Summary
この作業は、細菌とその対応するナノ粒子を介してナトリウム タングステン酸およびナトリウム モリブデン酸マイクロ カプセル製造のためのプロトコルを示します。
Abstract
手法、2 種類のマイクロ カプセル、タングステン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、2 つの金属酸化物の対応するナノ粒子を合成する細菌のミネラル排泄 (BME)-22 限り小さくされる旧 nm および後者 15 nm。我々 はタングステン酸、モリブデン酸のイオンの濃度細菌、シェワネラ藻類とPandoraea の sp、2 系統を供給しました。タングステン酸、モリブデン酸の濃度調整されたマイクロ カプセル長さ-直径比が異なる。分かったは高濃度より小さいナノ粒子だった。ナノ粒子で来ました 3 長さ-直径比: 10:1、3:1、1:1、高濃度、中濃度、低濃度と細菌をそれぞれ給餌によって達成されました。電子スキャン (SEM) 微小球を介して中空マイクロ カプセルの画像が撮影されました。結晶構造の x 線回折 (XRD) によって検証されました-ナ2MoO4であり、タングステン酸マイクロ カプセルの Na2WO4 Na2W2O7モリブデン酸マイクロ カプセルの結晶構造。すべてのこれらの合成に近い周囲条件下で達成されました。
Introduction
金属酸化物ナノ粒子は、薬品配信1建設人工骨2、異質触媒作用3、電界放出4、5、太陽電池6ガス センサー7、悪用されるとリチウム電池8。実用的なアプリケーションのナノ ・ ミクロ組織の強度が重要です。微細構造、間中空殻構造は軽量で機械的に堅牢な材料9を作成する使用できます。中空殻構造体の球状の形状は、楕円図形よりもより硬いように知られています。後者は、旧10,11より大きい長さ-直径比。この作品はテンプレート合成法12を含む、他の方法とは対照的、周囲条件下で非毒性による細菌を介して球状マイクロ カプセルの合成のためのプロトコルを説明します超音波スプレー アシスト合成法13水熱合成法14。いくつかの代替方法を必要とするテンプレート12、いくつかとして高温度 500 ° C13として、いくつか高圧14。結果として得られる構造酵母テンプレートを利用したテンプレート合成法がもたらす、コア ・ シェル構造15、単一の壁の代わりに、大腸菌のテンプレートを利用した 1 つの生成と構造長さ-直径比 1.7:0.8、球状ではないと。16。
この作品では細菌の代謝を利用して単一の壁と周囲条件下で球形の金属酸化物のマイクロ カプセルにしました。細菌解糖、ブドウ糖、乳糖のような炭素源を代謝化学プロセスの炭素源はそこに生成された還元力の起源と見なされます。我々 は必要な端を達成するために炭素源の濃度を調整することによって細菌の代謝を操作しました。このメソッドは、環境に優しい、無毒のエージェントを使用して、はるかに少ない電力を消費します。最後に、このメソッドでは、単にスープの量の増加によってマイクロ カプセルの大量生産ができます。
、メソッドの前に鉱物を作る細菌の代謝を利用した別の 2 つの方法があった: 生物鉱化作用 (BIM)17および生物学的制御鉱化作用 (BCM)18を誘導します。BIM も BCM は、細菌のミネラル排泄 (BME)19として指定されている私たちのプロセスのようなタングステン酸マイクロ カプセルをタングステンおよびモリブデン酸ナトリウムを作るため使用ことができます。長さ-直径比率を 10:1 から 1:1 を持っているこの実験では、マイクロ カプセルの形状を制御できます、ナノ粒子のサイズ粒 15 に至るシェルを調整ことができますフォーム 110 nm nm。
Protocol
注意: は、実験を実行するため、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用します。安全キャビネットを使用すると、いつでもキャビネットのファンをオンにしてキャビネットのドア半分閉じています。
1. ガラス製のビーズの作製
- 場所 100 研究室 100 mL ボトルに 3 mm 径のビーズをガラスし、し、しっかりとキャップします。
- オートクレーブ 120 ° C 10 分の内容。
- キャビネット、室温まで冷却し、バイオ セーフティにボトルをまま。
2. ホストゲノム スープ (LB) の準備
- 400 mL の水で 500 mL 実験室瓶に LB レノックス スープを 8 g 粉溶解します。
- PTFE の磁気撹拌棒、20 分間で内容をかき混ぜるし、しっかりとキャップします。
- オートクレーブ 120 ° C 10 分の内容。
- 部屋の温度に冷却して、バイオ セーフティにおけるソリューションのキャビネットを残します。
- (12.5 mL) バイオ セーフティ キャビネットにおける 8 つの 15 mL 遠心チューブに分注ピペットのスープを使用します。
- 因数 (100 mL)、バイオ セーフティ キャビネットの 3 つの研究所 100 mL ボトルに残りのスープ。3 つのボトルのキャップをしっかりと。キャビネット、バイオ セーフティにおけるそれらを保ちます。
3.シェワネラ藻類の文化
- 冷凍凍結保存株を使用します。
- キャビネットのバイオ セーフティにおけるステンレス鋼へらで、冷凍のチューブから冷凍物の 1 mL を選ぶし、3.5 準備した遠心管に入れます。
- 37 ° C のインキュベーターで 24 h の文化を孵化させなさい。
4. LB レノックス (寒天スープ) ペトリ皿の準備
- 100 mL の水で 100 mL 実験室瓶に LB レノックス (寒天スープ) の 2 つの錠剤を溶解します。
- 20 分の PTFE の磁気撹拌棒で内容をかき混ぜるし、しっかりとキャップします。
- オートクレーブ 120 ° C 10 分の内容。
- キャビネットのバイオ 4 ペトリ皿、それぞれを確実に 100 mL の溶液を手で因数は ~ 25 mL を受け取る。部屋の温度に冷却するソリューションを残します。
5. モノクローナル抗体菌の準備
- キャビネットのバイオでそれぞれ 2.6、#1, #2 と #3 の手順で作製した 3 つのボトルをラベルします。
- ステップ 3.3 ボトル #1 で結果の細菌懸濁液の 0.1 mL をピペットします。ボトル キャップ、同種のソリューションを入手する 1 分の手で回転させます。
- 5.2 ステップイン ボトル #2 の結果細菌液の 0.1 mL をピペットします。ボトル キャップ、同種のソリューションを入手する 1 分の手で回転させます。
- #3 のボトルにステップ 5.3 の結果細菌液の 0.1 mL をピペットします。ボトルのキャップし、同種のソリューションを入手する 1 分の手でそれを振る。
- 量 0.02 mL を使用して手順 4.4 で準備 4 ペトリ皿に #3 ボトルの液体をピペットします。
- 準備手順 1.3 4 ペトリ皿を使用する各皿に 4 のビーズにガラス玉を置きます。
- シャーレの蓋を閉じ、1 分の手でそれらを振る。
- ペトリ皿を裏返し、24 h の 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
6. モノクローナル抗体菌の増殖
- 7 チューブ ステップ 2.5 の準備を取得します。
- 4 ペトリ皿、ステンレス製ヘラと 5.8 の手順で準備から得られたモノクローナル抗体細菌を選ぶし、個別に 7 のチューブに入れてください。
- 24 h の 37 ° C の定温器で 7 の管を残します。
- 視覚比色法を用いた最大の光散乱との 1 つを選択します。
7. LB レノックス グルコースと塩スープの準備
- LB レノックス スープ 10 g, 塩化ナトリウム 10 g、ブドウ糖 10 g を入れて 500 mL 実験室瓶。ボリュームに達する 450 mL まで水を追加します。
- 20 分の PTFE の磁気撹拌棒で内容をかき混ぜます。
- オートクレーブ 120 ° C 10 分の内容。
8. タングステン酸ナトリウムの準備
- ステンレス製ヘラ 16.5 g ナトリウム タングステン酸 Na2WO4.2H2O 研究室 100 mL ボトルに入れて下さい。大きさが 50 mL に達するまで水を追加します。
- 20 分の PTFE の磁気撹拌棒で内容をかき混ぜます。
- オートクレーブ 120 ° C 10 分の内容。
- キャビネットのバイオで 1 μ m の細孔を持った真空ガラス繊維フィルターで濾液を得る。
9. グルコース、塩、タングステン酸ナトリウムと LB の準備
- キャビネットのバイオ セーフティにおけるグルコースと 7.3 準備した塩溶液に手で 8.4 のステップで得たろ液を注ぐ。
- バイオ セーフティ キャビネット、ピペット 10 x 50 mL 遠沈管に手順 9.1 で 500 mL の結果ソリューションを。
10. 細菌の文化
- キャビネットのバイオ セーフティにおけるそれとの準備ステップ 6.4 と割り切れるのピペット 0.05 mL を受け取る各管 9.2 の手順で準備 10 テスト チューブに液体をフェッチします。
- 120 h の 37 ° C の定温器で 10 のチューブを孵化させなさい。
11. BME 鉱物の収穫
- それぞれ 150 W 1 時間で 20 khz ステップ 9.2 10 管の ultrasonicate します。
- 1 h の 2,025 x g でチューブを遠心します。
- ピペットとチューブの明確な液体を除去、水を追加し、手順 11.1 11.2 1 つより多くの時間。
- ピペットとチューブの透明な液体を削除、アルコールを追加して、150 W 1 時間で 20 KHz でそれらを ultrasonicate します。
- 1 h の 2,025 x g でチューブを遠心します。
- 11.4 と 11.5 の手順をあと 1 回繰り返します
- ピペット; とチューブの透明な液体を削除することによって収穫イー ミネラルその後、すぐに任意の乾燥プロセスを実行することがなくチューブをキャップします。
12 Pandoraea の spとモリブデン酸振動温度
- 手順 2、3、4、5、および 6シェワネラ藻類と同様に文化Pandoraea の sp 。この手順の結果は、6.4 のステップのことに対応します。
- 手順 7.1 でタングステン酸ナトリウム 16.5 g、モリブデン酸ナトリウム Na2MoO4 · 12 g に置き換えられますことを除いて、手順 7、8、および 9 と同じように流体培養基 LB のグルコースと塩を作る2 H2o.この手順の結果は、9.2 のステップのことに対応します。
- キャビネットのバイオ セーフティにおけるフェッチで液体準備ステップ 12.1, と割り切れる 12.2 のステップそれぞれで準備 10 管にピペットでそれは受信 0.05 mL をチューブします。
- ステップ 12.3 振動温風呂、12 時間を持続させる各温度 25 ° C と 37 ° C の間に 5 回の温度の振動を振動相互 120 h で 10 のチューブを孵化させなさい。
Representative Results
本物の球形カプセルを図 1に示します。細菌、シェワネラ藻類とPandoraea spの両方の 2 つの系統。、もともと長さ-直径比 3:1 があります。長さ-直径比が 1:1、高濃度を達成するため (> 100 mM) 金属酸素酸イ オンが必要。低濃度 (< 5 mM) 酸素酸イ オンにつながる長さと直径の比として、10:1 の図 2で、酸素酸イ オン、細菌のバイナリ核分裂をブロックの流入から結果可能性があります。最後に、図 3にそのような長さ-直径比が 3:1 を達成するため酸素酸イ オン中濃度 (~ 20 mM) が必要です。長さ-直径比が 1:1 の部分球形殻の形成は、細胞膜を通して酸素酸イ オンを拡散しながら酸素酸イ オンの摂取量のバランスを取る彼らの表面積を縮小させる細菌のドライブによってもたらされる可能性があります。3 つの数字は一緒に長さ-直径比は、酸素酸イ オン濃度を調整することによって単に 10:1 から 1:1 に調整されるかもしれません。
図 4および図 5ナノ粒子モリブデン酸ナトリウム粒で表示サイズが異なる: 小さい 1 つが 15 nm、およびより大きい 1 つ 110 nm。図 5非粉砕シェル、110 nm が粒子にはまだ注意チェーン互いに多孔質殻を形成します。大きな 1 つは、12 時間を持続させる各温度 25 ° C と 37 ° C の間に 5 回培養液の温度の振動を得られました。温度振動の中に異なるサイズの粒だけ作り出すことができるないがまた 15 からの各種粒径のマイクロ カプセルを作ることができます意味マイクロ球状の構造を維持する 110 nm nm、スープの温度を制御するだけで.
図 6は、壁の開口部の横に大きい粒で壊れた壁を示しています。壁の厚さは約 22 nm と大きな粒は、約 40-60 nm。まだ識別されていない別の代謝過程からサイズの違いがあります。
図 1: 長さ-直径比が 1:1 の中空球殻の SEM 画像。この構造体は、タングステン酸ナトリウムと炭素源としてブドウ糖シェワネラ藻類による排泄のなされました。固体状態理工学雑誌 6 (3), N3113 (2017) ECS j. から許可を得て転載。著作権 2017 年電気化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 長さ-直径比が 10:1 の中空の長いフィラメント シェルの顕微鏡イメージ。この構造体は、モリブデン酸ナトリウムと炭素源としてブドウ糖Pandoraea spによって排泄しました。固体状態理工学雑誌 6 (3), N3113 (2017) ECS j. から許可を得て転載。著作権 2017 年電気化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 3:1 の長さ-直径比壊れた中空ロッド形シェルの SEM 像。この構造体は、タングステン酸ナトリウムと炭素源としてブドウ糖シェワネラ藻類による排泄のなされました。固体状態理工学雑誌 6 (3), N3113 (2017) ECS j. から許可を得て転載。著作権 2017 年電気化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 15 粒粒度の粉砕されたナトリウム モリブデン酸シェルの SEM 像 nm 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 110 の穀物の粒を粉砕し、粉々 になった非ナトリウム モリブデン酸殻の SEM 像 nm 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 長さ-直径比が 1:1 で壊れた中空シェルの顕微鏡イメージ。この構造体は、タングステン酸ナトリウムと炭素源としてブドウ糖シェワネラ藻類による排泄のなされました。顆粒のサイズ 40-60 nm の外側で掛からなければシェル隣に大きな穴サイズ約 22 粒のシェル自体は行われますが nm。固体状態理工学雑誌 6 (3), N3113 (2017) ECS j. から許可を得て転載。著作権 2017 年電気化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
実験結果の自己一貫性、に関する準備とモノクローナル抗体菌の増殖は重要です。実験の結果, 異なるテンプレート合成実験15,16、生理活性物質のグラム陰性菌を採用しました。単一の壁を取得するには、我々 は酵母15のような真核生物の細菌ではなく原核生物の細菌を選んだ。長さ-直径比が大きい長さ径比16ではなく、1:1 の球面形状を成し遂げるためには、私たちは供給細菌酸素酸イ オン濃度が高い球形の形に縮小する操作するマイクロ カプセルを作ってシングル、ラウンド、薄い壁 (< 30 nm)。
BME は、細菌の代謝を制御する酸素酸イ オン濃度を調整することで主に依存しているので、2 つの制限を備えています。まず、濃度をできるだけ高くする必要がありますが、酸素酸イ オン濃度は、溶解度によって制限されます。第二に、最も細菌の代謝は 45 ° C 以上の温度で停止または 5 ° C 以下、それぞれ上限と下限実験。
これらの 2 つの制限にもかかわらず、BME は、実用的な興味の金属酸化物材料を作るための大きな可能性を持っています。この主張を立証するために我々 は鉄マイクロ カプセルとジルコニウムのマイクロ カプセルにするこの方法を試してみるつもりです、人工骨の素材と薬物送達のための後者に良い候補者をされている元。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
番号最も 105-2221-E-011-008 を与えるこの作品に支えられて省、科学とテクノロジー、台湾、中華民国、下とも詳細 Connectek 株式会社によって契約の下で台北、台湾、中華民国数 RD Ref. 第 6749 と部 Ref. No. 011 を通じて、卒業電気光学エンジニア リング研究所、国立台湾大学の科学および技術。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB(Lennox)broth with agar tablets | Sigma-Aldrich | L7075 | 1 tablet for 50 mL broth with agar |
| LB (Lennox) broth | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | LB (Lennox) powder 1 kg |
| Dextrose anhydrous | Nihon Shiyaku Reagent | PL 78695 | glucose |
| Sodium Tungstate | Nihon Shiyaku Reagent | PL 76050 | Na2WO4 · 2H2O |
| Sodium Molybdate | Nihon Shiyaku Reagent | PL103564 | Na2MoO4 · 2H2O |
| Sodium Chloride | Nihon Shiyaku Reagent | PL 68131 | NaCl |
| Ethanol 99.5% | Acros organics | AC615090040 | CH3CH2OH |
| Water | Made in our university | de-ionlized water | |
| Autoclave | Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC | TM-329 | heat to 120 °C for 10 min |
| Centrifuge | Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC | DSC302SD | centrifuge at 2025 x g |
| -80 °C Refrigerator | Panasonic | MDF-U3386S | Use to deep-freeze cryopreserve strain |
| Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor | Lenox | UPS-150 | frequency 20 KHz power 150 W |
| Incubator | Customer made | custom made | heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol |
| Reciprocal shaking baths | Kingtech Scientific Co., Ltd | WBS-L | |
| Digital Stirring Hot Plate | Corning | #6797-620D | use with PTFE magnetic stirring bar |
| Biosafety cabinet | Zong Yen co., LTD | ZYBH-420 | All bacteria related process are done here |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-6500F | SEM Images |
| 50 mL centrifudge tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 15 mL centrifudge tube | Falcon | 14-959-53A | |
| Laboratory bottle 100 mL | Duran | 21 801 24 5 | |
| Laboratory bottle 500 mL | Duran | 21 801 44 5 | |
| Stainless steel spatula | Chemglass | CG-1981-10 | |
| PTFE Disposable Stir Bars | Fisher | S68066 | |
| Plastic Petri Dishes | Fisher | S33580A | |
| Shewanella algae | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 | |
| Pandoraea sp. | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 |
References
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