Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57024

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Abstract

רקמה חיה and הצומח מורכב של אוכלוסיות שונות של תאים. תאים אלה אינטראקציה לאורך זמן לבנות ולתחזק את הרקמה והוא יכול לגרום לטטנוס כאשר משובשות. מדענים פיתחו טכניקות חכם כדי לחקור את המאפיינים ואת הדינמיקה הטבעית של תאים אלה בתוך רקמת ללא פגע על ידי הבעת פלורסנט חלבונים בתוך קבוצות משנה של תאים. עם זאת, לעתים, ניסויים דורשים יותר שנבחר ויזואליזציה של תאים בתוך הרקמה, לפעמים על האופן תא בודד או אוכלוסייה-של-תאים. כדי להשיג זאת דמיינו תאים בודדים בתוך אוכלוסייה של תאים, נעזרו מדענים photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט. להפגין טכניקה זו, אנו מציגים כאן כיצד לכוון אור UV לתא Eos-הבעת התעניינות שלם, חי דג זברה. אנחנו מכן תמונה באותם תאים Eos+ photoconverted 24 שעות מאוחר יותר כדי לקבוע איך הם שינו ברקמה. אנו מתארים שתי שיטות: יחיד תא photoconversion ו- photoconversions של אוכלוסיות של התא. שיטות אלה ניתן להמחיש אינטראקציות תא-תא, תא-גורל בידול, ואת נדידת תאים, הפיכתה טכניקה הרלוונטיים בשאלות ביולוגיות רבות.

Introduction

תאים נפרדים מרובים אינטראקציה לבנות ולתחזק מורכבים רקמות. תאים אלה הם לעתים קרובות intercalated, שקשה להבדיל בין שכנים ברמה תא בודד ללא מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הדורשים קיבוע של רקמות. עם זאת, כדי להבין כיצד אלה הטופס רקמות, מתוחזק, ולהיות חולה, זה היה חיוני לחקור איך חד תאים בתוך הרקמה אינטראקציה לאורך זמן. באופן אידיאלי, ניסויים אלה דורשים תיוג של תאים בודדים בתוך רקמה בצורה לא פולשנית ללא הדרישה של קיבעון. כעת, מדענים פיתחו טכניקות רבות כדי להשלים את המשימות1,2,3,4.

לצורך גילוי והיישום של החלבון הניאון מדוזה ירוק (GFP) היה אחד גישה מרגש המותר עבור תיוג של תאים נפרדים ב- הסביבה הרקמה1. באמצעות תאים ספציפיים היזמים, זה אפשרי לבחירת גנטית בתאים המסומנות1. לחלופין, ביטוי מושרה ויראלי של GFP יכול להיות מנוצל עבור המשתמש שנבחר ביטוי של GFP3,4. למרות שימושי למדי, הגנטי בתיווך של GFP אינה מאפשרת המשתמש שנבחר הביטוי בתוך קבוצת משנה של תאים בתוך הרקמה; וניתן ביטוי נגיפי ה-GFP, למרות יתרון, פולשני. עם כניסתו של GFP נגזרים וטכניקות חכם כמו Brainbow לבטא חלבונים פלורסנט ברורים יותר בדלילות בתוך רקמות, זה הפך אפשר לדמיין תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם רקמות מורכבות2, 5. עם זאת, גישות אלה תווית תאים באופן אקראי. אם הניסוי הרצוי דורש ויזואליזציה של תא בודד או אוכלוסיית תאים אשר מוגדרת על ידי הנסיין, הם לכן מוגבל. עם ניסויים כאלה, זה יהיה יתרון יש חלבון פלואורסצנטי ביטוי גנטית אפשר לגרום להם להבחין, באופן תא בודד, זה של תאים אחרים פלורסנט, הלא-פלורסנט.

כדי להשיג מטרה זו, ולהמחיש את ביולוגיה של התא של תאים בודדים בתוך רקמת החיים מורכבים, הקהילה המדעית משתמש photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט ברורים-6,-7,-8. באמצעות גנטית מבוקר הביטוי של photoconvertible חלבון (קרי, eos, קאךה, וכו ') זה המעברים מ ירוקה למצב ניאון אדום כאשר הם נחשפים UV (488 ננומטר) אור, אנחנו. יכולים להבחין תא בודד מן שלה שכותרתו fluorescently השכנים6,7,8. גישה זו מנצל מכשירים המחוברים שלנו מיקרוסקופ קונפוקלי אשר יכולים לכוון את האור מאוסף לייזר לאזור מוגבל עקיפה של עניין. בטכניקה זו, אנו יכולים גם תווית תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות צורה על-ידי המשתמש9,10,11. הטכניקה היא פולשנית בהשוואה לתא בודד זריקות של נגיפי ה-GFP. מהווה הוכחה של המושג, אנחנו מראים שאנחנו יכולים photoconvert תאים בודדים בתוך גנגליון מערכת העצבים ההיקפית, photoconvert אוכלוסיות גדולות יותר כמו תאים ממוקם על הצד הבטני של חוט השדרה9,10, 11,12. אנחנו מכן יכול לדמיין photoconverted תא אוכלוסיות אלה 24 שעות מאוחר יותר כדי לזכות בתובנה שלהם התנועה ובידול במהלך הפיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת Notre Dame אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. הכנת דג זברה הדגימה

  1. מקום אחד גבר בוגר אחד למבוגרים נקבה Tg (חלבון להמרה) לתא ההזדווגות לפי נהלי13. כתב יד זה, להשתמש Tg(sox10:eos) דגים9 בגלל גישה אבל קווים הטרנסגניים אחרים עם חלבון photoconvertible יכול לשמש באותה מידה. הגדרת תא אחד או יותר למקרה דגים אל תרים. לאפשר את הדג להישאר בבית הבליעה למשך הלילה.
  2. למחרת בבוקר, לאסוף את הביצים בתוך צלחות פטרי 100 מ מ. לאפשר ביצים להבשיל עד 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לפני ההקרנה.
  3. אם חיות לעיל היו heterozygotes על transgene מסך 24 מנות hpf עבור Tg(sox10:eos) + העוברים עם 488 ננומטר מקור אור ואביזרים GFP לסנן סטים על מיקרוסקופ ויבתר. לבודד Tg(sox10:eos) + עוברי ולאפשר להבשיל ל-48 hpf.
  4. Dechorionate עוברי ידנית עם מחט או פינצטה.
  5. הכנה של מיקרוגל 5 מ של 0.8% פתרון agarose נקודת התכה נמוכה.
    1. לאחר agarose קרירות למגע, מקום 3-4 Tg anesthetized (sox10:eos) + 48 hpf דגים במרכז זכוכית 10 מ מ- coverslip בתחתית צלחת פטרי.
    2. הוסף agarose מספיק כדי לכסות את פני השטח של coverslip, כ 1 מ"ל. שימוש במחט בדיקה לסדר את הדג על הצדדים שלהם. לאפשר agarose לגבש כדי להבטיח הרכבה של בעלי חיים. יתכן צורך ללא הרף לארגן את דג זברה מחדש עד אגר עפור14. התמצקות לוקח כ 2 דקות.
  6. לאחר agarose התחזק למשך 2 דקות, להוסיף לאט העובר בינוני המכיל 0.02% חומצה aminobenzoic אסתר (Tricaine) לדרוש עד מהמשטח התחתון של אגר, מאכל שקוע. זה צריך להיות כ 3 מ.

2. מיקרוסקופ הרכבה והדמיה מראש המרה

  1. פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דגים הדמיה."
  2. במקום הדגימה על היקף קונאפוקלית ולהביא להתמקד באמצעות קורס וידיות התאמת משובח.
  3. פתח את החלון המוקד ואתר האזור הרצוי של הריבית (כלומר השורש העזוב הגרעינים).
  4. בחר את הלייזר c488 תחת תפריט להגדיר מסנן. הגדר את החשיפה 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].
  5. סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. הטווח שניתן עלה או ירד כדי לאכלס העומק של אזור ההדמיה. עבור חוט השדרה ערך בטווח בין 35-40 ערימות היא בדרך כלל מספיק [איור 5].
  6. בחר במיקום הנוכחי [איור 5].
  7. לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.

3. תא בודד Photoconversion

  1. פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דג ablate שבב מלא".
  2. בחר הלייזר c488 ו- c541 תחת תפריט להגדיר מסנן. אם אינך משתמש בתוכנה מיקרוסקופ זהה, למצוא תפריט כדי לבחור לייזרים שונים, בחר 488 ננומטר, לייזרים nm 541. הגדר את חשיפות 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2]. הגדרות אלה לייזר נבחרו על סמך הפקת מספיק אותות פלואורסצנט מבלי לגרום photobleaching או רעילות. אם רעילות או photobleaching הוא מדמיין, להפחית את עוצמת הלייזר או חשיפה.
  3. פתח את החלון המוקד ולחץ על הכרטיסיה photomanipulation בחלון המוקד. להתאים את הפרמטרים לייזר בהתאם. לשנות את עוצמת הלייזר מחסנית ל- 2 ולאחר מכן לחץ על ללכת. לשנות את גודל הבלוק רסטר 1 ולחץ על הגדר. לשנות את גודל פעמיים ל- 4. לשנות את קו לייזר v405 [איור 3].
  4. פתח את קביעות הלכידה מתקדמות בחלון הלכידה. בחר את הכרטיסיה photomanipulation ולשנות את מספר החזרות פעמיים 2. לחץ על אישור [איור 4].
  5. בחר את הכרטיסיה XY בחלון המוקד. בדוק את הפרמטרים לייזר משלב 2 בכרטיסיה ' photomanipulation ' [איור 3, איור 4]. קבע את הגדרות לייזר כדי photoconvert התא של הריבית בלי photoconversion של התאים שמסביב.
    1. אם photoconversion של תאים סמוכים, להפחית את עוצמת הלייזר. אם photoconversion של תאים לא התרחשה, כוחות לייזר יכול להיות מוגברת. בצורה אופטימלית, הגדר עוצמת הלייזר photoconvert רק האזור של עניין לא ובסביבותיו.
  6. סמן את התיבה timelapse תחת ללכוד את סוג. לאחר מכן, לחץ על התחל [איור 6A].
  7. לאחר פתיחת החלון timelapse בשידור חי, בחר בכלי עיגול בסרגל הכלים העליון [איור 7]
  8. לצייר עיגול באזור centermost של התא. קליק ימני המעגל מצוירות, בחר אזור FRAPוהמתן 3 שניות. האזור שנבחר צריך להיות דימר [איור 8]. לחץ על עצור לכידה.
  9. אם הדמיה חיה יותר מפעם אחת, לחזור אל הכרטיסיה XY המוקד תפריט, בחר במיקום 2. . אז, חזור על השלבים 4.1-4.6.
  10. כדי להמיר אוכלוסיה של תאים, בצע את הפרמטרים פרוטוקול ו לייזר עבור שלבים 4.1-4.4 למעט במקום לצייר עיגול FRAP האזור של הריבית, השתמש בכלי שורת. צייר קו על האזור של הריבית, FRAP האזור באמצעות אותם פרמטרים המפורטים לעיל.

4. פוסט-photoconversion הדמיה

  1. לאחר כל נקודות photoconverted. בחר הערימה תמונה רגילה מעבדה ספציפי הגדרת שמתואר precoversion הדמיה שלב 3. זה נמצא תחת התפיסה הגדרת הנפתחת tab בחלון לכידת [איור 5].
  2. בחר את הלייזר c488, להגדיר את החשיפה 300ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].
  3. בחר את הלייזר c541 נמצא תחת התפריט כמו הלייזר c488. הגדר את החשיפה 500 ms, לייזר כוח 10, ולהגדיל ל 75 [איור 9].
  4. סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. המספר טווח עשויה להגדיל או להקטין כדי להתאים את עומק ההדמיה הרצויה [איור 5].
  5. אם ישנן נקודות מרובות בכרטיסיה המוקד XY, בחר באפשרות רשימת רב-נקודתי בחלון הלכידה. אם לא, בחר במיקום הנוכחי.
  6. לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Photoconversion של חלבונים פלורסנט ניתן לסמן תאים נפרדים בתוך רקמת6. כדי להדגים את זה, Tg(sox10:eos) דגים9 שימשו כדי להביע את החלבון photoconvertible Eos תחת רצפי רגולטוריות sox10. החיות Tg(sox10:eos) של 48 hpf היה רכוב קודם ולאחר מכן עם תמונה כדי לזהות כל photoconversion שאינם ספציפיים שייתכן שהתרחשה. Eos אשר האות פלורסנט עם אות ניאון photoconverted Eos הקטן היה אז דמיינו (איור 10). חיות הוחזקו בחושך כדי לוודא שאינם ספציפיים photoconversion הוא מינימלי. לאחר מכן, האזורים עניין נחשפו לאור UV באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי את הסידור. כדי לוודא כי תאים בודדים היו photoconverted בעקבות החשיפה UV, לקחנו z-ערימות של האזור המתפרסות על-פני האזור photoconverted. בקנה אחד עם photoconversion מוצלח, היה גילוי הקטן של Eos ללא המרה מחוץ לאזור עניין, photoconverted Eos נכח מובהק בתוך האזור של ריבית. התמונה הנובעת מציגה תא בודד מתוך גנגליון הנקרא בהחלט מהשכנים שלה (איור 10).

כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו photoconversion, אוכלוסיה של התאים נחשפה גם לאור UV. פרדיגמה זו, pre-photoconversion התמונות צולמו, אין קליטה Eos האו ם-photoconverted היה נוכח. בשלב הבא, הצד הבטני של חוט השדרה נחשף UV באמצעות קו (איור 11). כדי לוודא photoconversion מוצלח, צולמו תמונות פוסט-photoconversion, photoconverted Eos בתאים הבטני של חוט השדרה במיקום של הקו של עניין אנחנו ציירה היו דמיינו (איור 11). Non-photoconverted Eos האות היה גלוי בתחומים אחרים. כדי להאריך את הטכניקה הזו אז לקחנו תמונות זהות 24 שעות לאחר photoconversion. בתמונות האלה, photoconverted Eos+ תאים נראו פזורים ברחבי אזור השדרה הגבי והן הגחון מיקומים (איור 12). נתונים אלה תואמים ההשערה כי תאים בעמוד השדרה הגחון למרילנד מיקומים הגבי כמו בעבר תיאר10. יחד שתי שיטות אלה מדגימים את photoconversion של Eos יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים בתוך אזור הרקמה בצורה על-ידי המשתמש. זה תרם להבנה טובה יותר של מאפייני הסלולר כגון נדידת תאים, תקשורת, ואת הדינמיקה.

Figure 1
איור 1 : ללכוד ולהתמקד Windows. צילום מסך של התוכנה המתארות מיקום חלונות לכידת ונוחות של מעבדה ספציפיות "דג ablate שבב מלא" הנפתח בכרטיסיה. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : פרמטרים לייזר c488- מסך של החלון לכידת מציג את הפרמטרים הספציפיים עבור לייזר c488. חשיפה היא גב' 300 עוצמת הלייזר הוא 5. להעצים הוא 75. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : פרמטרים לייזר Photoconversion- צילום מסך של הכרטיסיה photomanipulation בחלון מוקד חלוקה לרמות את הגדרות ספציפיות לייזר צורך photoconversion. הכוח Laserstack הוא 2. לחץ פעמיים על גודל הוא 4. גודל בלוק רסטר הוא 1. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : מתקדם פרמטרים לייזר Photoconversion- מסך ההגדרות לייזר מתקדמות בחלון הלכידה. זה נפתח החלון העדפות לכידת עם הלשונית photomanipulation. מספר החזרות פעמיים מוגדר ' 2. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : לפני ההמרה הדמיה פרמטרים. צילומי מסך של החלונות לכידת ומיקוד. מדגיש ספציפי לכידת חלון הפרמטרים הדרושים עבור הדמיה לפני ההמרה. הגדרת לכידה היא "הדמיה דגים". תיבת 3D נבדקת מתחת לסוג הלכידה. הגדרות לכידת תלת-ממד המצוינות; טווח הוא 35, המספר של מטוסים הוא 36, גודל שלב 1, היסט-15. תיבות "טווח בסביבה הנוכחית" ו "תפקיד נוכחי" גם נבחרים. ראה התיבות האדומות. מתאר כיצד לבחור נקודות בודדות או רבות על החלון הלכידה (משמאל) וכיצד לבחור נקודות בודדות על החלון המוקד (מימין). לראות את הקופסאות. הירוקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : פתיחת חלון Photoconversion. צילום מסך המתארות את סוג לכידת timelapse נבחרה לפי פרמטרים שהוגדרו קודם לכן. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : הגדרת את Photoconversion. מסך המציג את המיקום של הכלי עיגול (למעלה), חלון הפקד לכידת שמופיע (מימין). ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : תא בודד Photoconversion. צילום מסך המתארים את השימוש בכלי photoconversion עיגול, קליק ימני על ירידה למטה בתפריט. פעולת ההמרה "FRAP כל האיזורים" ממוקם בתוך התפריט הנפתח קליק ימני. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : פרמטרים פוסט-Photoconversion c561Laser. מסך של החלון לכידת מציג את הפרמטרים הספציפיים עבור לייזר c561. חשיפה היא גב' 500 עוצמת הלייזר הוא 10. להעצים הוא 75. ראה התיבות האדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : תא בודד Photoconversion. (א). זי סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) -48 hpf במערכת העצבים ההיקפית לפני photoconversion גרעיני הבסיס העזוב בסה כ מציג. קו מקווקו מציין המיקום המשוער של ערך חוט השדרה DRG. (ב)-z סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) -48 hpf במערכת העצבים ההיקפית במהלך photoconversion גרעיני הבסיס העזוב בסה כ מציג. קו מקווקו מציין ערך חוט השדרה DRG. עיגול צהוב מציין ההמרה באתר ומציין תאורה בולט חשיפה אור UV. (ג)-z סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) -גרעיני הבסיס העזוב בסה כ מציג hpf 48 בהפוסט-photoconversion מערכת העצבים ההיקפית. קו מקווקו מציין ערך חוט השדרה DRG. CNS הוא קיצור של מערכת העצבים המרכזית, מערכת העצבים ההיקפית הוא קיצור של מערכת העצבים ההיקפית (A-C). סרגל קנה מידה שווה 10 אום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 : Photoconversion שגרה באזור עמוד השדרה גדול יותר. (א). זי סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) OPCs מראה hpf 48, גרעיני הבסיס העזוב באזור הבטני של חוט השדרה לפני photoconversion. קו מקווקו מציין האזור הגבי של חוט השדרה. (ב)-z סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) OPCs מראה hpf 48, גרעיני הבסיס העזוב באזור הבטני של חוט השדרה במהלך photoconversion. קו צהוב מלא מציין האזור שנבחר עבור photoconversion. קו מקווקו מציין האזור הגבי של חוט השדרה. (ג)-z סכמטית, קונאפוקלית-תחזיות של דג זברה Tg(sox10:eos) OPCs מראה hpf 48, גרעיני הבסיס העזוב באזור הבטני של חוט השדרה לאחר photoconversion. קווים מקווקווים מציינים את האזור הגבי של חוט השדרה. סרגל קנה מידה שווה 10 אום.

Figure 12
איור 12 : סלולרי מעקב והדמיה פוסט-photoconversion. (א). סכמטי של חוט השדרה של דג זברה Tg(sox10:eos) OPCs מראה hpf 48, גרעיני הבסיס העזוב באזור הבטני של חוט השדרה לאחר photoconversion. ברק מציין המרת אור UV. (ב)-z-תחזיות קונאפוקלית של חוט השדרה של דג זברה Tg(sox10:eos) החל מ- 48 hpf מראה OPCs, גרעיני הבסיס העזוב באזור הבטני של חוט השדרה לאחר photoconversion. ברק מציין המרת אור UV. סרגל קנה מידה שווה 10 אום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ברקמות מורכבות, סוגי תאים נפרדים לארגן לתחומים ספציפיים. לאחרונה כבר מנוצל טכניקות תווית בתאים בודדים בתוך אלה רקמות גדולות מבנים1,2,3. כאן נדגים שתי טכניקות באופן דומה יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תא בודד אינטראקציות והן תא אינטראקציות האוכלוסייה בתוך רקמות מורכבות. היתרון של השיטה photoconversion הוא השליטה במרחב שהמדען יש לתייג במובהק תא. עם מיקרוסקופ בעל יכולת לחשוף קטן הדמיה אזורים בתוך חלון הדמיה גדול יותר, אזורים קטנה כפי תאים בודדים או אזורים של תאים בודדים יכולים להיות מסומנים באופן שונה מאשר תאים אחרים. חלבונים photoconvertible מרובים עכשיו שהוצגו בפני הקהילה שהופך את הטכניקה נפוצה יותר7. עם יכולת photoconvert חלבונים בתוך התאים, מדענים מסויימת זו טכניקה או גישות בדומה לחקור נדידת תאים, תאית התמיינות וניתוח מעגלים עצביים.

למרות התוכנה ואת לייזר ספציפיות פרמטרים ספציפיים למעבדה שלנו, מאמר זה מדגים את היכולת אוניברסלי לשימוש החלבון photoconvertable Eos להבחין בין תאים בודדים בתוך גנגליון. למרבה הצער, רוב רגולטוריות אזורים הגנטי יכול לשמש שתנהג חלבונים פלורסנט אקספרס נרחב בתוך הגרעינים מוקדם שלבים התפתחותיים. זה סביר כי תאים אלה נוצרות מתוך בריכות קדמון דומה ולזהות הסמנים האלו הברית קדמון9. לכן קשה להמחיש את האינטראקציות של תאים בודדים בתוך הגרעינים גדולים יותר אלה בשלבים התפתחותי מוקדם יותר. הגישות המוצגות כאן מייצג טכניקה אחת זה יכול תווית תאים בודדים בתוך גנגליון, ובכך יכול לשמש לנתח שאלות מדעיות על פיתוח גרעיני.

עם זאת, טכניקה זו photoconversion אינה מוגבלת מחקרים של פיתוח גרעיני. לדוגמה, מחקרים של התחדשות, photoconversion מהתנאים משלפני יכול להיות מנוצל כדי לקבוע כיצד תאים ספציפיים בתוך תגובה גנגליון בעקבות פגיעה. מחקרים אלה יכולים לעזור להבהיר את הפוטנציאל קדמון, כמו של תאים ספציפיים גנגליון. באופן דומה, photoconversion של תאים סרטניים ספציפי ומעקב של תאים אלה לאורך זמן יכול לחשוף המאפיינים של תאים בודדים בתוך גידולים מורכבים. יישום זה של תא בודד photoconversion ולכן מרחיב את הפוטנציאל של הטכניקה תגליות משמעותיות בקהילה הביו-רפואית.

גישה זו יכולה גם באופן סלקטיבי תווית תאים בתוך אזור של חוט השדרה. בפיתוח, תאים נודדים לעתים קרובות מאזורים קודמן לייצר תאים בוגרים מיקומים11,14. מיפוי גורל לטווח ארוך עם Cre ביעילות נעזרו לנתח תהליכים כאלה. עם טכניקות Cre, רזולוציה מרחבית מוגבל לאזורים רגולטוריות גנומית לנהוג Cre שעתוק15. עם photoconversion, רזולוציה מרחבית זו יכולה להיות מושגת יחד עם היכולת לבחור את הזמן כאשר מתרחש photoconversion הפתרון הזמני. לכן, עבור הגורל לטווח קצר יותר-מיפוי, טכניקה זו photoconversion יש יתרונות רבים על פני Cre הגורל-מיפוי. עם זאת, בדגימות איפה אור UV לא ניתן בקלות להשיג, כמו עכבר ללא פגע, גישה photoconversion זו סביר לעבוד15. בנוסף, גורל Cre-מיפוי מתייגת לצמיתות תאים ומאפשר למיפוי גורל לטווח ארוך יותר מאשר photoconversion המאבד התווית שלו וגם הגרסה photoconverted של החלבון כלתה חלבון חדש אשר מופק על ידי התא. למרות זאת, בהתאם השאלה המדעית, photoconversion יכול להיות כלי שימושי עבור הגורל-מיפוי אוכלוסיות תאים.

אמנם רק שתי דוגמאות של היישום של photoconversion הינם מסופקים, מחקרים רבים הוכיחו את יעילותה. בהתאם המרחבי הדיוק הנדרש, photoconversion ניתן לבצע גישה אל מקור אור UV. אם הרצון לתייג יחיד תאים מתקדמים יותר הדמיה כמו מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים ייתכן שיהיה צורך. בכל זאת, היכולת לבחור שני אזור המרחבי הטמפורלי של תאים עם תוויות במובהק של תאים אחרים בתוך רקמת ללא פגע הפך photoconversion UV-induced טכניקה חזקה לנתח השאלות הביולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ברנרד Kulemaka וחברי המעבדה סמית שלהם הערות מועילות והדרכה ריאגנט, סאם קונל, ברנט רדפורד של 3עכשיו עבור פילדינג הדמיה שאלות, דבורה באנג, קארן הקשבה, קיי סטיוארט לטיפול דג זברה. עבודה זו נתמך על ידי את אוניברסיטת נוטרה דאם, האליזבת, מייקל משפחה, אלפרד פ סלואן קרן, מרכז מחקר דג זברה אוניברסיטת נוטרה, מרכז של תאי גזע, רפואה רגנרטיבית-אוניברסיטת נוטרה דאם. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל נעשו בהתאם אוניברסיטת נוטרה דאם IACUC ד ר קודי סמית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish VWR 25384-302
Embryo medium Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose dot scientific inc 9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish Ted Pella Inc. 14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) Fluka analytical A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets 3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion 405 nm laser
Slidebook software 3i
Methylene blue Kordon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 133 דג זברה photoconversion אאוס מיקרוסקופיה קונפוקלית
Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Green, L., Smith, C. J. Single-cellMore

Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter