Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57020
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

Vi har konstruerat det kapsid proteinet av hepatit E-virus som en theranostic nanopartiklar (HEVNP). HEVNP monterar själv in i en stabil ikosaedriska bur i slemhinnor leverans. Här, beskriver vi ändring av HEVNPs för tumör inriktning av muterar yta-exponerade rester till cysteines, som konjugat syntetiska ligander som specifikt binder tumörceller.

Abstract

Virusliknande viruslika partiklar har använts som nanocarriers för att Visa utländska epitoper och/eller leverera små molekyler i identifiering och behandling av olika sjukdomar. Detta program bygger på genetisk modifiering, självmontering, och cystein konjugation att uppfylla tumör-targeting tillämpningen av rekombinant framställda. jämfört med genetisk modifiering ensam, kemiska Konjugation av främmande peptider till framställda erbjuder en betydande fördel eftersom det tillåter en mängd enheter, såsom syntetiska peptider eller oligosackarider, att vara konjugerat till ytan av framställda på en modulerad och flexibelt sätt utan ändring av sammansättningen VLP.

Här visar vi hur du använda hepatit E virus nanopartikelportföljen (HEVNP), en modulariserade theranostic kapsel, som multifunktionella leverans bärare. HEVNPs funktioner inkluderar vävnad-targeting, imaging och terapeutiska leverans. Baserat på väletablerade strukturella forskning av HEVNP, valdes strukturellt oberoende och surface-exponerade rester för cystein ersättare som konjugation platser för maleimide-länkade kemiska grupper via thiol-selektiv kopplingar. Ett särskilt cystein-modifierat HEVNP (Cys återinsättande av asparagin på 573 aa HEVNP - 573C) var konjugerat till en breast cancer cell-specifik ligand, LXY30 och märkt med nära infraröd (NIR) fluorescens färgämne (Cy5.5), återgäldande den tumör-riktade HEVNPs som effektiva diagnostiska kapslar (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Liknande engineering strategier kan användas med andra makromolekylärt komplex med välkända atomära strukturer att utforska potentiella tillämpningar i theranostic leverans.

Introduction

Utvecklingen av nanostorlek vektorer i terapeutiska och diagnostiska leverans, känd som nanotheranostics, har skiftat mycket av det biomedicinska fältet från generaliserad behandlingar mot riktade leverans1. Riktade nanotheranostic leverans integrerar nanostorlek vektorer (nanopartiklar) med theranostic molekyler stabilt direkt theranostic molekyler till en specifik sjuk vävnad eller biokemisk väg2,3,4 . Nanomedicin har kommit i förgrunden för riktade leverans eftersom optimalt storlek nanopartiklarna har kapacitet att stabilisera cirkulationen av theranostic molekyler och selektivt rikta cell surface molekyler presenteras på sjuka vävnader. Många nanotheranostic plattformar är fortfarande lider av passiv cell upptag, pre mogen nedbrytning, toxicitet och otillräcklig association med theranostic molekyler. Framställda övervinna många av dessa hinder i riktade leverans. De har använts som nanocarriers för att Visa utländska epitoper och/eller leverera små molekyler: en regim som kan användas för att bekämpa många sjukdomar1. Denna ansökan är främst beroende av egenskapen för självmontering samt användarvänlighet genetiska modifieringar, att uppfylla utformad ansökan om den givna VLP. Jämfört med genteknik, kemiska Konjugation av främmande peptider till VLP visar en betydande fördel eftersom den tillåter en stor mängd enheter, t ex peptider eller oligosackarider, att vara konjugerat till ytan av framställda i en modulerad och flexibelt sätt utan ändring av VLP församling.

HEVNPs, härrör från det rekombinanta HEV kapsid proteinet, 2nd öppen läsa frame (ORF2), är icke-infektiös, självmonterande förhoppningsvis kan cell-bindande och posten. Eftersom HEV utvecklats för slemhinnor överföring, är monterade kapsid protein likaså stabilt i proteolytiska och sura slemhinnor villkor5. HEVNPs bildar en ihålig, T = 1 ikosaedrisk kapsid, består av 60 identiska enheter6,7 i ORF2, gör den mycket stabil både lagring och fysiologiska förhållanden. Saknar någon virus genetiska element, uppnås effektiv, hög avkastning produktionen genom baculoviridae uttryck systemet i insekt celler. På grund av deras proteolytiska stabilitet, själv monterade HEVNPs extraheras och renas från cell supernatanten, avsevärt minska nödvändiga reningssteg. HEVNPs besitter dessutom en yta exponerad utstick domänen (P) ansluten via ett flexibelt gångjärn till en stabil ikosaedriska bas. P domänen bildar ytan-utsatt spikar ovanpå ikosaedriska basen medan den flexibla gångjärnen gör det möjligt att avsevärt ändra domänen P utan att kompromissa med bas ikosaedrisk struktur. Med 60 upprepade enheter, enda platsspecifika modifiering resulterar i 60 symmetriska platser för kemiska modulering. Nyligen har vi föreslagit en nano-plattform med hjälp av HEVNP som kan kemiskt pneumokocker ligander eller små molekyler för theranostic applikationer. Detta uppnåddes genom att ersätta en enda aminosyra med cystein på domänen utstick av HEV-VLP som en reaktion webbplats med maleimide-länkade peptider eller molekyler. Baserat på tidigare strukturella analysen av HEV-VLP och väl studerat immunogent epitoper8,9, de följande fem HEV-VLP aminosyrorna ersattes med cystein som potentiella kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C och T586C ( Figur 1). Efter uttryck och rening från insekt celler, bekräftades deras VLP formationer av överföring elektronmikroskopi (TEM) observation (figur 2), och de exponerade cystein platserna analyserades genom Western blot efter maleimide-länkade biotin konjugering (figur 2). Bland fem mutanter, HEVNP - 573C visas den starkaste signalen för maleimide-biotin konjugation (figur 2) och användes för uppföljning demonstration som nanocarrier för bröstcancer cancercell inriktning4 (figur 3).

Detta protokoll skildrar kemiska konjugation metoder om du vill bifoga tumör-targeting molekyler HEVNPs genom ytan cystein konjugation. Vi detalj konjugationen av tumör inriktning och upptäckt molekyler för tumör leverans med rekombinant HEVNPs som innehåller en cystein på N573 (HEVNP - 573C). Vi fokuserade på en klick kemi konjugation tvåstegsprocess att binda en breast cancertumör inriktning peptid, LXY3010 till HEVNPs att bilda LXY30-HEVNP (figur 4). Därefter, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 var konjugerat till webbplatsen separat Lys på HEVNPs att bygga LXY30-HEVNP-Cy5.5 för fluorescerande upptäckt både in vitro- (figur 5) och i vivo4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HEVNP produktion i insekt celler

Obs: Alla följande steg bör utföras i en cell kultur huva. Se våra tidigare publicering för mer detaljerad HEVNP produktion förfaranden11.

  1. Kultur Sf9 celler i insekt cell media (se Tabell för material) till 50-75% sammanflödet i 6 brunnar.
  2. Med insekt cell transfection reagens enligt tillverkarens protokollen, transfect Bacmids som innehåller HEVNP - 573 C ORF2 till Sf99 celler att producera rekombinant baculoviridae. Inkubera transfekterade cellerna vid 27 ° C i 3-6 dagar, beroende på livskraften hos celler.
  3. Samla in supernatanten vid 3-6 dagar efter infektion (efter de transfekterade cellerna är lyserat på grund av baculoviridae infektion) som P0 baculoviridae lager.
  4. Ta bort odlingsmedium innan du applicerar 200 µL P0 beståndet till 50-75% konfluenta Sf9 celler i en 25 cm2 enskiktslager kolv. Kolven var 15 min för att säkerställa full täckning av inokulatet sten. Upprepa 4 gånger, för totalt 60 min.
  5. Tillsätt 2 mL av insekt cellodlingsmedium till kolven och hålla vid 27 ° C för 3-6 dagar, beroende på viabiliteten hos celler, att förstärka baculoviridae till en högre titer.
  6. Genomföra plack analyser att erhålla baculoviridae titern läsning12.
  7. Kultur de svävande Tn5 insekt cellerna (Tabell för material) med 100 mL insekt cell medium i 250 mL-kolven och skaka i 27 ° C på 150 rpm till en titer på 0,5 x 105 - 1 x 106 för inympning.
  8. Tillsätt baculoviridae vid en multiplicity av infektion (MOI) 5-10 till 100 mL Tn5 celler i en 250 mL mätkolv. Efter inympningen, skaka i 27 ° C på 150 rpm i 5-7 dagar.
  9. När de flesta celler verkar ha blåsor och 70-90% av celler är döda under ljusmikroskop observation, samla Tn5 cellerna och föra in 33 mL ultracentrifugen rören. Plats ultracentrifugen rör i swinging hink rotorer, balans och spinn ner cellfragment och rekombinant baculoviruses vid 10 000 x g i 90 min vid 25 ° C.
  10. Förvara supernatanten som innehåller de frisläppta HEVNPs vid 4 ° C för ytterligare rening. För utökad lagring av baculoviridae supernatanten, lägga till proteashämmare.

2. HEVNP rening

  1. Pellet och isolera de HEVNPs använda cesium klorid (CsCl) gradient separation:
    1. Överföra insamlade supernatanten (från steg 1.10) och lägga 20% NP-40 i varje rör att göra en slutlig koncentration av 0,5% NP-40 att upplösa alla återstående cellulära membran. Försiktigt blanda genom pipettering och inkubera i minst 30 min vid 25 ° C.
    2. Ultracentrifugen HEVNPs vid 112,400 x g i swinging hink rotorer för 2 h vid 4 ° C till pellet ner HEVNPs från supernatanten. Kassera supernatanten efter centrifugering och försiktigt åter centrifugerade rå i 200 µL 10 mM MES buffert pH 6,2 i varje rör över natten (O/N) vid 4 ° C. Kör SDS-PAGE (steg 3.1) för att bekräfta förekomsten av HEVNP ORF2 i rå pelleten som 52 kDa band.
    3. Förbereda en 38,5% (w/v) CsCl gradient av blandande 1,96 g CsCl, åter svävande rå pellet och ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6,2 i en 5 mL ultracentrifugen tub. Balansera rören och placera i en svängande hink rotor. Ultracentrifugen vid 147.000 x g under 16 timmar vid 4 ° C.
  2. Samla in fraktioner efter CsCl lutning:
    1. Kassera den översta 500 µL fraktionen, som är primärt lätta cellmembranet skräp. Samla 500 µL fraktioner, start från toppen av röret, och ändra tips mellan respektive fraktion. Placera varje fraktion i numrerade/märkt 1,5 mL rör.
      Obs: Förekomsten av HEVNP ORF2 i fraktioner separerade från CsCl lutning inte kan upptäckas genom att köra SDS-PAGE geler på grund av den höga koncentrationen av CsCl. CsCl i respektive fraktion kan tas bort eller späds genom att följa ett CsCl sanering förfarande. CsCl övertoningen kan alternativt ersättas med en 10-40% sackaros gradient13 att undvika CsCl kvarstående.
    2. Överför varje fraktion till en 5 mL ultracentrifugen tub och späd CsCl med 4,5 mL av 10 mM MES, pH 6,2. Balansera rören och placera i en svängande hink rotor. Ultracentrifugen vid 147.000 x g under 2 timmar vid 4 ° C till pellet ner i HEVNPs.
    3. Avlägsna supernatanten och försiktigt slamma HEVNPs i 100 µL 10 mM MES pH 6,2 i varje rör. Täck rören för att undvika avdunstning och inkubera O/N vid 4 ° C.
    4. Registrera A280 läsning och baserat på A260/A280 nm med en spektrofotometer. Bestämma den ungefärliga koncentrationen av ORF2 som:
      Equation
      Varje ORF2 innehåller 1 Cys plats och 1 Lys webbplats för kemiska konjugation.
      Obs: Den molära extinktionskoefficient av HEVNP ORF2 är 60,280, vilket motsvarar 1.019 mg/mL × A280. Detta är så nära 1:1 som koncentrationen av HEVNPs (i mg/mL) kan approximeras med A280 och därför koncentrationen av ORF2 av ekvationen ovan. Till exempel en HEVNP med en A280 läsning av 1 kommer att ha en koncentration av 1 mg/mL, vilket motsvarar 18,8 µM ORF2.
    5. Förbereda en SDS-PAGE. Använda ett 6 µL prov från respektive fraktion för att avgöra fraktioner innehållande 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (steg 3.1). HEVNPs bör finnas i fraktioner 3-5, med en täthet ~1.25 g/ml.
    6. Bekräfta förekomsten och HEVNPs renhet genom TEM observation. Förbereda eller utspädd HEVNP proverna till 0,5 - 2,0 mg/mL för TEM. I HEVNPs visas i TEM som Tom ikosaedriska proteiner, ~ 27 nm i diameter (figur 2). Vissa protein föroreningar kan finnas kvar i fraktioner och kommer att observeras under TEM (steg 3,2).
  3. I fall att orenheter är närvarande under TEM, upprepa steg 2.1.3 - 2.2.6 för bättre renhet av HEVNPs.
    Obs: Extra rening genom CsCl lutning kan orsaka avkastning förlust av HEVNPs. CsCl gradient rening kan alternativt ersättas med 10-40% sackaros toning att undvika kvarstående CsCl13.

3. HEVNP karakterisering

  1. Förbereda SDS sida 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 17-wells (se Tabell för material) enligt användarens manuell14:
    1. Tillsätt 2 µL av 4 x laddar buffert till 6 µL av protein provet. Inkubera provet blandningen i ett värme block under 10 minuter vid 100 ° C att denaturera proteinet. Ladda protein proverna på gelen.
    2. Kör SDS-sidan genom att ange DC strömförsörjningen på 100 V i 10 min, sedan V 150 för 45 min tills proverna springa till ca 1 cm ovanför botten av gelen.
    3. Fläcken SDS sida gelen med Coomassie blå (0,25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) ättiksyra), för 1 h.
    4. Efter färgning ingreppet, ta bort Coomassie blå fläcken och tillämpa de färgning buffert (30% (v/v) metanol, 10% (v/v) ättiksyra) på protein gelen för > 12 timmar vid rumstemperatur.
    5. Dokumentera gelen under vitt ljus till förekomsten av HEVNP ORF2 på 52 kDa bandet.
  2. Iaktta de HEVNPs som använder TEM.
    1. Förbereda eller utspädd HEVNP proverna till 0,5 - 2 mg/mL med 10 mM MES pH 6,2 för TEM avbildning.
    2. Jonisera de kol-belagd nät med 40 mA glöd ansvarsfrihet för 30 s för att producera en hydrofil kol yta. Glow ansvarsfrihet utrustningen beskrivs i Tabell för material.
      Obs: Hydrofil kol ytan av rutnäten kan endast senast 30 min efter glöd ansvarsfrihet behandling.
    3. Håller i pincetten och tillsätt 2 µL HEVNP prov i rutnätet, vänta 15-30 s och blot med filterpapper.
    4. Tvätta omedelbart rutnätet med ddH20 och blot med filterpapper.
    5. Tillsätt omedelbart 2 µL av 2% uranyl acetat till rutnätet, vänta 15 s, sedan blot med filterpapper. Torra prov rutnäten genom att sätta dem i ett elektroniskt avfukta torrt skåp för O/N.
    6. Över rutnätet till en TEM och bild på 10-80k förstoring. HEVNPs visas i TEM som Tom ikosaedriska proteiner som är ~ 27 nm i diameter, på grund av avsaknad av viral RNA.

4. kemisk Konjugation av HEVNPs med Biotin, Cancer inriktning Ligand och Fluorophores

  1. Utföra en steg Konjugation av HEVNPs och maleimide länkade biotin.
    1. Buffra förändring: Applicera HEVNPs i mini dialysenheter och dialyze mot 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4 i rumstemperatur i 1 h enligt tillverkarens protokollet (Tabell för material). Överföra HEVNPs till 1,5 mL rör och mäta protein koncentrationen vid 280 nm med en spektrofotometer.
    2. Blanda HEVNP till 1 mg/mL, vilket motsvarar 18,8 µM av Cys reaktion platser (se detaljer i steg 2.2.4), med en lika stor mängd maleimide-biotin (100 µM) i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 7,4, att göra en molar förhållandet 1:5; reagera O/N vid 4 ° C. Ta bort obundna maleimide-biotin med ett 40 K MWCO Spin Desalting kolumn förfarande enligt tillverkarens protokollet (Tabell för material).
    3. Analysera proverna genom en standard minska SDS-PAGE (steg 3.1).
    4. Med hjälp av standardprocedurer, förbereda en kemiluminiscent Western Blot använder HRP-länkade streptividin. Fånga Kemiluminiscens signalen genom X ray film (figur 2).
  2. Utföra två steg LXY30 konjugation till ytan-utsatt cystein på HEV NPs (figur 5).
    1. Buffra exchange: Applicera HEVNPs i mini dialysenheter och dialyze mot 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4 vid rumstemperatur för 1 h. överföring av HEVNPs till 1,5 mL rör och mäta protein koncentrationen vid 280 nm med en spektrofotometer.
    2. Lägga till 650 µM maleimide-natriumazid och 650 µM alkynen-LXY3010 i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4 med 200 µM CuSO4 och 1 mM askorbinsyra bildar maleimide-länkade LXY30 (Mal-LXY30) på 650 µM. Inkubera blandningen vid 4 ° C i O/N.
    3. Blanda HEVNP till 1 mg/mL, vilket motsvarar 18,8 µM av Cys reaktion webbplats (se detaljer i steg 2.2.4), med ca 10% volym av Mal-LXY30 (650 µM) i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4, att göra en 1:3 molar förhållandet; reagera O/N vid 4 ° C.
      Obs: På grund av den relativt höga koncentrationen av Mal-LXY30, de slutliga koncentrationerna av reaktanterna, såsom CuSO4, minskas ca 10 gånger efter blandning, för att undvika deras skada HEVNPs. Ett annat alternativ är de Cu-fri konjugation metod15.
    4. Ta bort obundna maleimide-Klicka-LXY30 med en 40 K MWCO snurra avsaltning kolumn enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material). Hålla de LXY30-länkade HEVNPs (LXY30-HEVNPs) vid 4 ° C.
  3. Utföra en steg Konjugation av LXY30-HEVNPs och Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5)
    1. Blanda de LXY30-länkade HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 1 mg/ml, vilket motsvarar 18,8 µM för webbplatsen Cys reaktion (se detaljer i steg 2.2.4), med lika stor volym av NHS-Cy5.5 (100 µM) i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4 att göra en molar förhållandet 1:5; reagera O/N vid 4 ° C.
    2. Ta bort obundna Cy5.5-NHS med ett 40K MWCO snurra avsaltning kolumn förfarande enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material). Hålla den LXY30, Cy5.5-länkade HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) vid 4 ° C.

5. HEVNP bindande till och internalisering i MDA-MB231 bröstcancerceller

  1. Bröstcancerceller i utsäde MDA-MB231 i en 35 mm glas botten rätter (5 x 104 per maträtt) O/N i en däggdjursceller kultur skåp.
  2. För cell bindande experimentet, förbereda LXY30-HEVNP-Cy5.5 genom följande steg 4,2-4,3. Späd den LXY30-HEVNP-Cy5.5 till 0,01 mg/mL, vilket motsvarar 0.188 µM av HEVNP ORF2 (se steg 2.2.4), i 250 µL 0 - 1% FBS/DMEM.
    1. Förbereda det negativa kontrollprovet på 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 genom att följa steg 4,3 men konjugerade med NHS-Cy5.5 färgämne, (HEV-Cy5.5). Späd den HEVNP-Cy5.5 till 0,01 mg/mL, vilket motsvarar 0.188 µM av HEVNP ORF2 (se steg 2.2.4), 250 µL 10% FBS kompletteras med DMEM.
  3. Tvätta cellerna en gång genom att tillämpa 250 µL av 1 M PBS buffert, pH 7,4. Ta bort PBS-bufferten efter tvätten, samtidigt hålla vissa buffert i cell kultur skålen.
  4. Tillsätt 250 µL av LXY30-HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS kompletteras med DMEM eller HEVNP-Cy5.5 i 10% FBS kompletterades med DMEM till de odlade bröstcancerceller i MDA-MB231. Sköld cellen odlade rätter från ljus med aluminiumfolie.
  5. Hålla de cell odlade rätterna i en 37 ° C cellkultur skåp för 1 h för internalisering.
  6. Tvätta de odlade cellerna på is 3 gånger, 5 min per tvätt, med 250 µL 1 M PBS, pH 7,4.
  7. Fixa cellerna i 4% PFA i 1 M PBS, pH 7,4 för 20 min och sedan tvätta en gång med 250 µL av 1 M PBS, pH 7,4.
    Obs: Cellerna är nu redo att avbildas av confocal mikroskopet. Representativa uppgifter visas i figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Besläktad med HEV-framställda, alla Cys modifierade HEVNPs bildas lösliga ikosaedriska förhoppningsvis och samlade inte i lösning under produktion eller rening. Innan och efter steg maleimide-biotin konjugation, vart och ett av Cys ändrat var HEVNPs omöjlig att skilja från HEV-framställda i negativa fläcken EM (figur 2). Maleimide-biotin konjugation effektivitet till Cys modifierade HEVNPs testades först med Western blotting via Kemiluminiscens streptividin bindande. Efter maleimide-biotin konjugation ändrade Cys HEVNPs visas streptividin bindande signaler (figur 2).

Effektiv two-step cystein konjugation influerades av den ordning i vilken konjugation genomfördes. Eftersom α3β1 integrin är vara överuttryckt i bröstcancer tumörceller, en syntetisk ligand, LXY30, valdes10, med specifika affinitet till α3β1 som en tumör-targeting konjugat molekyl. Direkta maleimide (MaI) funktionalisering av LXY30 var inte möjlig eftersom LXY30 är cyclized genom en intermolekylära disulfide bond; Därför fanns det en oro för self-reactivity. Istället var LXY30 functionalized med en alkynen grupp och bunden till maleimide-natriumazid genom en klick kemi reaktion. När HEV - 573C NPs var bundna till maleimide-natriumazid först, tycktes följt av en klick kemi reaktion på LXY30-alkynen, HEV - 573C NPs ta isär under TEM observation (figur 4 c). En inledande Klicka kemi reaktion mellan LXY30-alkynen och maleimide-natriumazid form MaI-LXY30, följt av MaI-LXY30 konjugation till Cys-modifierat HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) påverkade emellertid inte dess struktur (figur 4B). Figur 4 visar en schematisk bild av LXY30-funktionalisering av HEVNPs för tumör cell inriktning.

HEVNPs konjugerat till bröstcancer inriktning ligand, LXY30 (LXY30-HEVNPs) bunden och var internaliseras i odlade bröstcancerceller. För fluorescerande upptäckt, LXY30-HEVNPs och obundna HEVNP-573Cs var märkt med NHS functionalized Cy5.5 fluorescerande färgämne (NHS-Cy5.5) genom primära aminen kopplingen av lysin på HEVNP-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 och HEVNP-Cy5.5 tillämpades till odlade bröstcancer celler (MDA-MB-231) och observeras av konfokalmikroskopi. NIR fluorescens bilderna av confocal mikroskopet visar LXY30-HEVNP-Cy5.5 hade högre bindande affinitet för och ökad internalisering i MDA-MB-231 bröstcancerceller jämfört med HEVNP-Cy5.5 (figur 5).

Figure 1
Figur 1: cystein byte på domänen yta deformation av hepatit E virus nanopartiklar. Cystein mutationer föreslogs för rester Y485, T489, S533, N573, och T586 på regionen flexibelt spole för att minimera störningen till det sekundära strukturerar av HEV ORF2 (A). Alla valda rester för cystein mutation finns på ytan av domänen utstick (P) (grå; andra domäner är skalet (S) - domän i blått och mitten (M) - domän i rosa), med rester Y485 (cyan), T489 (gul), T586 (orange) på den yttersta yta, och rester S533 (magenta) och N573 (röd) på den sida som vetter mot femfaldigt axeln av HEVNP (B). Figuren har ändrats från Chen et al. 20164 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av HEVNP bär N573C som ett exempel för alla Cys ändras HEVNPs. Den HEVNP - 573C framträdde som sfäriska projektioner på elektronmikrografier (A) och förblev som intakt partiklar efter Mal-biotinylating konjugation (B). Representativa resultat av Cys-modifierat HEVNPs konjugation och epitop exponering. De var bundna till maleimide-biotin via cystein-maleimide koppling och därefter analyseras genom Western blot för streptividin bindning. Cystein mutationen på N573 tillåtna effektiva biotinylation till den HEVNP jämfört med de andra mutation platser, dvs, Y485, T489, S533 och T586 (C). Bar är lika med 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk av bröstcancerceller som är speciellt avsedda med Cy5.5-märkt LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5). LXY30-HEVNP-Cy5.5 binder selektivt till bröstcancer cancerceller (magenta) på grund av LXY30's specifika affinitet till α3β1, vilket är en alltför uttryckt integrin på cellmembranet breast cancer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: en schematisk two-step kemiska konjugation processer, inklusive en tiol-selektiv reaktion och en koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen eller 'Klicka kemi' reaktion att bygga LXY30-HEVNPs. Två metoder har testats. Metod 1: koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen reaktionen mellan Mal-natriumazid och alkynen-LXY30 att bilda Mal-länkade LXY30 (Mal-LXY30) utfördes först. Sedan lades de Mal-LXY30 för att reagera med Cys platsen för HEV - 573C NPs (A). De LXY30 och Cy5.5 inredda HEV - 573C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) förblev intakt efter alla dessa kemiska konjugation processer (B). Metod 2: konjugation processen inleds med märkning Mal-länkade natriumazid (Mal-natriumazid) på webbplatsens Cys i HEV - 573C NPs genom en tiol-selektiv reaktion att bygga natriumazid-länkade HEVNPs (natriumazid-HEVNPs), följt av att lägga till LXY30-alkynen, askorbinsyra och CuSO4 att bilda LXY30-länkade HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A). Dock var de flesta LXY30-HEVNPs skadad eller demonteras från de konjugation processer, som kan orsakas av reaktiva reagenser, inklusive natriumazid, askorbinsyra och CuSO4 (C). Mal: Maleimide. Denna siffra har ändrats från Chen et al. 20164 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativa resultat av cell bindande och internalisering av märkt fluorescently LXY30-HEVNPs, som binder till MDA-MB-231 bröstcancerceller. NIR fluorescens bilder av LXY30-HEVNP-Cy5.5 inriktning till MDA-MB-231 celler. Signalen av atomkärnor, som var färgade av DAPI (blå), och signalen för Cy5.5 (röd) förvärvades med confocal fluorescens Mikroskop. Denna siffra har ändrats från Chen et al. 20164 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I motsats till det tidskrävande genteknik förfarandet, vilket tar vanligtvis veckor, här visar vi enkla two-step och one-step kemiska konjugation förfaranden, som kan slutföras inom 3 dagar, lägga till cancer inriktning ligand eller fluorescens upptäckt dye till Cys/Lys platser i HEVNPs. Tekniken kan användas till skärm för bästa ligand målet från en pool av kandidater, och därmed drar fördel av tillgängliga peptid/liten molekyl syntes tjänster på en rimlig kostnad och leverans tid.

Till skillnad från traditionella genteknik, som kan bara infoga polypeptiderna i proteiner av intresse, kemiska konjugationen kan ansluta olika material inklusive polypeptider, små kemiska molekyler och nano-partiklar på ytan av den protein av intresse, så länge det finns en Cys eller Lys rester som ska användas som reaktiv webbplatsen. Om det finns inga sådana rester på webbplatsen kemiska konjugation, kan enkel Cys/Lys ersättning vara genetiskt modifierade på proteinet av intresse att göra det kemiskt activatable som visat i tidigare forskning4.

För att styra som kemiska konjugationen uppstår bara på selektiv reaktion webbplatser, strukturera av både konjugat molekyl och protein vara konjugerade behöver studeras noggrant för att undvika intramolekylära reaktivitet. Som visat häri med bröstcancer inriktning peptid LXY3010, stabiliserar en kritisk disulfide bond cykliska ligand konformation. Gett thiol-Reaktiviteten hos maleimide, direkt maleimide-funktionalisering av LXY30 ligander kommer sannolikt att resultera i intramolekylära reaktivitet. Istället utfördes två steg konjugation (steg 4,2) genom att reagera på maleimide-länkade natriumazid med alkynen-länkade LXY30 genom klicka på kemi reaktion. Sekvensen av Klicka kemi reaktion och thiol-markerad reaktion är dock avgörande för den konfirmerande orördhet av de LXY30-HEVNPs (figur 4). Genom en CuSO4 katalyseras klick-kemi reaktion, var LXY30 indirekt skyldig att maleimide att bygga MaI-LXY30. Därefter konjugeras i MaI-LXY30 till HEVNP - 573C sådan att de bildade LXY30-HEVNPs kan behålla deras infödda ikosaedrisk struktur (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Författarna erkänner sponsring av finansieringen till RHC av NIH bevilja #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Institutet för livsmedel och jordbruk, samt programmet Finland Distinguished Professor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO Thermo Fisher Scientific 69572 mini dialysis unit
High Five Cells Thermo Fisher Scientific B85502 Tn5 cells
SF9 Cells  Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Thermo Fisher Scientific A11101, A11100 Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Bacmid
ESF921 Insect Cell Media Expression Systems LLC 96-001-01 insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg Lumiprobe Corp 27020 Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific 87766 spin desalting column
MES Hydrate Sigma-Aldrich Chemical Co M8250-250G MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman Coulter, Inc Depends on Rotor ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NPO321BOX SDS protein gel
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362100 transfection reagent
EMS Glow Discharger Electron Microscopy Science glow discharger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

Tags

Bioteknik fråga 135 cystein replacement kemiska konjugation hepatit E virusliknande partiklar multivalenta ligand inriktning ligand på display
Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli,… More

Chen, C. C., Stark, M., Baikoghli, M., Cheng, R. H. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (135), e57020, doi:10.3791/57020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter