Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57024

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å vise hvordan celle photoconversion er oppnådd gjennom UV eksponering til bestemte områder uttrykke fluorescerende protein, Eos, i levende dyr.

Abstract

Dyre- og plantelivet vev består av forskjellige populasjoner av celler. Disse cellene samhandle over tid å bygge og vedlikeholde vevet og kan forårsake sykdom når forstyrret. Forskere har utviklet smart teknikker for å undersøke egenskapene og naturlig dynamikken i disse cellene i intakt vev ved å uttrykke fluorescerende proteiner i undergrupper av celler. Men til tider krever eksperimenter mer valgte visualisering av celler i vevet, noen ganger på én celle eller populasjon av celler måten. For å oppnå dette og visualisere enkeltceller i en populasjon av celler, har forskere benyttet encellede photoconversion fluorescerende proteiner. For å demonstrere denne teknikken, viser vi her hvor å direkte UV lys til en Eos-uttrykke celle interesse en intakt, lever sebrafisk. Vi deretter bildet photoconverted Eos+ cellene 24 timer senere for å finne ut hvordan de endret i vevet. Vi beskrive to teknikker: cellen photoconversion og photoconversions av befolkningen i cellen. Disse teknikkene kan brukes å visualisere celle-celle interaksjoner, celle-skjebne og differensiering og celle migrasjoner, gjør det en teknikk som brukes i mange biologiske spørsmål.

Introduction

Flere forskjellige celler samhandle for å bygge og vedlikeholde komplekse dyre- og plantelivet vev. Disse cellene er ofte under sommer og vanskelig å skille fra naboer på en enkelt cellenivå uten høy oppløsning mikroskopi som krever fiksering av vev. Men å forstå hvordan disse vev form, er vedlikeholdt, og blir syk, har det vært viktig å undersøke hvordan single celler i vevet bruker over tid. Ideelt krever disse eksperimentene merkingen av single celler innenfor en vev på en ikke-invasiv måte uten krav til fiksering. Forskere har nå utviklet mange teknikker for å oppnå dette oppgave1,2,3,4.

Oppdagelse og gjennomføring av maneter grønne fluorescerende protein (GFP) var en spennende tilnærming som tillatt for merking av forskjellige celler i en vev miljø1. Bruker celle-spesifikke arrangører, er det genetisk velge et delsett av celler som er merket1. Viral indusert uttrykk for GFP kan også benyttes for bruker-valgte uttrykk for GFP3,4. Selv om det er ganske nyttig, tillater genetisk mediert uttrykk for GFP ikke brukervalgt uttrykket i et delsett av celler i vevet; og viral uttrykk for GFP, men en fordel, kan invasiv. Med ankomsten av GFP derivater og smarte teknikker som Brainbow å uttrykke distinkte fluorescerende proteiner mer tynt i vev, har det blitt mulig å visualisere enkeltceller og samspill mellom dem i komplekse vev2, 5. men disse tilnærmingene merke celler i en tilfeldig måte. Hvis ønsket eksperimentet krever visualisering av en enkelt celle eller populasjon av celler som er definert av eksperimentator, er de derfor begrenset. Med slike eksperimenter, ville det være en fordel å ha en genetisk uttrykt fluorescerende protein som kan manipuleres til å skille, i en enkelt celle mote, det fra andre fluorescerende og ikke-fluorescerende celler.

For å oppnå dette målet og visualisere cellebiologi på enkeltceller i en kompleks levende vev, bruker det vitenskapelige samfunnet enkelt celle photoconversion av forskjellige fluorescerende proteiner6,7,8. Bruke genetisk kontrollert uttrykk for et photoconvertible protein (dvs., eos, kaede, etc.) som går fra en grønn til rød fluorescerende tilstand når de utsettes for UV (488 nm) lys, vi kan skille en enkelt celle fra dens fluorescently merket naboer6,7,8. Denne tilnærmingen benytter et apparat koblet til vår AC confocal mikroskop som kan direkte lys fra en laser stabel til et Diffraksjon-begrenset område av interesse. Med denne teknikken, kan vi enten merke enkeltceller eller større bestander i en brukerdefinert måte9,10,11. Teknikken er minimal invasiv sammenlignet enkeltcelle injeksjoner av viral GFP. Som et bevis på konseptet viser vi at vi kan photoconvert enkeltceller i en ganglion i perifere nervesystemet og photoconvert større bestander som celler plassert på ventral side av ryggmargen9,10, 11,12. Vi kan deretter visualisere disse photoconverted celle populasjoner 24 timer senere for å få innsikt i deres bevegelser og differensiering under utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av University of Notre Dame institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. forberedelse av sebrafisk

  1. Plass en voksen mann og en voksen kvinne vs (konvertible protein) i en paring kammer per standard prosedyrer13. I dette manuskriptet bruke Tg(sox10:eos) fisk9 på grunn av tilgang men andre transgene linjer med photoconvertible protein kan brukes likt. Definere flere kammer i tilfelle fisk ikke Legg. Tillat fisken å forbli i kammeret over natten.
  2. Neste morgen, samle egg i 100 mm Petri retter. Tillate egg modne til 24 timer etter befruktning (hpf) før screening.
  3. Hvis dyrene ovenfor var heterozygotes for transgene, filtrere skjermen 24 hpf retter for Tg(sox10:eos) + embryo 488 nm lyskilde og GFP sett på dissecting mikroskop. Isolere Tg(sox10:eos) + embryoer og tillate modne til 48 hpf.
  4. Dechorionate embryo manuelt med en nål eller pinsett.
  5. Forberede og mikrobølgeovn 5 mL 0,8% lav-smeltende punkt agarose løsning.
    1. Når agarose er kult å ta, plassere 3-4 bedøvet vs (sox10:eos) +48 hpf fisk i midten av en 10 mm glass-dekkglassvæske bunnen Petriskål.
    2. Legg nok agarose for å dekke overflaten av dekkglassvæske, ca 1 mL. Bruk en sonde nål ordne fisk på sine sider. Tillate agarose å størkne slik montering av dyr. Det kan være nødvendig å kontinuerlig re-arrangere sebrafisk før agar stivner14. Herding tar ca 2 minutter.
  6. Når agarose har styrket i 2 minutter, sakte Legg embryoet medium som inneholder 0.02% aminobenzoic syre ester (Tricaine) å rett til undersiden av agar og fatet er neddykket. Dette bør være ca 3mL.

2. mikroskop montering og pre-konvertering bildebehandling

  1. Åpne AC confocal programvare og Velg vinduene fange og fokusere [figur 1]. Velg innstillingen lab-spesifikke konvertering tenkelig under fangst setter rullegardinmenyen kategorien [figur 1] under vinduet fangst. Her, kalles lab-spesifikke innstillingen "fisk Imaging."
  2. Plasser prøven på AC confocal omfang og bringe i fokus med kurs og finjustering knotter.
  3. Åpne vinduet fokus og Finn ønsket område av interesse (i.e. dorsal root Ganglion).
  4. Velg c488 laser under filteret satt menyen. Angi eksponering 300 ms, laser makt til 5 og intensivere 75 [figur 2].
  5. Merk 3D capture type delen. I 3D Capture -delen velger du Bruk gjeldende posisjon og sjekk området rundt gjeldende. I samme avsnitt, angi til 35, antall fly 36, og steg størrelse til 1. Området kan økes eller reduseres for å imøtekomme for dørkarmdybden tenkelig området. For ryggmargen er en rekke verdi mellom 35-40 stabler vanligvis tilstrekkelig [figur 5].
  6. Velg gjeldende plassering [figur 5].
  7. Klikkstart nederst på opptaksvinduet å anskaffe bildet.

3. én celle Photoconversion

  1. Åpne AC confocal programvare og Velg vinduene fange og fokusere [figur 1]. Velg innstillingen lab-spesifikke konvertering tenkelig under fangst setter rullegardinmenyen kategorien [figur 1] under vinduet fangst. Her, kalles lab-spesifikke innstillingen "Fisk ablate full chip."
  2. Velg c488 og c541 laser under filteret satt menyen. Hvis ikke bruker samme mikroskop programvare, finner du på menyen for å velge forskjellige lasere og velg 488 nm og 541 nm lasere. Angi eksponeringene til 300 ms, laser makt til 5 og intensivere 75 [figur 2]. Disse laser innstillingene velges basert på produsere nok fluorescerende signal uten å forårsake photobleaching eller toksisitet. Hvis toksisitet eller photobleaching er visualisert, redusere laser makt eller eksponering.
  3. Åpne vinduet fokus og klikk kategorien photomanipulation i vinduet fokus. Laser parametere, justeres tilsvarende. Endre laser stabel makt til 2, og deretter . Endre blokkstørrelse Raster til 1 og klikke Bruk. Endre Dobbeltklikk størrelsen til 4. Endre laser linjen til v405 [Figur 3].
  4. Åpne avanserte Registreringsinnstillingene i opptaksvinduet. Velg kategorien photomanipulation og endre Dobbeltklikk gjentakelser til 2. Klikk OK [Figur 4].
  5. Velg kategorien XY i vinduet fokus. Dobbeltsjekk laser parameterne fra trinn 2 i kategorien photomanipulation [Figur 3, Figur 4]. Angi laser for photoconvert cellen rundt uten photoconversion av omkringliggende celler.
    1. Hvis photoconversion av tilstøtende celler, redusere laser makt. Hvis photoconversion av celler ikke oppstår, kan du øke laser krefter. Optimalt, angi laser makt photoconvert bare regionen interesse og ikke omkringliggende områder.
  6. Merk timelapse under fange type. Klikk Start [figur 6A].
  7. Når vinduet live timelapse åpnes, Velg sirkelverktøyet på den øverste verktøylinjen [figur 7]
  8. Tegne en sirkel i centermost regionen i cellen. Høyreklikk trukket sirkelen, velg FRAP regionog vente i 3 sekunder. Det merkede området bør bli svakere [Figur 8]. Klikk Stopp fange.
  9. Hvis imaging flere dyr, gå tilbake til kategorien XY i fokus-menyen og Velg plassering 2. Deretter gjentar du trinn 4.1-4.6.
  10. Slik konverterer en populasjon av celler, kan du følge protokollen og laser parameterne for trinnene 4.1-4,4 unntatt i stedet for å tegne en sirkel FRAP regionen rundt, bruker linjeverktøyet. Tegne en linje på området av interesse og FRAP regionen med de samme parameterne ovenfor.

4. innlegget-photoconversion Imaging

  1. Når alle punktene er photoconverted. Velg lab-spesifikke standardbilde stabelen sette beskrevet i precoversion imaging trinn 3. Dette finnes under erobringen angi rullgardin kategorien i vinduet fange [figur 5].
  2. Velg c488 laser og angi eksponering 300ms, laser makt til 5 og intensivere 75 [figur 2].
  3. Velg c541 laser funnet under den samme menyen som c488 laser. Angi eksponering 500 ms, laser strøm til 10 og intensivere 75 [figur 9].
  4. Merk 3D capture type delen. I 3D Capture -delen velger du Bruk gjeldende posisjon og sjekk området rundt gjeldende. I samme avsnitt, angi til 35, antall fly 36, og steg størrelse til 1. Hvor området kan økes eller reduseres for å imøtekomme ønsket tenkelig dybde [figur 5].
  5. Hvis det er flere punkter i kategorien XY fokus, Velg alternativet multipunkt liste i vinduet fangst. Hvis ikke, velger du gjeldende plassering.
  6. Klikkstart nederst på opptaksvinduet å anskaffe bildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Photoconversion av fluorescerende proteiner kan brukes til å merke atskilte celler innenfor en vev6. For å demonstrere dette, ble Tg(sox10:eos) fisk9 brukt til å uttrykke photoconvertible protein Eos under den regulatoriske sekvenser av sox10. Tg(sox10:eos) dyrene på 48 hpf ble først montert og deretter fotografert for å oppdage eventuelle ikke-spesifikk photoconversion som har oppstått. Eos uomvendte fluorescerende signal med liten Eos photoconverted fluorescerende signalet var visualisert (Figur 10). Dyrene var holdt i mørket for å sikre ikke-spesifikke photoconversion er minimal. Deretter ble områdene rundt utsatt for UV lys med AC confocal mikroskop-oppsett. For å bekrefte at enkeltceller var photoconverted som følge av UV-stråling, tok vi z-stabler av området spenner over regionen photoconverted. Samsvar med vellykket photoconversion, var det lite deteksjon av ikke-konvertert Eos utenfor regionen rundt og photoconverted Eos var tydelig tilstede i regionen rundt. De resulterende bildet viser en enkelt celle i en ganglion med etiketten definitivt fra sine naboer (Figur 10).

For å demonstrere nytten av denne photoconversion teknikken, ble en populasjon av celler også utsatt for UV-lyset. I dette paradigmet, pre-photoconversion bilder ble tatt og ingen FN-photoconverted Eos signal finnes. Deretter var på ventral side av ryggmargen utsatt for UV bruker en linje (Figur 11). For å bekrefte vellykket photoconversion, post-photoconversion bilder ble tatt og photoconverted Eos i ventrale ryggmargen cellene der linjen av interesse som vi trakk var visualisert (Figur 11). Non-photoconverted Eos signalet var synlig i alle andre områder. For å utvide denne teknikken tok vi identiske bilder 24 timer etter photoconversion. I disse bildene, ble photoconverted Eos+ celler sett spredt over hele regionen ryggmargen både rygg og ventrale steder (Figur 12). Disse dataene er i samsvar med hypotesen at ventrale spinal celler flyttet til dorsal steder som tidligere beskrevet10. Sammen disse to teknikker viser at photoconversion av Eos kan benyttes for å visualisere enkeltceller eller bestander av celler innenfor en vev region i en brukerdefinert mote. Dette har bidratt til en bedre forståelse av mobilnettet egenskaper som celle migrasjon, kommunikasjon og dynamikk.

Figure 1
Figur 1 : Fange og fokusere Windows. Skjermbilde av programvaren som viser plasseringen av fangst og fokus og lab bestemte "Fisk ablate full chip" miste ned kategorien. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : c488 Laser parametere. Skjermbilde av opptaksvinduet vise de spesifikke parameterne for c488 laser. Eksponering er 300 ms. Laser makt er 5. Intensivere er 75. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Photoconversion Laser parametere. Skjermbilde av kategorien photomanipulation i vinduet fokus disposisjon bestemt laser innstillingene nødvendig for photoconversion. Laserstack makt er 2. Dobbeltklikk størrelse er 4. Raster blokkstørrelsen er 1. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Avansert Photoconversion Laser parametere. Skjermbilde av avansert laser innstillingene i opptaksvinduet. Dette åpner vinduet fange innstillinger med kategorien photomanipulation. Dobbeltklikk repetisjoner satt til 2. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Pre-konvertering Imaging parametere. Skjermbilder av vinduene fokus og fange. Fremhever fange vinduet bestemte parametere kreves for pre-konvertering bildebehandling. Fange innstillingen er "Fisk Imaging." 3D-box kontrolleres under hvilken fange. Og 3D-opptaksinnstillingene angis som; Er 35, mange av flyene er 36, steg størrelse er 1 og forskyvning er -15. "Gjeldende posisjon" og "range rundt gjeldende" bokser, også valgt. Se røde bokser. Viser hvordan å velge ett eller flere punkter på opptaksvinduet (venstre) og velg enkeltpunkt i vinduet fokus (høyre). Se grønne boksene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Åpne vinduet Photoconversion. Skjermbilde viser hvilken timelapse fange velges i henhold til tidligere angitte parametere. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Definere Photoconversion. Skjermbilde viser plasseringen av sirkelverktøyet (øverst) og fange vinduet som vises (høyre). Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Én celle Photoconversion. Skjermbilde viser bruk av verktøyet sirkelen photoconversion og retten falle i staver rullegardinmenyen. "FRAP alle regioner" konverteringshandlingen ligger Høyreklikk rullegardinmenyen. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Post-Photoconversion c561Laser parametere. Skjermbilde av opptaksvinduet vise de spesifikke parameterne for c561 laser. Eksponering er 500 ms. Laser makt er 10. Intensivere er 75. Se røde bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 : Én celle Photoconversion. (A). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk på 48 hpf viser dorsal root Ganglion i perifere nervesystemet før photoconversion. Stiplet linje angir cirkaposisjon DRG ryggmargen oppføring. (B). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk på 48 hpf viser dorsal root Ganglion i perifere nervesystemet under photoconversion. Stiplet linje angir DRG ryggmargen oppføring. Gul sirkel angir konvertering nettsted og lys indikerer UV lyseksponering. (C). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk på 48 hpf viser dorsal root Ganglion i perifere nervesystemet innlegg-photoconversion. Stiplet linje angir DRG ryggmargen oppføring. CNS er en forkortelse for sentralnervesystemet PNS er en forkortelse for perifere nervesystemet (-vekselstrøm). Skala bar lik 10 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11 : Photoconversion prosedyre i en større ryggmargen region. (A). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk 48 hpf viser OPCs og dorsal root Ganglion i ventrale regionen i ryggmargen før photoconversion. Stiplet linje angir dorsal regionen i ryggmargen. (B). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk 48 hpf viser OPCs og dorsal root Ganglion i ventrale regionen i ryggmargen under photoconversion. Heltrukne gule streken viser merket område for photoconversion. Stiplet linje angir dorsal regionen i ryggmargen. (C). skjematisk og AC confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk 48 hpf viser OPCs og dorsal root Ganglion i ventrale regionen i ryggmargen etter photoconversion. Stiplede linjer viser dorsal regionen i ryggmargen. Skala bar lik 10 um.

Figure 12
Figur 12 : Cellular sporing og visualisering innlegget-photoconversion. (A). skjematisk av Tg(sox10:eos) sebrafisk ryggmargen 48 hpf viser OPCs og dorsal root Ganglion i ventrale regionen i ryggmargen etter photoconversion. Lyn angir UV lys konvertering. (B). AC Confocal z-anslag av Tg(sox10:eos) sebrafisk ryggmargen starter på 48 hpf viser OPCs og dorsal root Ganglion i ventrale regionen i ryggmargen etter photoconversion. Lyn angir UV lys konvertering. Skala bar lik 10 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I komplekse vev organisere forskjellige celletyper i bestemte domener. Nylig har teknikker vært benyttet i etiketten enkeltceller i disse store vev strukturer1,2,3. Her viser vi to teknikker som kan på samme måte brukes til å visualisere både enkeltcelle interaksjoner og celle befolkningen interaksjoner i komplekse vev. Fordelen med photoconversion teknikken er romlige kontrollen forskeren har tydelig merket en celle. Med et mikroskop som å eksponere mindre imaging områder i større tenkelig vinduet områder så lite som enkeltceller eller deler av enkeltceller kan merkes annerledes enn andre celler. Flere photoconvertible proteiner har blitt introdusert til samfunnet gjør dette til en mer utbredt teknikk7. Muligheten til å photoconvert proteiner i cellene, har forskere benyttet denne teknikken eller liknende tilnærminger undersøke celle migrasjon og celledifferensiering nevrale kretsanalyse.

Selv om programvaren og bestemt laser parametere er spesifikke for vår lab, viser denne artikkelen universell muligheten for å bruke photoconvertable protein Eos i atskillende enkeltceller i en ganglion. Dessverre, de fleste genetisk regulatoriske områder som kan brukes til å kjøre fluorescerende proteiner uttrykke mye innen Ganglion tidlig utviklingsmessige faser. Dette er sannsynligvis fordi disse cellene genereres fra samme stamfar bassenger og markører identifisere disse stamfar stater9. Det er derfor vanskelig å visualisere samhandling enkeltceller i de større Ganglion under disse tidligere utviklingsstadier. Tilnærminger vises her representerer en teknikk som kan merke individuelle celler innenfor en ganglion, og dermed kan brukes til å analysere vitenskapelige spørsmål om Ganglion utvikling.

Imidlertid er denne photoconversion teknikken ikke begrenset til studier av Ganglion utvikling. For eksempel i studier av regenerering, kan photoconversion av pre-skade benyttes for å bestemme hvordan bestemte celler innenfor en ganglion svare etter skade. Disse studiene kan bidra til å belyse stamfar som potensialet i bestemte celler i et ganglion. Tilsvarende kunne photoconversion av bestemte kreftceller og sporing av disse cellene over tid avsløre egenskapene for enkeltceller i komplekse svulster. Denne bruken av enkeltcelle photoconversion derfor utvider potensialet av teknikken å gjøre meningsfulle oppdagelser i biomedisinsk samfunnet.

Denne tilnærmingen kan også selektivt merke celler innenfor et område på ryggmargen. I utvikling migrere celler ofte fra forløper områder å produsere differensierte celler i eldre steder11,14. Langsiktig skjebne kartlegging med grobunn blitt effektivt benyttet for å analysere slike prosesser. Med grobunn teknikker er romlig oppløsning begrenset til genomisk regulatoriske regionene som kjører grobunn transkripsjon15. Med photoconversion, kan dette romlig oppløsning oppnås med angi tiden når photoconversion oppstår og tidsmessige oppløsning. Derfor for kortere sikt skjebne-kartlegging har denne photoconversion teknikken mange fordeler fremfor grobunn skjebne-kartlegging. I prøvene der UV lys kan lett oppnås, er som i en intakt mouse, denne photoconversion imidlertid usannsynlig å arbeide15. I tillegg merker grobunn skjebne-kartlegging permanent cellene slik at mer langsiktige skjebne kartlegging enn photoconversion som mister etiketten som den photoconverted versjonen av protein forsvinner og nye uomvendte protein som produseres av cellen. Likevel, avhengig av vitenskapelige spørsmålet, kan photoconversion være et nyttig verktøy for skjebne-kartlegging av celle populasjoner.

Men bare to eksempler på anvendelse av photoconversion tilbys, har mange studier vist effekt. Avhengig av romlige presisjon kreves, kan photoconversion utføres med tilgang til en UV lyskilde. Hvis ønsket er å merke én kan celler mer avanserte imaging som AC confocal eller to-fotonet mikroskopi være nødvendig. Likevel har muligheten til å velge begge romlige og tidsmessige området merket celleområde tydelig fra andre celler innenfor et intakt vev gjort UV-indusert photoconversion et kraftig teknikk å dissekere biologiske spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Bernard Kulemaka og medlemmer av det Smith for deres nyttige kommentarer og reagens veiledning, Sam Connell og Brent Redford av 3i for fielding tenkelig spørsmål og Deborah Bang, Karen Heed og Kay Stewart for sebrafisk omsorg. Dette arbeidet ble støttet av University of Notre Dame, Elizabeth og Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center for sebrafisk forskning ved University of Notre og sentrum av stamceller og regenerativ medisin ved University of Notre Dame. Alle dyrestudier ble gjort i samsvar med University of Notre Dame IACUC til Dr. Cody Smith.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish VWR 25384-302
Embryo medium Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose dot scientific inc 9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish Ted Pella Inc. 14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) Fluka analytical A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets 3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion 405 nm laser
Slidebook software 3i
Methylene blue Kordon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 133 sebrafisk photoconversion Eos AC confocal mikroskopi
Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Green, L., Smith, C. J. Single-cellMore

Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter