Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.
Abstract
Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos+ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.
Introduction
Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlreiche Techniken, um diese Aufgabe1,2,3,4zu erreichen entwickelt.
Die Entdeckung und Umsetzung von Quallen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein spannender Ansatz, der für die Kennzeichnung von verschiedenen Zellen in einem Gewebe Umwelt1erlaubt. Mit zellspezifische Promotoren, ist es möglich, eine Teilmenge von Zellen genetisch zu wählen, die1bezeichnet werden. Alternativ kann virale induzierte Expression von GFP vom Benutzer ausgewählte Ausdruck der GFP3,4einsetzbar. Obwohl ziemlich nützlich, erlaubt vermittelten Genexpression der GLP nicht vom Benutzer ausgewählte Ausdruck in einer Teilmenge von Zellen im Gewebe; und virale Ausdruck der GFP, zwar vorteilhaft, kann invasive. Mit dem Aufkommen von GFP-Derivaten und clevere Techniken wie Brainbow verschiedene fluoreszierende Proteine mehr spärlich in den Geweben zum Ausdruck zu bringen ist es möglich, einzelne Zellen und die Interaktionen zwischen ihnen in komplexen Gewebe2, zu visualisieren geworden. 5. jedoch diese Ansätze Zellen in einer zufälligen beschriften. Wenn das gewünschte Experiment erfordert Visualisierung einer einzelnen Zelle oder Population von Zellen, die durch den Versuchsleiter definiert ist, sind sie daher beschränkt. Mit solchen Experimenten wäre es vorteilhaft, ein genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein zu haben, die manipuliert werden können, um in eine einzelne Zelle Art und Weise unterscheiden es von anderen Leuchtstofflampen und nicht fluoreszierenden Zellen.
Um dieses Ziel zu erreichen und die Zellbiologie einzelner Zellen innerhalb einer komplexen lebendes Gewebe zu visualisieren, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft Einzelzelle Ladungszustand verschiedene fluoreszierende Proteine6,7,8. Mit genetisch kontrolliert Ausdruck eines Photoconvertible Proteins (z.B. Eos, Kaede, etc.), die Übergänge von Grün auf rot fluoreszierenden UV ausgesetzt (488 nm) Licht, können wir eine einzelne Zelle unterscheiden, von seiner Eindringmittel beschrifteten Nachbarn6,7,8. Dieser Ansatz nutzt eine Vorrichtung an unsere confocal Mikroskop das Licht von einem Laser-Stapel zu einer Beugung begrenzte Region of Interest kann direkt angeschlossen. Mit dieser Technik können wir entweder einzelne Zellen oder größere Populationen in einem frei definierbaren Weise9,10,11beschriften. Die Technik ist minimal-invasiv im Vergleich zu einzelnen Zelle Injektionen von viralen GFP. Als ein Proof of Concept zeigen wir, dass wir Photoconvert einzelner Zellen in ein Ganglion im peripheren Nervensystem und Photoconvert größere Populationen wie Zellen befindet sich auf der Bauchseite des Rückenmarks9,10können, 11,12. Wir können diese Photoconverted-Zell-Populationen 24 h später dann visualisieren, um Einblick in ihre Bewegung und Differenzierung während der Entwicklung.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden von der University of Notre Dame institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Zebrafisch-Probe
- Legen Sie einen erwachsenen Mann und einem Erwachsenen weiblichen Tg (Cabrio Protein) in einer Paarung Kammer pro Standardverfahren13. Verwenden Sie in diesem Manuskript Tg(sox10:eos) Fisch9 wegen Zugang aber andere transgenen Linien mit Photoconvertible Protein gleichermaßen genutzt werden kann. Richten Sie mehr als eine Kammer für den Fall, dass Fische nicht verlegen zu tun. Lassen Sie die Fische über Nacht in der Kammer verbleiben.
- Sammeln Sie am nächsten Morgen Eiern in 100 mm Petrischalen. Eiern bis zu 24 h nach Befruchtung (hpf) Reifen vor dem Screening zu ermöglichen.
- Wenn Tiere oben heterozygot für das Transgen waren, Filtersätze Bildschirm 24 hpf Gerichte für Tg(sox10:eos) + Embryonen mit 488 nm Lichtquelle und GLP auf dem sezierenden Mikroskop. Tg(sox10:eos) + Embryonen zu isolieren und zu 48 Reifen erlauben hpf.
- Dechorionate Embryonen manuell mit einer Nadel oder Pinzette.
- Bereiten Sie und Mikrowellen Sie-5 mL 0,8 % niedrig schmelzende Punkt Agarose-Lösung.
- Sobald Agarose kühl anfühlen wird, legen Sie 3-4 narkotisierten Tg (Sox10:eos) + 48 hpf Fisch in der Mitte von einem 10 mm Glas-Deckgläschen unten Petrischale.
- Fügen Sie genügend Agarose bedecken die Oberfläche des Deckglases, etwa 1 mL. Verwenden Sie eine Sonde Nadel, um Fisch auf ihren Seiten zu arrangieren. Lassen Sie Agarose zu festigen, um die Montage der Tiere zu gewährleisten. Es möglicherweise notwendig, ständig der Zebrabärbling neu zu ordnen, bis der Agar14erstarrt. Erstarrung dauert ca. 2 Minuten.
- Nachdem die Agarose für 2 min erstarrt ist, fügen Sie langsam Embryo Medium mit 0,02 % Aminobenzoic Acid Ester (Tricaine), Schüssel, bis die Bodenfläche des Agar und Gericht untergetaucht ist. Dies sollte etwa 3 mL.
2. Mikroskop Montage und unkonvertierte Imaging
- Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier wird die Lab-spezifische Einstellung genannt "Imaging-Fisch."
- Probe auf konfokalen Umfang und bringen in den Fokus mit Kurs und Feineinstellung Knöpfe.
- Öffnen Sie das Fenster und suchen Sie die gewünschte Region von Interesse (d.h. Dorsal Root Ganglien).
- Wählen Sie die c488 Laser im Menü Filter setzen. Stellen Sie die Belichtung auf 300 ms, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].
- Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Stromzu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Das Angebot kann erhöht oder verringert, um Platz für die Tiefe der imaging-Bereich. Für das Rückenmark ist ein Wert zwischen 35-40 Stapeln in der Regel ausreichend [Abb. 5].
- Wählen Sie aktuelle Position [Abb. 5].
- Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.
3. Single-Cell Ladungszustand
- Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier nennt man die Lab-spezifische Einstellung "Fisch Abtragen vollen Chip."
- Wählen Sie die c488 und c541 Laser im Menü Filter setzen. Wenn nicht die gleiche Mikroskop-Software verwenden, finden Sie das Menü, verschiedene Laser und wählen Sie die 488 nm und 541 nm Laser auszuwählen. Die Belichtungen auf 300 ms eingestellt, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2]. Diese Lasereinstellungen werden auf die Produktion von genügend Fluoreszenzsignal ohne Immunofluoreszenz oder Toxizität ausgewählt. Wenn Toxizität oder Immunofluoreszenz visualisiert wird, reduzieren Sie Laserleistung oder Belichtung.
- Öffnen Sie das Fenster und klicken Sie auf die Registerkarte "Photomanipulation" im Fenster "Fokus". Laserparameter entsprechend anpassen. Ändern Sie die Laserleistung Stack auf 2, und klicken Sie dann auf Go. Ändern Sie die Raster-Blockgröße auf 1 und klicken Sie auf festlegen. Ändern Sie doppelklicken Sie auf 4. Ändern Sie die Laserlinie auf v405 [Abb. 3].
- Öffnen Sie die erweiterten Einstellungen im Fenster "Aufnahme". Wählen Sie die Registerkarte "Photomanipulation" und ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in 2. Klicken Sie auf "OK" [Abb. 4].
- Wählen Sie die Registerkarte "XY" im Fenster "Fokus". Überprüfen Sie die Laserparameter aus Schritt 2 im Register Fotomanipulation [Abbildung 3, Abbildung 4]. Photoconvert die Zelle ohne Ladungszustand der umgebenden Zellen Lasereinstellungen gesetzt.
- Wenn Ladungszustand benachbarter Zellen vorhanden ist, reduzieren Sie Laserleistung. Wenn Ladungszustand der Zellen nicht auftritt, können Laserleistungen erhöht werden. Laserleistung soll optimal, Photoconvert nur die Region von Interesse und nicht die Umgebung.
- Das Kontrollkästchen Sie Timelapse unter Typ zu erfassen. Klicken Sie auf [Abbildung 6A] starten .
- Sobald das live Zeitraffer-Fenster öffnet, wählen Sie das Werkzeug Kreis in der oberen Symbolleiste [Abb. 7]
- Zeichnen Sie einen Kreis, in welcher Region der Zelle. Rechtsklick den gezeichneten Kreis, FRAP Regionauswählen, und warten Sie 3 Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dimmer werden [Abb. 8]. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden.
- Wenn mehr als ein Tier imaging, gehen Sie auf die Registerkarte "XY" im Fokus-Menü und wählen Sie Position 2 zurück. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.6.
- Um eine Population von Zellen zu konvertieren, folgen Sie dem Protokoll und Laser Parameter für Schritte 4.1-4.4 außer statt Zeichnen eines Kreises des Interessenbereichs FRAP, verwenden Sie das Linienwerkzeug. Zeichnen Sie eine Linie auf die Region des Interesses und die Region mit den gleichen Parametern, die oben aufgeführten FRAP.
4. Post-Ladungszustand Imaging
- Nachdem alle Punkte Photoconverted sind. Wählen Sie die Labor-spezifischen standard Bildstapel Einstellung in der Precoversion imaging Schritt 3 beschrieben. Dies finden Sie unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte im Fenster "Aufnahme" [Abb. 5] einstellen.
- Wählen Sie die c488 Laser und stellen Sie die Belichtung auf 300ms Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].
- Wählen Sie die c541 Laser finden Sie unter das gleiche Menü wie die c488 Laser. Stellen Sie die Belichtung auf 500 ms, Laserleistung bis 10 und bis 75 [Abb. 9] verstärken.
- Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Strom zu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Die Palette-Anzahl kann erhöhen oder verringern um die gewünschte bildgebenden Tiefe [Abb. 5] unterzubringen.
- In der Registerkarte "XY-Fokus" gibt es mehrere Punkte, die multipoint Liste Option im Fenster "Aufnahme". Wenn dies nicht der Fall ist, wählen Sie aktuelle Position.
- Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.
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Representative Results
Ladungszustand der fluoreszierenden Proteinen kann verwendet werden, um verschiedene Zellen in einem Gewebe6beschriften. Um dies zu demonstrieren, wurden Tg(sox10:eos) Fisch9 verwendet, um das Photoconvertible Protein Eos unter die regulatorischen Sequenzen des sox10. Die Tg(sox10:eos) Tiere bei 48 hpf waren zunächst montiert, und dann ein Image erstellt um eine unspezifische Ladungszustand erkennen, die möglicherweise aufgetreten sind. Die Eos war unkonvertierte Fluoreszenzsignal mit kleinen Eos Photoconverted Fluoreszenzsignal dann visualisiert (Abbildung 10). Tiere wurden in der Dunkelheit, um sicherzustellen, dass unspezifische Ladungszustand ist minimal gehalten. Dann wurden die Regionen von Interesse confocal Mikroskop-Set-up mit UV-Licht ausgesetzt. Um zu bestätigen, dass einzelne Zellen Photoconverted durch die UV-Exposition waren, nahmen wir Z-Stapel von der Fläche, die von der Photoconverted Region. In Übereinstimmung mit erfolgreichen Ladungszustand, gab es wenig Erkennung nicht konvertiert EOS außerhalb des Bereichs des Interesses und Photoconverted Eos war deutlich in der Region von Interesse. Das resultierende Bild zeigt eine einzelne Zelle in ein Ganglion mit der Bezeichnung definitiv von seinen Nachbarn (Abbildung 10).
Um das Dienstprogramm dieser Ladungszustand Technik zu demonstrieren, wurde eine Population von Zellen auch UV-Licht ausgesetzt. In diesem Paradigma Pre-Ladungszustand Bilder wurden und keine un-Photoconverted-Eos-Signal vorhanden war. Als nächstes wurde die ventrale Seite des Rückenmarks UV mit einer Linie (Abbildung 11) ausgesetzt. Um erfolgreiche Ladungszustand bestätigen, Post-Ladungszustand Bilder wurden aufgenommen und Photoconverted Eos in den ventralen Rückenmark Zellen an der Stelle der Linie von Interesse, die wir gezogen haben waren visualisiert (Abbildung 11). Non-Photoconverted Eos Signal war in allen anderen Bereichen sichtbar. Um diese Technik zu erweitern haben wir dann identische Bilder rund um die Uhr nach den Ladungszustand. In diesen Bildern wurden Photoconverted Eos+ Zellen verstreut in der gesamten Region Rückenmark im dorsalen und ventralen Standorte (Abbildung 12) gesehen. Diese Daten stehen im Einklang mit der Hypothese, dass ventrale Wirbelsäule Zellen nach dorsal Standorte wie zuvor beschrieben10verlegt. Zusammen zeigen diese beiden Techniken, Ladungszustand der Eos kann genutzt werden, um einzelne Zellen oder Populationen von Zellen innerhalb einer Gewebe-Region auf benutzerdefinierte Weise visualisieren. Dies hat zu einem besseren Verständnis der zellulären Eigenschaften wie Zellwanderung, Kommunikation und Dynamik beigetragen.
Abbildung 1 : Erfassen und Windows zu konzentrieren. Screenshot der Software Darstellung der Lage der Abscheidung und Schwerpunkt Windows und das Lab bestimmten "Fisch Abtragen vollen Chip" Drop-down-Registerkarte. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : c488 Laserparameter. Screenshot von der Capture-Fenster zeigt die spezifischen Parameter für den c488 Laser. Exposition ist 300 Ms. Laserleistung 5. Intensivierung ist 75. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Ladungszustand Laserparameter. Screenshot der Fotomanipulation Registerkarte im Fenster "Fokus" umreißt die speziellen Lasereinstellungen für Ladungszustand benötigt. Laserstack Power ist 2. Doppelklicken Sie auf Größe ist 4. Raster-Blockgröße ist 1. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Erweiterte Ladungszustand Laserparameter. Screenshot der fortschrittliche Lasereinstellungen im Fenster "Aufnahme". Dies öffnet Fenster Capture Einstellungen mit der Registerkarte "Photomanipulation". Doppelklicken Sie auf Wiederholungen auf 2 festgelegt ist. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Unkonvertierte Imaging Parameter. Screenshots von Fokus und Capture Fenster. Highlights der Capture Fenster spezifische Parameter für unkonvertierte Bildgebung erforderlich. Die Aufnahme-Einstellung ist "Fisch Imaging." Die 3D-Box wird unter den Capture-Typ überprüft. Und die 3D Aufnahmeeinstellungen angegeben sind; Palette ist 35, Anzahl der Flugzeuge ist 36 Schrittweite beträgt 1 und Offset ist-15. Die "aktuelle Position" und "reichen um Strom" Boxen sind ebenfalls ausgewählt. Rote Felder angezeigt. Zeigt, wie Sie einzelne oder mehrere Punkte auf das Aufnahmefenster (links) auswählen und wie Sie einzelne Punkte im Fokus-Fenster (rechts) auswählen. Grüne Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Öffnen des Fensters Ladungszustand. Screenshot zeigt den Zeitraffer Aufnahme Typ wird in Übereinstimmung mit vorher eingestellten Parameter ausgewählt. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Einrichten der Ladungszustand. Screenshot zeigt den Standort der Kreisfunktion (oben) und die Erfassung Kontrollfenster (rechts). Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Einzellige Ladungszustand. Screenshot zeigt die Verwendung der Ladungszustand Kreisfunktion und die Rechte Maustaste Dropdown-Menü. "Alle Regionen FRAP" Conversion-Aktion befindet sich in der Rechtsklick Drop-down-Menü. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 : Post-Ladungszustand c561Laser Parameter. Screenshot von der Capture-Fenster zeigt die spezifischen Parameter für den c561 Laser. Exposition ist 500 ms Laserleistung 10. Intensivierung ist 75. Rote Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10 : Einzellige Ladungszustand. (A). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien im peripheren Nervensystem vor Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Lage der DRG Rückenmark Eintrag... (B). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien im peripheren Nervensystem während der Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt DRG Rückenmark Eintritt. Gelber Kreis zeigt Umwandlung Website und Beleuchtung Schraube UV-Licht Exposition. (C). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien in der peripheren Nervensystems Post-Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt DRG Rückenmark Eintritt. CNS ist eine Abkürzung für zentrales Nervensystem und PNS ist eine Abkürzung für periphere Nervensystem (A-C). Maßstabsbalken entspricht 10 ähm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11 : Ladungszustand Verfahren in einer größeren Region, Rückenmark. (A). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks vor Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt dorsalen Region des Rückenmarks. (B). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks während Ladungszustand. Durchgezogene gelbe Linie zeigt ausgewählte Bereich für Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt dorsalen Region des Rückenmarks. (C). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Gestrichelte Linien zeigen die dorsalen Region des Rückenmarks. Maßstabsbalken entspricht 10 ähm.
Abbildung 12 : Zelluläre Tracking und Visualisierung Post-Ladungszustand. (A). schematische Tg(sox10:eos) Zebrafisch Rückenmark bei 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Blitz zeigt UV-Licht-Umwandlung. (B). konfokale Z-Projektionen der Tg(sox10:eos) Zebrafisch Rückenmark ab 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Blitz zeigt UV-Licht-Umwandlung. Maßstabsbalken entspricht 10 ähm.
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Discussion
In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist die räumliche Kontrolle, die der Wissenschaftler eine Zelle deutlich zu kennzeichnen muss. Mit einem Mikroskop, das die Fähigkeit hat, kleinere aussetzen imaging Gebiete innerhalb der größeren bildgebenden Fenster so klein wie einzelne Zellen oder Bereiche einzelner Zellen anders als andere Zellen bezeichnet werden können. Mehrere Photoconvertible Proteine wurden jetzt in die Gemeinschaft, so dass dies ein verbreiteter Technik7eingeführt. Mit der Fähigkeit, Photoconvert Proteine innerhalb der Zellen haben Wissenschaftler diese Technik oder ähnlichen Ansätzen zu untersuchen, Zellwanderung, Zelldifferenzierung und neuronalen Schaltung Analyse genutzt.
Obwohl die Software und die spezifischen Laserparameter in unser Labor spezifisch sind, zeigt dieser Artikel die universelle Möglichkeit, das Photoconvertable Protein Eos verwenden bei der Unterscheidung von einzelnen Zellen in ein Ganglion. Leider, die meisten genetischen regulatorischen Regionen, die fluoreszierende Proteine in frühen Entwicklungsphasen express weit innerhalb Ganglien fahren verwendet werden können. Dies ist wahrscheinlich, weil diese Zellen aus ähnlichen Vorläuferzellen Pools entstehen und die Marker diese Vorläuferzellen Staaten9 identifizieren. Es ist daher schwierig, die Wechselwirkungen der einzelnen Zellen innerhalb der größeren Ganglien während diese früher Entwicklungsstadien zu visualisieren. Die hier gezeigten Ansätze stellt eine Technik, die kann einzelne Zellen innerhalb eines Ganglion beschriften und somit könnte verwendet werden, um wissenschaftliche Fragen zu Ganglien Entwicklung zu sezieren.
Allerdings ist diese Ladungszustand Technik nicht auf Studien der Ganglien Entwicklung begrenzt. Beispielsweise kann in Studien der Regeneration, Ladungszustand vor Verletzungen Bedingungen genutzt werden, um festzustellen, wie spezifische Zellen innerhalb eines Ganglion reagieren nach Verletzung. Diese Studien können helfen, um der Stammvater-ähnlichen Potenzial bestimmter Zellen in ein Ganglion zu erhellen. In ähnlicher Weise könnte Ladungszustand der bestimmten Tumorzellen und Verfolgung dieser Zellen im Laufe der Zeit Eigenschaften einzelner Zellen innerhalb von komplexen Tumoren aufdecken. Diese Anwendung der Einzelzelle Ladungszustand erweitert somit das Potential der Technik, sinnvolle Entdeckungen in der biomedizinischen Gemeinschaft zu machen.
Dieser Ansatz kann auch selektiv beschriften Sie Zellen in einem Bereich des Rückenmarks. In der Entwicklung wandern Zellen oft aus Vorstufe, differenzierte Zellen in reifer Standorte11,14zu produzieren. Langfristige Schicksal Mapping mit Cre ist effizient verwendet worden, um solche Prozesse zu sezieren. Mit Cre-Techniken beschränkt sich räumlicher Auflösung auf der genomischen regulatorischen Regionen, die Cre Transkription15zu fahren. Mit Ladungszustand kann diese räumliche Auflösung erreicht werden, zusammen mit der Fähigkeit, die Zeit, wann der Ladungszustand auftritt, und die zeitliche Auflösung zu wählen. Daher für kürzere Begriff Schicksal-Mapping hat diese Ladungszustand Technik viele Vorteile gegenüber Cre Schicksal-Mapping. Jedoch dürfte in Proben, wo UV-Licht leicht erreicht werden kann, wie in einer intakten Maus diesen Ladungszustand Ansatz15arbeiten. Darüber hinaus kennzeichnet Cre Schicksal-Zuordnung dauerhaft Zellen ermöglicht mehr langfristige Schicksal Zuordnung als Ladungszustand, die seine Beschriftung verliert, wie die Photoconverted Version des Proteins zerstreut und neue unkonvertierte Protein wird von der Zelle hergestellt. Dennoch kann je nach Fragestellung, Ladungszustand ein nützliches Werkzeug für das Schicksal-Mapping Zellpopulationen sein.
Obwohl nur zwei Beispiele für die Anwendung der Ladungszustand bereitgestellt werden, haben zahlreiche Studien seine Wirksamkeit bewiesen. Abhängig von der räumlichen Präzision erforderlich kann Ladungszustand mit Zugriff auf eine UV-Lichtquelle erfolgen. Wenn der Wunsch ist es, einzelne beschriften können Zellen erweiterte Bildgebung wie konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie notwendig sein. Dennoch hat die Fähigkeit, die räumlichen und zeitlichen Bereich der markierten Zellen wählen deutlich von anderen Zellen innerhalb einer intakten Gewebe UV-induzierten Ladungszustand eine leistungsstarke Technik, biologischen Fragen zergliedern gemacht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Bernard Kulemaka und Mitglieder des Smith-Lab für ihre hilfreichen Kommentare und Reagenz Beratung, Sam Connell und Brent Redford von 3i für fielding Bildgebung Fragen und Deborah Bang, Karen Heed und Kay Stewart für Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde von der University of Notre Dame, die Elisabeth und Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre und Zentrum von Stammzellen und Regenerationsmedizin an der University of Notre unterstützt. Dame. Alle tierexperimentellen Studien erfolgten in Übereinstimmung mit der University of Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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