, à être conjugués à la surface du PPV dans un modulé et avec souplesse sans altération de l’Assemblée VLP.

HEVNPs, dérivés de la protéine de capside recombinante HEV, 2nd ouvert cadre (ORF2) de lecture, sont non infectieuses auto-assemblage capsides capables de liaison cellulaire et l’entrée. Parce que HEV évolué pour la transmission de la muqueuse, la protéine de capside assemblé est de même stable en conditions muqueux protéolytique et acide5. HEVNPs forment un creux, T = 1 capside icosaédrique, composé de 60 unités identiques6,7 de ORF2, rendant extrêmement stable en stockage et en dures conditions physiologiques. Absence de tout élément génétique virale, la production efficace, haut rendement se faite par système d’expression baculovirus dans des cellules d’insecte. En raison de leur stabilité protéolytique, HEVNPs auto-assemblées sont extrait et purifiés de surnageant de la cellule, réduit considérablement les étapes de purification nécessaire. En outre, les HEVNPs possèdent un surface exposée saillie domaine (P) relié par une charnière flexible à une base stable icosaédrique. Le domaine P forme pointes surface exposée au sommet de la base icosaédrique tandis que la charnière flexible permet de modifier de façon significative le domaine P sans compromettre la base structure icosaédrique. Avec 60 unités répétées, seule modification spécifique résulte en 60 sites symétriques pour la modulation chimique. Récemment, nous avons proposé une nano-plate-forme à l’aide de HEVNP qui peut conjuguer chimiquement ligands ou petites molécules pour les applications théranostiques. Ceci a été réalisé en substituant un seul acide aminé cystéine sur le domaine de la protrusion de la HEV-VLP comme un site de réaction avec les peptides liés maléimide ou molécules. Basé sur l’analyse structurelle précédente de HEV-VLP et bien étudiés épitopes immunogènes8,9, suivant cinq acides aminés HEV-VLP ont été remplacés avec la cystéine comme des candidats potentiels : Y485C, T489C, S533C, N573C et T586C ( Figure 1). Après expression et purification de cellules d’insectes, leurs formations de VLP ont été confirmées par l’observation de microscopie électronique (met) de transmission (Figure 2), et les sites de cystéine exposés ont été analysés par Western blot après biotine maléimide liés conjugaison (Figure 2). Parmi les cinq mutants, HEVNP - 573C affiche le signal le plus fort de la conjugaison maléimide-biotine (Figure 2) et a été utilisé pour le suivi de démonstration comme le nanocarrier pour cellule de cancer du sein ciblant4 (Figure 3).

Ce protocole décrit les méthodes chimiques de conjugaison pour fixer les molécules cibles tumorales à HEVNPs grâce à la conjugaison de cystéine surface. Nous détaillons la conjugaison de molécules ciblant et détection de tumeur pour la livraison de la tumeur avec HEVNPs recombinants contenant une cystéine à N573 (573C - HEVNP). Nous nous sommes concentrés sur un processus de conjugaison de chimie de clic en deux étapes pour lier une tumeur de cancer du sein ciblage peptide, LXY3010 d’HEVNPs de forme LXY30-HEVNP (Figure 4). Par la suite, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 ont été conjugués sur le site de Lys distinct sur HEVNPs construire LXY30-HEVNP-Cy5.5 pour la détection par fluorescence les deux in vitro (Figure 5) et in vivo4.

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Protocol

1. HEVNP Production dans des cellules d’insecte

NOTE : Tous les étapes suivants devraient être effectuées sous une hotte de culture cellulaire. Se référer à notre publication précédente pour plus d’HEVNP production procédures11.

  1. Culture de cellules Sf9 dans médias cell insecte (voir Table des matières) à la confluence de 50 à 75 % en plaques 6 puits.
  2. Utilisant des réactifs de transfection de cellules insectes selon les protocoles du fabricant, transfecter Bacmids contenant HEVNP - 573 C ORF2 dans Sf99 cellules pour produire des baculovirus recombinant. Incuber les cellules transfectées à 27 ° C pendant 3 à 6 jours, en fonction de la viabilité des cellules.
  3. Recueillir le surnageant à 3-6 jours après l’infection (après que les cellules transfectées sont lysées due à une infection de baculovirus) comme P0 baculovirus stock.
  4. Éliminer le milieu de culture avant d’appliquer 200 µL de stock de P0 à 50-75 % des cellules Sf9 confluentes dans un ballon jaugé de 25 cm2 monocouche. Balancer le ballon toutes les 15 min pour assurer la couverture complète de l’inoculum. Répéter 4 fois, pour un total de 60 min.
  5. Ajouter 2 mL de milieu de culture cellulaire insectes dans le ballon et le maintenir à 27 ° C pendant 3 à 6 jours, selon la viabilité des cellules, pour amplifier les baculovirus à un titre plus élevé.
  6. Procéder à des essais de plaque afin d’obtenir le titre de baculovirus lecture12.
  7. Culture, les cellules d’insectes Tn5 suspendus (Table des matières) avec 100 mL d’un milieu cellulaire insectes en flacon de 250 mL et agiter à 27 ° C à 150 tr/min pour un titre de 0,5 x 105 - 1 x 106 pour l’inoculation.
  8. Ajouter baculovirus à une multiplicité d’infection (MOI) des cellules Tn5 5-10 à 100 mL dans un ballon jaugé de 250 mL. Après l’inoculation, agiter à 27 ° C à 150 tr/min pendant 5 à 7 jours.
  9. Une fois que la plupart des cellules semblent avoir des vésicules et 70-90 % des cellules sont mortes sous observation microscope optique, recueillir les cellules Tn5 et transférer dans des tubes de 33 mL ultracentrifugeuse. Placer l’ultracentrifugeuse tubes en balançant des rotors de seau, la balance et centrifuger les débris cellulaires et les baculovirus recombinants à 10 000 x g pendant 90 min à 25 ° C.
  10. Gardez le surnageant qui contient les HEVNPs libérés à 4 ° C pendant plus de purification. Pour un stockage prolongé des baculovirus surnageant, ajouter des inhibiteurs de la protéase.

2. HEVNP Purification

  1. Pellet et isoler les HEVNPs de césium (CsCl) le chlorure par séparation dégradé :
    1. Transvaser le liquide surnageant collecté (de l’étape 1.10) et ajouter 20 % NP-40 dans chaque tube à une concentration finale de 0,5 % NP-40 pour dissoudre toute membrane cellulaire restant. Doucement de la composition de pipetage et incuber pendant au moins 30 min à 25 ° C.
    2. Ultracentrifugeuse les HEVNPs à 112 400 x g, en balançant des rotors seau pendant 2 h à 4 ° C pour granuler vers le bas des HEVNPs du surnageant. Jeter le surnageant après centrifugation et doucement Resuspendre le culot brut dans 200 µL de 10 mM MES tampon pH 6.2 dans chaque tube du jour au lendemain (O/N) à 4 ° C. Exécutez le SDS-PAGE (étape 3.1) pour confirmer la présence de HEVNP ORF2 dans le culot de brut tant que groupe de 52 kDa.
    3. Préparer un gradient de CsCl 38,5 % (p/v) de mixage 1,96 g CsCl, culot brut remises en suspension et ~ 4 mL de 0,01 M MES pH 6.2 dans un tube de 5 mL ultracentrifugeuse. Équilibrer les tubes et les placer dans un rotor oscillant de seau. Ultracentrifugeuse à 147 000 x g pendant 16 h à 4 ° C.
  2. Recueillir les fractions après gradient de CsCl :
    1. Jeter la fraction µL 500 albums, qui est principalement des débris de membrane cellulaire léger. Recueillir 500 fractions µL, commençant par le haut du tube et changer des trucs entre chaque fraction. Placer chaque fraction en tubes numérotés/étiqueté 1,5 mL.
      Remarque : La présence de HEVNP ORF2 en fractions séparées de CsCl dégradé ne peut être détecté en exécutant SDS PAGE gels en raison de la forte concentration de CsCl. Le CsCl dans chaque fraction peut être supprimé ou dilué en suivant une procédure de nettoyage du CsCl. Par ailleurs, le gradient de CsCl peut être remplacé par un 10-40 % saccharose dégradé13 pour éviter CsCl résiduelle.
    2. Transférer chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugeuse de 5 mL et diluer le CsCl avec 4,5 mL de 10 mM MES, pH 6.2. Équilibrer les tubes et les placer dans un rotor oscillant de seau. Ultracentrifugeuse à 147 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour granuler vers le bas des HEVNPs.
    3. Jeter le surnageant et resuspendre doucement les HEVNPs dans 100 µL de 10 millimètres MES pH 6.2 dans chaque tube. Couvrir les tubes pour éviter l’évaporation et incuber O/N à 4 ° C.
    4. Enregistrer la lecture A280 et A260/A280 rapport de nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Déterminer la concentration approximative du ORF2 comme :
      Equation
      Chaque ORF2 contiendra 1 site de Cys et 1 site de Lys pour conjugaison chimique.
      Remarque : Le coefficient d’extinction molaire de HEVNP ORF2 est 60 280, qui équivaut à 1,019 mg/mL × A280. C’est si proche de 1:1 que la concentration de HEVNPs (en mg/mL) peut être approchée par la A280 et par conséquent, la concentration de l’ORF2 par l’équation ci-dessus. Par exemple, un HEVNP avec une lecture A280 1 aura une concentration de 1 mg/mL, ce qui équivaut à 18,8 µM ORF2.
    5. Préparer une SDS-PAGE. Utiliser un échantillon de 6 µL de chacune des fractions pour déterminer les fractions contenant des protéines de kDa HEVNP ORF2 53,3 (étape 3.1). Les HEVNPs devraient se trouve dans les fractions 3-5, avec une densité de ~1.25 g/mL.
    6. Confirmer la présence et la pureté de HEVNPs par l’observation de TEM. Préparer ou diluer les échantillons HEVNP à 0,5 - 2,0 mg/mL pour le TEM. Les HEVNPs apparaissent dans TEM sous vides protéines icosaédriques, ~ 27 nm de diamètre (Figure 2). Certains contaminants de protéine peuvent rester dans les fractions et seront observés sous TEM (étape 3.2).
  3. Dans le cas que les impuretés sont présentes sous TEM, répétez l’étape 2.1.3 - 2.2.6 pour meilleure pureté des HEVNPs.
    Remarque : Purification Extra par gradient de CsCl peut causer des pertes de rendement de HEVNPs. Par ailleurs, la purification de gradient de CsCl peut être remplacée par un gradient de sucrose de 10 à 40 % pour éviter les résidus CsCl13.

3. caractérisation de HEVNP

  1. Préparer la protéine de Bis-Tris Gels de SDS PAGE 4-12 %, 1,0 mm, 17-wells (voir la Table des matières) selon le manuel de l’utilisateur14:
    1. Ajouter 2 µL de 4 x chargement tampon à 6 µL de l’échantillon de protéine. Incuber le mélange de l’échantillon dans un bloc chauffant pendant 10 min à 100 ° C pour dénaturer les protéines. Charger les échantillons de protéines sur le gel.
    2. Exécutez le SDS-PAGE en définissant l’alimentation CC à 100 V pendant 10 min, puis 150 V pendant 45 min jusqu'à ce que les échantillons course à environ 1 cm au-dessus du fond du gel.
    3. Coloration du gel SDS PAGE par le bleu de Coomassie (0,25 % (p/v) de Coomassie brillant bleu R250, 30 % (v/v) de méthanol, acide acétique 10 % (v/v)), pendant 1 h.
    4. Après la procédure de marquage, enlever la tache de bleu de Coomassie et appliquer le tampon de coloration (30 % (v/v) de méthanol, acide acétique 10 % (v/v)) sur le gel de protéine pour > 12 h à température ambiante.
    5. Le document le gel sous une lumière blanche afin de confirmer la présence du HEVNP ORF2 à la bande de 52 kDa.
  2. Observer les HEVNPs à l’aide de TEM.
    1. Préparer ou diluer les échantillons HEVNP à 0,5 - 2 mg/mL, avec un pH MES 10 mM 6.2 pour l’imagerie TEM.
    2. Ionisent les grilles carbone revêtu avec lampe à décharge luminescente mA 40 pendant 30 s pour produire une surface hydrophile carbone. L’équipement de décharge lueur est décrite dans la Table des matières.
      Remarque : La surface hydrophile carbone des grilles peut seulement modifié pendant 30 min après la lueur s’acquitter de traitement.
    3. Tenir dans la pince à épiler et ajoutez 2 µL de l’échantillon HEVNP à la grille, attendre 15 à 30 s et éponger avec du papier filtre.
    4. Laver immédiatement la grille avec les ddH20 et la tache avec du papier filtre.
    5. Immédiatement ajouter 2 µL d’acétate d’uranyle de 2 % de la grille, attendre 15 s, puis la tache avec du papier filtre. Sèche les grilles de l’échantillon en les plaçant sur un support électronique déshydratent armoire sèche pour O/N.
    6. Transvaser la grille dans une image à un grossissement de 10-80k et TEM. HEVNPs apparaissent en TEM comme protéines icosaédriques vides ~ 27 nm de diamètre, en raison de l’absence d’ARN viral.

4. conjugaison chimique de HEVNPs avec biotine et Cancer ciblant Ligand des Fluorophores

  1. Effectuer une conjugaison d’étape de HEVNPs et de la biotine maléimide lié.
    1. Changement de tampon : appliquer les HEVNPs dans les unités de dialyse mini et dialyser contre 0,01 M PBS pH 7,4 à température ambiante pendant 1 h selon le protocole du fabricant (Table des matières). Transférer les HEVNPs pour tubes de 1,5 mL et mesurer la concentration de protéine à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Mélanger le HEVNP à 1 mg/mL, ce qui équivaut à 18,8 µM de Cys sites réactionnels (voir détails à l’étape 2.2.4), avec une quantité égale de maléimide-biotine (100 µM) dans du PBS 0,01 M, pH 7,4, faire un rapport molaire de 1:5 ; réagir O/N à 4 ° C. Retirez le maléimide-biotine indépendant avec une procédure de colonne 40 K MWCO Spin Desalting selon le protocole du fabricant (Table des matières).
    3. Analyse des échantillons grâce à une norme réduisant SDS-PAGE (étape 3.1).
    4. À l’aide de procédures standards, préparer une chimiluminescence Western Blot à l’aide de streptavidine HRP-lié. Capter le signal par chimiluminescence de film de rayons X (Figure 2).
  2. Effectuer deux étapes LXY30 conjugaison à la cystéine surface exposée sur NPs HEV (Figure 5).
    1. Échange de tampon : appliquer HEVNPs en unités de dialyse mini et dialyser contre 0,01 M PBS pH 7,4 à température ambiante pendant 1 h. transfert du HEVNPs pour tubes de 1,5 mL et mesurer la concentration de protéines à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Ajouter 650 µM maléimide-azoture et 650 µM alcyne-LXY3010 dans 0,01 M PBS pH 7,4 à 200 µM CuSO4 et 1 mM l’acide ascorbique pour former le maléimide-linked LXY30 (Mal-LXY30) à 650 µM. Incuber le mélange à 4 ° C O/N.
    3. Mélanger le HEVNP à 1 mg/mL, ce qui équivaut à 18,8 µM de Cys site de réaction (voir détails à l’étape 2.2.4), avec environ 10 % volume de Mal-LXY30 (650 µM) à 0,01 M PBS pH 7,4, faire un rapport molaire de 1:3 ; réagir O/N à 4 ° C.
      Remarque : En raison de la concentration relativement élevée de Mal-LXY30, les concentrations finales des réactifs, tels que CuSO4, sont réduites environ 10 fois après le mélange, pour éviter d’endommager leur HEVNPs. Une autre option est le Cu-gratuit conjugaison méthode15.
    4. Suppression non consolidé maléimide-clic-LXY30 avec une colonne 40 K MWCO Spin dessalage selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Garder les HEVNPs lié à LXY30 (LXY30-HEVNPs) à 4 ° C.
  3. Effectuer une conjugaison d’étape de la LXY30-HEVNPs et ester Cy5.5 NHS (NHS-Cy5.5)
    1. Mélanger les HEVNPs lié à LXY30 (LXY30-HEVNPs) à 1 mg/mL, ce qui équivaut à 18,8 µM du site réaction Cys (voir détails à l’étape 2.2.4), avec un volume égal de NHS-Cy5.5 (100 µM) à 0,01 M PBS pH 7,4 pour faire un rapport molaire de 1:5 ; réagir O/N à 4 ° C.
    2. Suppression non consolidé Cy5.5-NHS avec une procédure de colonne MWCO Spin dessalage 40K selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Garder le LXY30, le HEVNPs lié à Cy5.5 (LXY30-HEVNP-Cy5.5) à 4 ° C.

5. HEVNP lie à et internalisation dans les cellules de Cancer du sein MDA-MB231

  1. Cellules de cancer du sein MDA-MB231 graines dans un verre de 35 mm fond plats (5 x 104 par plat) O/N dans une culture de cellules de mammifères du cabinet.
  2. Pour l’expérience de liaison cellulaire, préparer LXY30-HEVNP-Cy5.5 en suivant étapes 4.2 et 4.3. Diluer le LXY30-HEVNP-Cy5.5 à 0,01 mg/mL, ce qui équivaut à 0,188 µM de HEVNP ORF2 (reportez-vous à l’étape 2.2.4), dans 250 µL de 0 - 1 % FBS/DMEM.
    1. Préparation des échantillons de contrôle négatif à 0,01 mg/mL, et HEVNP-Cy5.5, en suivant le point 4.3 mais conjugués avec colorant NHS-Cy5.5 seulement, (HEV-Cy5.5). Diluer le HEVNP-Cy5.5 à 0,01 mg/mL, ce qui équivaut à 0,188 µM de HEVNP ORF2 (reportez-vous à l’étape 2.2.4), dans 250 µL de 10 % FBS additionné de DMEM.
  3. Laver les cellules une fois en appliquant 250 µL de tampon PBS de 1 M, pH 7,4. Retirez le tampon PBS après le lavage, tout en conservant une mémoire tampon dans le plat de culture cellulaire.
  4. Appliquer 250 µL de LXY30-HEVNP-Cy5.5 10 % FBS additionné de DMEM ou HEVNP-Cy5.5 10 % FBS additionné de DMEM aux cellules cancéreuses mammaires MDA-MB231 cultivés. Bouclier de la cellule culture plats de lumière avec du papier aluminium.
  5. Garder les plats de cellules cultivées dans une culture de cellules de 37 ° C armoire pendant 1 h pour l’internalisation.
  6. Laver les cellules cultivées sur la glace 3 fois, 5 min / cycle de lavage, avec 250 µL de PBS 1 M, pH 7,4.
  7. Fixer les cellules chez 4 % PFA dans du PBS 1 M, pH 7,4 pendant 20 min et lavage puis une fois avec 250 µL de PBS 1 M, pH 7,4.
    NOTE : Les cellules sont maintenant prêts à être photographié par microscope confocal. Des données représentatives sont indiquées à la Figure 5.

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Representative Results

S’apparente à la HEV-VLP, Cys tous modifiés capsides icosaédriques solubles HEVNPs formés et ne pas agréger en solution au cours de la production ou la purification. Avant et après modification de conjugaison seule étape maléimide-biotine, chacun de la Cys HEVNPs étaient impossibles à distinguer de la HEV-PPV dans la tache négative EM (Figure 2). Efficacité de conjugaison maléimide-biotine à Cys mis à jour le HEVNPs a été tout d’abord testé avec Éponger occidental via la liaison streptavidine chimiluminescence. Après conjugaison maléimide-biotine, Cys modifié des signaux de liaison streptavidine HEVNPs affichés (Figure 2).

Conjugaison de cystéine efficace en deux étapes a été influencée par l’ordre dans lequel la conjugaison a été réalisée. Car l’intégrine α3β1 est surexprimée dans cellules de tumeurs mammaires cancéreuses, un ligand synthétique, LXY30, avec une affinité spécifique à α3β110, a été choisi comme une molécule conjuguée ciblage tumoral. Fonctionnalisation de direct maléimide (MaI) de LXY30 n’était pas possible parce que LXY30 est cyclisé grâce à une liaison disulfure intermoléculaires ; par conséquent, il y avait un souci d’autoréactivité. Au lieu de cela, LXY30 est fonctionnalisée avec un groupe d’alcyne et lié à maléimide-azide grâce à une réaction de chimie de clic. Lorsque NPs HEV - 573C étaient tenus de maléimide-azide tout d’abord, suivie d’une réaction de chimie de clic à LXY30-alcyne, le NPs HEV - 573C est apparu à démonter sous observation TEM (Figure 4). Cependant, une réaction de chimie de clic initial entre LXY30-alcyne et maléimide-azide à forme MaI-LXY30, suivie de MaI-LXY30 conjugaison à Cys-modified HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) n’a pas affecté sa structure (Figure 4 b). La figure 4 montre une représentation schématique de la LXY30-fonctionnalisation de HEVNPs pour cibler les cellules tumorales.

HEVNPs conjugués pour le cancer du sein, ciblage de ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) liés et ont été internalisées dans les cellules cancéreuses du sein cultivées. Pour la détection par fluorescence, LXY30-HEVNPs et HEVNP-573Cs indépendant sont marquées avec le NHS fonctionnalisés Cy5.5 colorant fluorescent (NHS-Cy5.5) par le biais de couplage amine primaire de la lysine sur HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 et HEVNP-Cy5.5 ont été appliqués à cultivées le cancer du sein cellules (MDA-MB-231) et observée par microscopie confocale. Les images de fluorescence NIR par microscope confocal indiquent que lxy30-HEVNP-Cy5.5 avait plus contraignant affinités et internalisation accrue dans les cellules MDA-MB-231 mammaires cancéreuses par rapport aux HEVNP-Cy5.5 (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : remplacement de cystéine sur le domaine de la saillie de surface des nanoparticules de virus de l’hépatite E. Les mutations de cystéine ont été proposées pour les résidus de Y485, T489, S533, N573 et T586 à la région de bobine flexible pour réduire au minimum la perturbation de la structure secondaire de la HEV ORF2 (A). Tous les résidus de sélectionnés pour la mutation de la cystéine sont situés à la surface du domaine protrusion (P) (gris ; les autres domaines sont la coquille (S) - domaine en bleu et milieu (M) - domaine en rose), le résidu Y485 (cyan), T489 (jaune), T586 (orange) sur la plus haute surface et le résidu S533 (magenta) et N573 (rouge) sur la face tournée vers l’axe quintuplé de HEVNP (B). La figure a été modifiée par Chen et al 20164 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : caractérisation des HEVNP transportant des N573C comme un exemple pour tous les Cys modifiés HEVNPs. Le HEVNP - 573C est apparu comme des projections sphériques sur les micrographies (A) et est restée sous forme de particules intactes après conjugaison Mal-biotinylating (B). Résultats représentatifs de l’exposition de conjugaison et épitope de Cys modifiés HEVNPs. Ils étaient liés à la maléimide-biotine par couplage cystéine-maléimide et puis analysés par Western blot pour la liaison streptavidine. La mutation cystéine à N573 permis biotinylation efficace à la HEVNP par rapport aux autres sites de mutation, c'est-à-dire, Y485, T489, S533 et T586 (C). Bar équivaut à 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : schéma de cellules de cancer du sein qui sont adressent spécifiquement avec marqué Cy5.5 LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 lient sélectivement aux cellules de cancer du sein (magenta) en raison de la spécificité de LXY30 à α3β1, qui est une intégrine surexprimée sur la membrane des cellules du cancer du sein. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : une représentation schématique des processus chimiques conjugaison en deux étapes, y compris une réaction sélective thiol et un cuivre azoture-alcyne catalysée par cycloaddition ou « chimie de clic » réaction de construire LXY30-HEVNPs. Deux méthodes ont été testées. Méthode 1 : la cuivre azoture-alcyne catalysée par la réaction de cycloaddition entre Mal-azide et alcyne-LXY30 pour former LXY30 Mal-linked (Mal-LXY30) a été effectuée tout d’abord. Ensuite le Mal-LXY30 a été ajoutée pour réagir avec le site de Cys de HEV - 573C NPs (A). Les LXY30 et les Cy5.5 décorées HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) est restée intacte après tout ces processus chimiques conjugaison (B). Méthode 2 : le processus de conjugaison commence par marquage Mal lié azoture (Mal-Azide) sur le site de Cys de HEV - 573C NPs à travers une réaction sélective des thiols de construire lié azoture HEVNPs (Azide-HEVNPs), suivis en ajoutant LXY30-alcyne, l’acide ascorbique et CuSO4 pour former des HEVNPs lié à LXY30 (LXY30-HEVNPs) (A). Cependant, la plupart LXY30-HEVNPs ont été endommagés ou démontés des processus de conjugaison, qui peuvent être provoquées par les réactifs, y compris l’azoture, l’acide ascorbique et CuSO4 (C). Mal : maléimide. Ce chiffre a été modifié par Chen et al 20164 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : résultats représentatifs de la liaison de la cellule et l’internalisation des fluorescent étiqueté LXY30-HEVNPs, qui se lie aux cellules de cancer du sein MDA-MB-231. Images de fluorescence NIR de LXY30-HEVNP-Cy5.5 ciblant les cellules MDA-MB-231. Le signal des noyaux, qui ont été colorées par DAPI (bleu), et le signal de Cy5.5 (rouge) ont été recueillies à l’aide d’un microscope confocal fluorescence. Ce chiffre a été modifié par Chen et al 20164 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Contrairement à la procédure de votre temps de génie génétique, qui prend généralement semaines, nous démontrons simple en deux étapes et procédures de conjugaison chimique en une seule étape, ce qui peuvent être complétées en 3 jours, d’ajouter le cancer en ciblant les ligands et/ou colorant de détection fluorescence aux sites Cys/Lys de HEVNPs. La technique peut être utilisée pour dépister la meilleure cible de ligand d’un bassin de candidats et donc met à profit les services de synthèse disponibles peptide/petite molécule à une heure raisonnable du coût et de la livraison.

Contrairement au génie génétique traditionnelle, qui peut seulement insérer les polypeptides dans les protéines d’intérêt, la conjugaison chimique peut se connecter à divers matériaux, y compris les polypeptides, petites molécules chimiques et nano-particules sur la surface de la protéine d’intérêt, tant qu’il y a un résidu Cys ou Lys pour servir le site réactif. S’il n’y a pas de ces résidus sur le site de conjugaison chimique, simple remplacement de Cys/Lys peut être génétiquement modifié sur la protéine d’intérêt pour le rendre chimiquement activable comme démontré dans la précédente recherche4.

Pour contrôler que la conjugaison chimique se produit uniquement sur les sites de réaction sélective, la structure de la molécule conjuguée et protéines pour être conjugué besoin d’être étudié en profondeur afin d’éviter la réactivité intramoléculaire. Comme démontré ci-dessus avec le cancer du sein ciblage peptide LXY3010, une liaison disulfure critique stabilise la conformation du ligand cyclique. Compte tenu de la thiol-réactivité des maléimide, direct maléimide-fonctionnalisation des ligands LXY30 provoquera vraisemblablement en réactivité intramoléculaire. Au lieu de cela, deux conjugaison étape (étape 4.2) a été réalisée en faisant réagir l’azoture maléimide lié avec LXY30 alcyne-lié par réaction de chimie de clic. Cependant, la séquence de la réaction de chimie de clic et la réaction thiol-sélectionné est essentielle pour l’intégrité conformationnelle des LXY30-HEVNPs (Figure 4). Grâce à une réaction de clic-chimie4 catalysée CuSO, LXY30 a été indirectement lié au maléimide pour construire MaI-LXY30. Par la suite, la MaI-LXY30 sont conjugués à HEVNP - 573C tel que les LXY30-HEVNPs formés peuvent conserver leur structure icosaédrique native (Figure 4).

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le parrainage du financement de RHC de NIH accorder #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Institut National de l’alimentation et l’Agriculture, ainsi que le programme de l’éminent professeur en Finlande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

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References

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Bio-ingénierie numéro 135 remplacement de cystéine conjugaison chimique l’hépatite E Pseudo-particules virales affichage de ligand multivalents ciblage de ligand
Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison
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Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

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