Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57024

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att visa hur cellen photoconversion uppnås genom UV exponering för specifika områden som uttrycker det fluorescerande proteinet, Eos, i levande djur.

Abstract

Djur- och växtarter vävnad består av distinkta populationer av celler. Dessa celler interagerar med tiden att bygga och underhålla vävnaden och kan orsaka sjukdom när störs. Forskare har utvecklat smarta tekniker för att undersöka egenskaper och naturliga dynamiken i dessa celler inom intakt vävnad genom att uttrycka fluorescerande proteiner grupper av celler. Men ibland kräver experiment mer valda visualiseringen av celler i vävnaden, ibland på sätt som encelliga eller befolkningen-i-celler. För att uppnå detta och visualisera enstaka celler inom en population av celler, har forskare utnyttjat encelliga photoconversion av fluorescerande proteiner. För att demonstrera denna teknik, visar vi här hur man direkt UV-ljus till en Eos-uttryckande cell av intresse i en intakt, living zebrafiskar. Vi bild då de photoconverted Eos+ cellerna 24 h senare för att avgöra hur de förändrats i vävnaden. Vi beskriva två teknikerna: enda cell photoconversion och photoconversions av populationer av cellen. Dessa tekniker kan användas för att visualisera cell-cell interaktioner, cell-öde och differentiering och cell migration, vilket gör det en teknik som är tillämpliga i många biologiska frågor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flera distinkta celler samverkar för att bygga och underhålla komplexa djur- och växtarter vävnader. Dessa celler är ofta ortodoxas och svår att skilja från grannar på en enda cellnivå utan hög upplösning mikroskopi som kräver fixering av vävnad. För att förstå hur dessa vävnader bildar, är underhålls och blir sjuka, har det dock varit nödvändigt att undersöka hur enstaka celler i vävnaden interagerar över tid. Helst kräver dessa experiment märkning av enstaka celler i en vävnad på ett icke-invasivt sätt utan krav på fixering. Forskare har nu utvecklat ett flertal tekniker för att utföra denna uppgift1,2,3,4.

Upptäckten och genomförandet av maneter grönt fluorescerande protein (GFP) var en spännande metod som tillåtna för märkning av olika celler i en vävnad miljö1. Med cell-specifika initiativtagare, är det möjligt att genetiskt välja en delmängd av celler som är märkt1. Alternativt, viral inducerad uttryck för god Jordbrukarsed kan utnyttjas för användarvalda uttryck för god Jordbrukarsed3,4. Även om det är ganska användbart, tillåter genetiska medierade uttryck för god Jordbrukarsed inte användare utvalda uttryck inom en delmängd av celler i vävnaden; och virala uttryck för GFP, även om det är fördelaktigt, kan vara invasiva. Med tillkomsten av GFP derivat och smarta tekniker som Brainbow att uttrycka distinkta fluorescerande proteiner mer glest inom vävnader, har det blivit möjligt att visualisera enstaka celler och interaktioner bland dem i komplexa vävnad2, 5. dock dessa metoder etikett celler på ett slumpmässigt sätt. Om önskad experimentet kräver visualisering av en enstaka cell eller population av celler som definieras av experimenter, är de därför begränsade. Med sådana experiment, skulle det vara fördelaktigt med en genetiskt uttryckt fluorescerande protein som kan manipuleras för att skilja, i en enda cell mode, det från andra lysrör och icke-fluorescerande celler.

För att uppnå detta mål och visualisera cellbiologi enstaka celler inom en komplex levande vävnad, använder det vetenskapliga samfundet enstaka cell photoconversion av distinkta fluorescerande proteiner6,7,8. Med genetiskt kontrollerade uttryck för ett photoconvertible protein (dvs, eos, kaede, etc.) som övergår från en grön till röd fluorescerande tillstånd när den utsätts för UV (488 nm) ljus, vi kan urskilja en enda cell från dess fluorescently märkt grannar6,7,8. Denna strategi använder tredjeparts en apparat kopplad till vår confocal Mikroskop som kan direkt ljus från en laser stack till en diffraktion begränsad region av intresse. Med den här tekniken kan vi antingen märka enskilda celler eller större populationer i ett användardefinierat sätt9,10,11. Tekniken är minimalt invasiva jämfört enda cell injektioner av viral GFP. Som ett proof of concept visar vi att vi kan photoconvert enstaka celler inom en ganglion i perifera nervsystemet och photoconvert större populationer som celler ligger på ventrala sida av ryggmärgen9,10, 11,12. Sedan kan vi visualisera dessa photoconverted cellpopulationer 24 h senare för att få inblick i deras rörelse och differentiering under utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurstudier godkändes av University of Notre Dame institutionella djur vård och användning kommittén.

1. beredning av zebrafisk exemplar

  1. Placera en vuxen hane och en vuxen kvinnlig Tg (konvertibla protein) i en parning kammare per standardförfaranden13. I detta manuskript, använda Tg(sox10:eos) fisk9 på grund av tillgång men andra transgena linjerna med photoconvertible protein kan användas lika. Ställa in mer än en kammare om fisk inte Lägg. Låt fisken att stanna kvar i kammaren över natten.
  2. Nästa morgon, samla ägg i 100 mm petriskålar. Låt äggen att mogna till 24 h efter befruktning (hpf) innan screening.
  3. Om djuren ovan heterozygoter för transgenens, filtrera skärm 24 hpf rätter för Tg(sox10:eos) + embryon med en 488 nm ljuskälla och god Jordbrukarsed uppsättningar på dissekera Mikroskop. Isolera Tg(sox10:eos) + embryon och tillåta för att mogna till 48 hpf.
  4. Dechorionate embryon manuellt med en nål eller pincett.
  5. Förbereda och mikrovågsugn 5 mL 0,8% låg-smältande punkt agaros lösning.
    1. När agaros är sval när du rör, placera 3-4 sövda Tg (sox10:eos) + 48 hpf fisk i mitten av en 10 mm-täckglas botten petriskål.
    2. Lägg tillräckligt agarosgelelektrofores för att täcka ytan av täckglaset, ungefär 1 mL. Använd en sond nål för att ordna fisk på sina sidor. Tillåta agaros stelna för att säkerställa montering av djur. Det kan vara nödvändigt att löpande arrangera zebrafiskar tills agar stelnar14. Stelningen tar ungefär 2 min.
  6. Efter agarosen stelnat i 2 min, Tillsätt långsamt embryo medium som innehåller 0,02% paraaminobenzoic-syra ester (Tricaine) att skålen tills bottenyta av agar och skålen är nedsänkt. Detta bör vara ca 3mL.

2. mikroskopet montering och före konvertering Imaging

  1. Öppna confocal programvara och välj Fönstren avbilda och fokus [bild 1]. Välj lab-specifika konvertering imaging inställningen under fånga inställning nedrullningsbara fliken [bild 1] under fönstret capture. Här, kallas lab-specifika inställningen ”fisk Imaging”.
  2. Placera preparatet på confocal omfattning och sätta i fokus med hjälp av kursen och fina justeringsreglagen.
  3. Öppna fokusfönstret och leta upp önskad region av intresse (dvs. dorsalrotsganglier).
  4. Välj c488 laser under menyn Filter Set. Ställa in exponering till 300 ms, laser power till 5 och intensifiera till 75 [figur 2].
  5. Markera rutan 3D under avsnittet fånga typ . I avsnittet 3D Capture , Välj Använd aktuell position och kolla spänna runt strömmen. I samma avsnitt, ange intervallet till 35, antalet flygplan till 36 och stegstorlek till 1. Intervallet kan ökas eller minskas för att rymma för djupet av området imaging. För ryggmärgen är ett intervallvärde mellan 35-40 stackar vanligtvis tillräcklig [figur 5].
  6. Välj nuvarande plats [figur 5].
  7. Klicka på start längst ned i fönstret capture att förvärva bilden.

3. single-cell Photoconversion

  1. Öppna confocal programvara och välj Fönstren avbilda och fokus [bild 1]. Välj lab-specifika konvertering imaging inställningen under fånga inställning nedrullningsbara fliken [bild 1] under fönstret capture. Här, kallas lab-specifika inställningen ”fisk ablatera full chip”.
  2. Välj c488 och c541 laser under menyn Filter Set. Om du inte använder samma Mikroskop mjukvaran, hitta menyn för att välja olika lasrar och välj 488 nm och 541 nm lasrar. Ställa in exponeringen för 300 ms, laser power till 5 och intensifiera till 75 [figur 2]. Dessa laser inställningar väljs utifrån producerar tillräckligt fluorescerande signalen utan att orsaka fotoblekning eller toxicitet. Om toxicitet eller fotoblekning visualiseras, minska lasereffekt eller exponering.
  3. Öppna fokusfönstret och klicka på fliken photomanipulation i fokusfönstret. Justera laser parametrar. Ändra laser stack kraften till 2 och klicka sedan på . Ändra Raster blockstorlek till 1 och klicka på Ange. Ändra genom att dubbelklicka på storlek till 4. Ändra laserlinjen till v405 [bild 3].
  4. Öppna avancerade fångstinställningarna i insamlingsfönstret. Välj fliken photomanipulation och ändra dubbelklicka upprepningarna till 2. Klicka på OK [figur 4].
  5. Välj fliken XY i fokusfönstret. Dubbelkolla laser parametrarna från steg 2 i fliken photomanipulation [bild 3, bild 4]. Ange inställningarna för laser till photoconvert cellen av intresse utan photoconversion av omgivande celler.
    1. Om photoconversion av angränsande celler är närvarande, minska lasereffekt. Om photoconversion av celler inte uppstår, kan laser befogenheter ökas. Optimalt, ange lasereffekt photoconvert endast regionen av intresse och inte omgivande områden.
  6. Markera rutan timelapse under fånga typ. Klicka på Starta [figur 6A].
  7. När fönstret live timelapse öppnas, Välj cirkelverktyget i det översta verktygsfältet [figur 7]
  8. Rita en cirkel i regionen Center i cellen. Högerklicka på den ritade cirkeln, Välj FRAP regionoch vänta 3 sekunder. Det markerade området bör bli dimmer [figur 8]. Klicka på stoppa capture.
  9. Om imaging mer än ett djur, gå tillbaka till fliken XY i fokus-menyn och välj position 2. Upprepa sedan steg 4.1-4.6.
  10. För att konvertera en population av celler, följ protokollet och laser parametrarna för steg 4.1-4.4 utom i stället för att rita en cirkel att FRAP regionen av intresse, använda linjeverktyget. Rita en linje på regionen av intresse och FRAP regionen med samma parametrar som anges ovan.

4. post-photoconversion Imaging

  1. När alla punkter är photoconverted. Välj den standard bildstapel från lab-specifika inställning beskrivs i den precoversion imaging steg 3. Detta finns under fånga ställa in nedrullningsbara flik i fönstret capture [figur 5].
  2. Välj c488 laser och ställa in exponering till 300 MS, laser power till 5 och intensifiera till 75 [figur 2].
  3. Välj c541 laser finns under samma meny som c488 laser. Ställa in exponering till 500 ms, laser power till 10, och intensifiera till 75 [figur 9].
  4. Markera rutan 3D under avsnittet fånga typ . I avsnittet 3D Capture , Välj Använd aktuell position och kolla spänna runt strömmen. I samma avsnitt, ange intervallet till 35, antalet flygplan till 36 och stegstorlek till 1. Antalet intervall kan öka eller minska för att rymma det önskade imaging djupet [figur 5].
  5. Om det finns flera punkter i XY fokus fliken, Välj alternativet multipoint lista i insamlingsfönstret. Om inte, Välj aktuell plats.
  6. Klicka på start längst ned i fönstret capture att förvärva bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Photoconversion av fluorescerande proteiner kan användas för att märka olika celler i en vävnad6. För att demonstrera detta, var Tg(sox10:eos) fisk9 används för att uttrycka det photoconvertible proteinet Eos under de reglerande sekvenserna av sox10. Tg(sox10:eos) djuren på 48 hpf var först monterad, och sedan avbildas för att upptäcka eventuella icke-specifik photoconversion som kan ha inträffat. Eos oomvända fluorescerande signal med lite Eos photoconverted fluorescerande signal då var visualiserat (figur 10). Djuren hölls i mörkret att säkerställa icke-specifik photoconversion är minimal. Sedan utsattes regionerna av intresse för UV-ljus med hjälp av confocal Mikroskop set-up. För att bekräfta att enstaka celler var photoconverted till följd av den UV-exponeringen, tog vi z-högar av området spänner över regionen photoconverted. Konsekvent med framgångsrika photoconversion, fanns lite upptäckt av icke-konverterade Eos utanför regionen av intresse och photoconverted Eos var påtagligt närvarande i regionen av intresse. Den resulterande bilden visar en enstaka cell inom ett ganglion som heter definitivt från sina grannar (figur 10).

För att påvisa nyttan av denna photoconversion teknik, utsattes en population av celler också för UV-ljus. I detta paradigm, pre-photoconversion bilder togs och ingen un-photoconverted Eos signal var närvarande. Nästa, den ventral sidan av ryggmärgen blev utsatt för UV med hjälp av en linje (figur 11). För att bekräfta lyckade photoconversion, post-photoconversion bilder togs och photoconverted Eos i ventrala ryggmärgen celler på plats av intresse som vi drog linjen var visualiserat (figur 11). Icke-photoconverted Eos signal var synlig inom alla andra områden. För att förlänga denna teknik tog vi sedan identiska bilder 24 timmar efter photoconversion. I dessa bilder sågs photoconverted Eos+ celler utspridda över regionen ryggmärgen i både rygg- och ventrala platser (figur 12). Dessa uppgifter stämmer överens med hypotesen att ventrala spinal celler omlokaliseras till dorsala platser som tidigare beskrivs10. Tillsammans dessa två tekniker visar att photoconversion av Eos kan utnyttjas för att visualisera enstaka celler eller populationer av celler i en vävnad region i en användardefinierad mode. Detta har bidragit till en bättre förståelse av cellulära egenskaper såsom cellmigration, kommunikation och dynamics.

Figure 1
Figur 1 : Fånga och fokusera Windows. Skärmdump av programvaran som skildrar läge av avskiljning och fokus windows och lab specifika ”fisk ablatera full chip” droppa ned fliken. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : c488 Laser parametrar. Skärmdump av insamlingsfönstret visar specifika parametrarna för c488 laser. Exponering är 300 ms. Laser power är 5. Intensifiera är 75. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Photoconversion Laser parametrar. Skärmdump av fliken photomanipulation i fokusfönstret beskriver de specifika laser inställningarna behövs för photoconversion. Laserstack makt är 2. Dubbelklicka på storlek är 4. Raster blockstorleken är 1. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Avancerad Photoconversion Laser parametrar. Skärmdump av avancerade laser inställningarna i insamlingsfönstret. Detta öppnar fönstret capture inställningar med fliken photomanipulation. Dubbelklicka på upprepningarna är inställd på 2. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Före konvertering Imaging parametrar. Skärmdumpar av Fönstren fokus och fånga. Belyser fånga fönster specifika parametrar som behövs för före konvertering avbildning. Inställningen för capture är ”fisk Imaging”. 3D rutan är markerad under fånga typen. Och 3D fotograferingsinställningarna anges som; Utbudet är 35, antal av flygplan är 36, stegstorlek är 1 och Offset är -15. ”Nuvarande position” och ”range runt nuvarande” lådor är också markerade. Se röda rutor. Skildrar hur att välja en eller flera punkter på fönstret capture (vänster) och välj enskilda punkter på fokusfönstret (höger). Se gröna rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Öppna fönstret Photoconversion. Skärmbild som skildrar timelapse fånga typen väljs i enlighet med tidigare inställda parametrar. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Ställer in Photoconversion. Skärmdumpen visar platsen för cirkelverktyget (överst) och kontroll insamlingsfönstret som visas (till höger). Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Single-Cell Photoconversion. Skärmbild som skildrar användning av photoconversion cirkelverktyget och högerklick nedrullningsbara menyn. Åtgärden ”FRAP alla regioner” konvertering ligger inom högerklick rullgardinsmenyn. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Parametrar för post-Photoconversion c561Laser. Skärmdump av insamlingsfönstret visar specifika parametrarna för c561 laser. Exponering är 500 ms Laser power är 10. Intensifiera är 75. Se röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 : Single-cell Photoconversion. (A). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar dorsalrotsganglier i det perifera nervsystemet innan photoconversion. Streckad linje anger ungefärliga plats DRG ryggmärgen inträde... (B). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar dorsalrotsganglier i det perifera nervsystemet under photoconversion. Streckad linje anger DRG ryggmärgen post. Gul cirkel anger konvertering webbplats och belysning bolt anger UV-ljus exponering. (C). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar dorsalrotsganglier i det perifera nervsystemet post-photoconversion. Streckad linje anger DRG ryggmärgen post. CNS är en förkortning för CNS och PNS är en förkortning av perifera nervsystemet (A-C). Skalstapeln motsvarar 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11 : Photoconversion förfarande i en större region i ryggmärgen. (A). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar OPCs och dorsala rotganglier i regionen ventrala i ryggmärgen innan photoconversion. Streckad linje anger dorsala regionen av ryggmärgen. (B). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar OPCs och dorsala rotganglier i regionen ventrala i ryggmärgen under photoconversion. Heldragen gul linje visar valda område för photoconversion. Streckad linje anger dorsala regionen av ryggmärgen. (C). Schematisk och confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar på 48 hpf visar OPCs och dorsala rotganglier i regionen ventrala i ryggmärgen efter photoconversion. Streckade visar linjer dorsala regionen av ryggmärgen. Skalstapeln motsvarar 10 um.

Figure 12
Figur 12 : Cellulär spårning och visualisering post-photoconversion. (A). Schematisk av Tg(sox10:eos) zebrafiskar ryggmärgen på 48 hpf visar OPCs och dorsala rotganglier i regionen ventrala i ryggmärgen efter photoconversion. Blixten visar UV ljus konvertering. (B). Confocal z-projektionerna av Tg(sox10:eos) zebrafiskar ryggmärgen börjar på 48 hpf visar OPCs och dorsala rotganglier i regionen ventrala i ryggmärgen efter photoconversion. Blixten visar UV ljus konvertering. Skalstapeln motsvarar 10 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I komplexa vävnader ordna olika cell-typer i specifika domäner. Tekniker har nyligen använts till etikett enskilda celler inom dessa stora vävnad strukturer1,2,3. Här visar vi två tekniker som på samma sätt kan utnyttjas för att visualisera både enstaka cell interaktioner och cell befolkningen interaktioner inom komplexa vävnader. Fördelen med den photoconversion tekniken är den rumsliga kontrollen som forskaren har att tydligt märka en cell. Med ett mikroskop som har förmågan att exponera mindre imaging områden inom fönstret större imaging områden så litet som enstaka celler eller områden av enstaka celler kan vara märkt annorlunda än andra celler. Flera photoconvertible proteiner har nu införts till gemenskapen vilket gör detta till en mer utbredd teknik7. Med möjligheten att photoconvert proteiner i celler, har forskare utnyttjat denna teknik eller liknande metoder undersöka cellmigration, celldifferentiering och neural Kretsanalys.

Även om programvaran och specifika laser parametrar är specifika till vårt labb, visar denna artikel universal förmåga att använda proteinet photoconvertable Eos urskilja enstaka celler inom en ganglion. Tyvärr, de flesta genetiska regulatoriska regioner som kan användas för att köra fluorescerande proteiner express allmänt inom ganglier i tidiga utvecklingsfaser. Detta är sannolikt eftersom dessa celler genereras från liknande stamceller pooler och markörerna identifiera de perifera stater9. Det är därför svårt att visualisera samspelet mellan enstaka celler inom de största ganglierna under dessa tidigare utvecklingsstadier. De metoder som visas här representerar en teknik som kan märka enskilda celler inom en ganglion och således skulle kunna användas att dissekera vetenskapliga frågor om ganglia utveckling.

Denna photoconversion teknik är dock inte begränsad till studier av ganglier utveckling. Exempelvis i studier av förnyelse, kan photoconversion före skada villkor användas för att avgöra hur specifika celler inom en ganglion svarar efter skada. Dessa studier kan bidra till att belysa stamceller-liknande potential av specifika celler i en ganglion. Likaså kunde photoconversion specifika tumörceller och spårning av dessa celler med tiden avslöja egenskaper för enstaka celler inom komplexa tumörer. Denna tillämpning av enstaka cell photoconversion expanderar därför tekniken har potential att göra meningsfulla upptäckter i biomedicinska gemenskapen.

Detta synsätt kan också selektivt etikett celler inom ett område av ryggmärgen. I utveckling migrera celler ofta från föregångaren områden att producera differentierade celler i mogen platser11,14. Långsiktiga öde mappning med Cre har effektivt utnyttjats för att dissekera sådana processer. Med Cre tekniker är rumslig upplösning begränsad till de genomiska regulatoriska regioner som driver Cre transkription15. Med photoconversion, kan denna rumslig upplösning uppnås tillsammans med förmågan att välja den tidpunkt när photoconversion inträffar och den temporal upplösningen. Därför för kortare sikt öde-mapping har denna photoconversion teknik många fördelar jämfört med Cre öde-mappning. I prover där UV-ljus inte uppnås enkelt, är som i en intakt mus, detta photoconversion tillvägagångssätt dock osannolikt att arbeta15. Dessutom etiketter Cre öde-mapping permanent celler vilket möjliggör mer långsiktiga öde mappning än photoconversion som förlorar sin etikett som den photoconverted versionen av proteinet avleder och nya oomvända protein produceras av cellen. Beroende på den vetenskapliga frågan, kan dock photoconversion vara ett användbart verktyg för öde-kartläggning av cellpopulationer.

Även om bara två exempel på tillämpning av photoconversion är, har ett flertal studier visat dess effektivitet. Beroende på geografisk precision krävs, kan photoconversion utföras med tillgång till en UV-ljuskälla. Om önskan är att märka enstaka kan celler mer avancerade imaging som confocal eller två-foton mikroskopi vara nödvändigt. Dock har möjlighet att välja både rumsliga och tidsmässiga området märkt celler distinkt från andra celler inom en intakt vävnad gjort UV-inducerad photoconversion en kraftfull teknik för att analysera biologiska frågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Bernard Kulemaka och medlemmar av Smith lab för deras hjälpsamma kommentarer och reagens vägledning, Sam Connell och Brent Redford av 3i för fielding imaging frågor och Deborah Bang, Karen Heed och Kay Stewart för zebrafiskar vård. Detta arbete stöddes av den University of Notre Dame Elizabeth och Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center för zebrafiskar forskning vid University of Notre och Center av stamceller och regenerativ medicin vid University of Notre Dame. Alla djurstudier utfördes i enlighet med University of Notre Dame IACUC till Dr Cody Smith.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish VWR 25384-302
Embryo medium Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose dot scientific inc 9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish Ted Pella Inc. 14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) Fluka analytical A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets 3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion 405 nm laser
Slidebook software 3i
Methylene blue Kordon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10, (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38, (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5, (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290, (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7, (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12, (9), e1001961 (2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29, (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203, (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9, (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8, (24), 1323-1326 (1998).
Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).More

Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter