Summary
여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.
Abstract
동물 및 식물 조직 세포의 명료한 인구로 구성 됩니다. 이러한 셀 구축 하 고 조직 유지 시간에 따라 상호 작용 하 고 질병 중단 하는 경우 발생할 수 있습니다. 과학자 들은 셀의 하위 집합에 형광 단백질을 표현 하 여 특성과 그대로 조직 내 이러한 세포의 자연 역학 조사를 영리한 기술을 개발 했습니다. 그러나, 실험 시간에 단일 셀 또는 셀 인구 방식에 때로는 조직 내의 셀의 선택 된 시각화 더 필요합니다. 하이 고 셀의 인구 내의 단일 셀을 시각화, 과학자는 형광 단백질의 단일 셀 photoconversion를 활용 하 고. 이 기법을 보여, 우리 여기 어떻게 보여 UV 빛을 지시는 그대로의 Eos 표현 셀 zebrafish 생활. 우리는 다음 그들이 어떻게 조직에 변경 확인 하 photoconverted Eos+ 셀 24 h 나중 이미지. 우리는 두 가지 기술을 설명: 셀 photoconversion 및 photoconversions의 세포의 인구. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 운명 및 차별화, 그리고 셀 마이그레이션, 그건 수많은 생물학 질문에 적용 하는 기술 시각화를 사용할 수 있습니다.
Introduction
여러 가지 셀 구축 하 고 복잡 한 동물 및 식물 조직 유지 작용. 이 세포는 종종 삽입 하 고 조직의 고정을 필요로 하는 높은 해상도 현미경 없이 단일 세포 수준에서 이웃에서 구별 하기 어려운. 그러나, 이해 하 고 어떻게 이러한 조직 형태는 유지, 고 병 될, 그것 되었습니다 어떻게 단일 조직 내의 세포 조사 필수 상호 작용 하는 시간이 지남에. 이상적으로, 이러한 실험 정착의 요구 사항 없이 비 침략 적 방식으로 조직 내의 단일 셀의 라벨 필요 합니다. 과학자는 지금이 작업1,2,,34를 달성 하기 위해 수많은 기술을 개발 했다.
발견과 해파리의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구현1조직 환경 개별 셀의 라벨에 대 한 허용 한 흥미로운 접근 했다. 셀-특정 발기인을 사용 하 여, 유전자는1을 표시 하는 셀의 하위 집합을 선택 가능 하다.입니다. 또는, GFP의 바이러스 성 유도 식 GFP3,4의 사용자가 선택한 식에 대 한 이용하실 수 있습니다. 꽤 유용 하지만 GFP의 유전자 중재 표현; 조직에 있는 셀의 하위 집합 내에서 사용자가 선택한 식을 허용 하지 않습니다. 바이러스 성 표현의 GFP, 유리, 수 그리고 침략. 조직 내에서 더 부족 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 Brainbow 같은 영리한 기술과 GFP 파생 상품의 출현, 그것은 단일 셀 복잡 한 조직2, 에 그들의 사이에서 상호 작용을 시각화 수 되고있다 그러나 5., 이러한 접근 무작위 방식에서 셀 라벨. 원하는 실험 단일 셀의 시각화 또는 실험에 의해 정의 된 셀의 인구는 경우, 그들은 따라서 제한 됩니다. 이러한 실험 구분, 단일 셀 방식에서에 조작 될 수 있다 유전자 표현 형광 단백질을 것 그것은 다른 형광 비 형광 세포에서.
이 목표를 달성 하 고 단일 셀 복잡 한 살아있는 조직 내에서 세포 생물학을 시각화, 과학계에서는 고유한 형광 단백질6,,78의 단일 셀 photoconversion을 사용 합니다. 빨간 형광 상태로 자외선에 노출 되 면 녹색에서 전환 하는 photoconvertible 단백질 (즉, eos, 단풍나무, 등)의 표현을 제어 유전자를 사용 하 여 (488 nm) 빛, 우리는 붙일 레이블에서 한 단일 셀을 구분할 수 있습니다 이웃6,,78. 이 방법은 관심의 회절 제한 지역에 레이저 스택에서 빛을 직접 수 있는 우리의 confocal 현미경에 부착 된 기구를 이용 한다. 이 기술 우리 중 단일 셀 또는 사용자 정의 방식으로9,,1011에 더 큰 인구 레이블을 수 있습니다. 기술은 바이러스 GFP의 단일 세포 주사에 비해 최소한 침략 적 이다. 개념의 증거로 서 우리는 우리가 신경 절 말 초 신 경계 및 척수9,10의 복 부 쪽에 위치한 셀 같은 photoconvert 큰 인구 내의 photoconvert 단일 셀 수 보여 11,12. 우리 다음 그들의 운동 및 분화 발전 과정에 대 한 통찰력을 얻기 위해 이러한 photoconverted 세포 인구 24 h 나중을 시각화할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 노 틀 담 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 제 브라 견본 준비
- 표준 절차13당 짝짓기 챔버로 한 성인 남자와 한 성인 여성 Tg (컨버터블 단백질)를 배치 합니다. 이 원고에서는 Tg(sox10:eos)를 물고기9 액세스 하지만 photoconvertible 단백질으로 다른 유전자 변형 라인을 동등 하 게 사용 될 수 있다. 물고기 놓지 않는 경우 더 이상의 챔버를 설정 합니다. 챔버에 남아 하룻밤을 물고기 허용.
- 다음날 아침, 100 mm 페 트리 접시에 달걀을 수집 합니다. 심사 하기 전에 24 시간 후 수정 (hpf) 성숙 계란을 허용 합니다.
- 위의 동물 heterozygotes는 transgene에 대 한 경우, 화면 24 hpf 요리 Tg(sox10:eos) + 488 nm 광원 및 GFP 배아에 대 한 필터링 해 현미경에 세트. Tg(sox10:eos) + 배아를 분리 하 고 48 성숙 허용 hpf.
- 바늘 또는 핀셋으로 수동으로 Dechorionate 배아
- 준비 하 고 0.8% 낮은 녹는 포인트 agarose 용액 5 mL를 전자 렌지.
- Agarose 터치 멋지다, 일단 배치 3-4 마 취 안내 (sox10:eos) +48 hpf 물고기 10 m m 유리 coverslip의 센터에서 페 트리 접시 바닥.
- 충분히 agarose coverslip, 약 1 mL의 표면을 커버를 추가 합니다. 프로브 바늘을 사용 하 여 그들의 측면에 생선을 준비. 동물의 장착 되도록 공고히 agarose를 허용 합니다. 그것은 지속적으로 다시 정렬 하는 제 브라는 agar 굳은14까지 필요할 수 있습니다. 응고 약 2 분 걸립니다.
- 후는 agarose는 2 분 동안 경화는, 천천히 0.02 %aminobenzoic 산 에스테 르 (Tricaine) 한 접시의 하단 표면 빠져들 때까지 접시를 포함 하는 태아 매체를 추가 합니다. 이것은 약 3 mL 이어야 한다.
2. 현미경 장착 및 사전 변환 영상
- Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 이미징입니다."
- Confocal 범위에 견본을 놓고 코스와 미세 조정 손잡이 사용 하 여 초점을 가져다 합니다.
- 초점 창을 열고 관심 (즉 지 루트 ganglia) 원하는 영역을 찾습니다.
- C488 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화.
- 캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위는 증가 하거나 이미징 영역의 깊이 맞게 감소 될 수 있습니다. 척수에 대 한 35-40 스택 사이의 범위 값은 일반적으로 충분 한 [그림 5]입니다.
- [그림 5]의 현재 위치를 선택 합니다.
- 클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.
3. 단일 셀 Photoconversion
- Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 ablate 전체 칩."
- C488 및 c541 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 동일한 현미경 소프트웨어를 사용 하지 않는 경우 다른 레이저와 선택은 488 nm와 541 nm 레이저를 선택 하는 메뉴를 찾아. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화. 이러한 레이저 설정은 photobleaching 또는 독성을 유발 하지 않고 충분 한 형광 신호를 생산에 따라 선택 됩니다. 독성 또는 photobleaching 시각 이다, 만약 레이저 전원 또는 노출을 줄일 수 있습니다.
- 초점 창을 열고 초점 창에서 photomanipulation 탭을 클릭 합니다. 따라 레이저 매개 변수를 조정 합니다. 레이저 스택 전원 2로 변경 하 고 이동을 클릭 합니다. 1 래스터 블록 크기를 변경 하 고 설정을 클릭 합니다. 4를 두 번 클릭 크기를 변경 합니다. 레이저 라인 v405 변경 [그림 3].
- 캡처 창에서 고급 캡처 설정을 엽니다. Photomanipulation 탭을 선택 하 고 2 번 반복을 변경 합니다. [그림 4] 확인을 클릭 합니다.
- 초점 창에서 XY 탭을 선택 합니다. [그림 3, 그림 4] photomanipulation 탭에서 2 단계에서 레이저 매개 변수 확인 두 번. Photoconvert 주변 세포의 photoconversion 없이 관심의 셀 레이저 설정을 설정.
- Photoconversion 인접 한 셀의 경우 레이저 힘을 줄일 수 있습니다. 셀의 photoconversion 발생 하지 않으면, 레이저 능력을 늘릴 수 있습니다. 최적으로, 레이저 파워 photoconvert 관심과 하지 주변 지역에만 설정 합니다.
- 캡처 형식아래의 timelapse 상자를 확인 하십시오. 을 클릭 [그림 6A]를 시작 합니다.
- 일단 라이브 timelapse 창이 열리면 상단 도구 모음의 [그림 7] 원 도구를 선택
- 셀의 centermost 지역에서 원을 그립니다. 그려진된 동그라미를 클릭 마우스 오른쪽, FRAP 지역, 선택 하 고 3 초 동안 기다립니다. 선택 된 지역 주차 될 것 [그림 8]. 캡처 중지를 클릭 합니다.
- 개 이상의 동물을 이미징 하는 경우 다시 포커스 메뉴와 선택 위치 2에서 XY 탭으로 이동 합니다. 그런 다음 단계 4.1 4.6 반복 합니다.
- 세포의 인구를 변환 하려면 프로토콜 및 레이저 매개 변수 관심 영역을 졸라, 선 도구를 사용 하 여 원 그리기 대신 4.1-4.4 제외 하 고 단계를 따릅니다. 관심 지역에 선을 인출 하 고 위에 나열 된 동일한 매개 변수를 사용 하 여 영역을 졸라.
4. 게시물-photoconversion 영상
- 일단 모든 포인트 photoconverted. 실험실 관련 표준 이미지 스택 precoversion 이미징 단계 3에서에서 설명한 설정을 선택 합니다. 이 캡처 캡처 창 [그림 5]에서 드롭 다운 탭 설정에서 발견 된다.
- C488 레이저를 선택 하 고 설정 300ms에 노출, 레이저 출력 5, 75 [그림 2] 강화.
- C541 레이저 c488 레이저 같은 메뉴 아래를 선택 합니다. 500 ms에 노출 설정, 레이저 10, 출력 하 고 75 [그림 9] 강화.
- 캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위 수 있습니다 늘리거나 원하는 이미징 깊이 [그림 5]에 맞게.
- XY 포커스 탭에 여러 지점이 경우 캡처 창에서 멀티 목록 옵션을 선택 합니다. 그렇지 않은 경우에 현재 위치를 선택 합니다.
- 클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.
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Representative Results
Photoconversion 형광 단백질의 조직6내에서 개별 셀을 사용할 수 있습니다. 이 보여, Tg(sox10:eos) 물고기9 sox10의 규제 시퀀스에서 photoconvertible 단백질 Eos 표현 하 사용 되었다. 48 Tg(sox10:eos) 동물 hpf 했다 처음 탑재, 그리고 다음 발생 했을 수 있는 일반적인 photoconversion 감지 하 군데. Eos Eos photoconverted 형광 신호 작은 비전향된 형광 신호는 다음 시각화 (그림 10). 동물은 일반적인 photoconversion는 최소 보장 하기 위해 어둠 속에서 유지 했다. 그럼, 관심 영역 confocal 현미경 설정을 사용 하 여 자외선에 노출 되었다. 확인 하려면 단일 셀 UV 노출의 결과로 photoconverted 했다, 우리는 photoconverted 지역에 걸친 영역의 z 스택을 했다. 성공적인 photoconversion와 일치, 관심 영역 밖에 Eos 변환 비의 작은 탐지와 photoconverted Eos 관심 영역 내에서 분명히 존재 했다. 결과 이미지는 이웃 (그림 10)에서 확실히 표시 됩니다 신경 절 내에서 단일 셀을 보여줍니다.
이 photoconversion 기법의 유틸리티 설명, 세포의 인구 자외선에 노출 되었다. 이 패러다임에서는 pre-photoconversion 이미지 찍은 하 고 유엔 photoconverted Eos 신호가 존재 했다. 다음으로, 척수의 복 부 측 선 (그림 11)을 사용 하 여 자외선에 노출 되었다. 게시물 photoconversion 이미지 찍은 성공적인 photoconversion를 확인 하 고 관심을 우리가 그린 라인의 위치에 복 부 척수 세포에서 Eos 했다 photoconverted 시각 (그림 11). 비-photoconverted Eos 신호 다른 모든 영역에서 표시 했다. 이 기술을 확장 하 우리 했다 동일한 이미지는 photoconversion 후 24 시간. 이 이미지에서 photoconverted Eos+ 세포 등 쪽과 복 부 위치 (그림 12)에서 척수 지역에 걸쳐 흩어져 보였다. 이러한 데이터는 복 부 척추 세포 등 위치 이전에 설명한10이전 가설과 일치 하는. 함께이 두 가지 기술을 보여 Eos의 그 photoconversion 단일 셀 또는 셀 사용자 정의 패션에 조직 지역 내에서 인구를 시각화 하기 위해 이용 될 수 있다. 이 셀 마이그레이션, 통신, 역학 등 세포 특성의 더 나은 이해에 기여 했다.
그림 1 : 캡처하고 Windows 초점. 캡처 및 초점 창과 연구소 특정 "물고기 ablate 전체 칩" 드롭 다운 탭의 위치를 묘사 하는 소프트웨어의 스크린샷. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : c488 레이저 매개 변수. C488 레이저에 대 한 특정 매개 변수를 보여주는 캡처 창의 스크린샷. 노출은 300 양 레이저 힘은 5 이다. 강화는 75. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Photoconversion 레이저 매개 변수. 특정 레이저 설정 개요 초점 창에서 photomanipulation 탭의 스크린샷 photoconversion 필요 합니다. Laserstack 파워는 2입니다. 두 번 클릭 크기는 4입니다. 래스터 블록 크기는 1입니다. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 고급 Photoconversion 레이저 매개 변수. 캡처 창에서 고급 레이저 설정의 스크린샷. Photomanipulation 탭 캡처 환경 설정 창에 열립니다. 두 번 반복 2로 설정 됩니다. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 사전 변환 매개 변수를 이미징. 초점 및 캡처 윈도우의 스크린샷입니다. 사전 변환 영상에 필요한 캡처 창 특정 매개 변수를 강조 표시 합니다. 캡처 설정이 이다 "물고기 이미지입니다." 3D 상자 아래 캡처 유형을 확인 합니다. 3D 캡처 설정 지정 범위는 35, 비행기의 수는 36, 스텝 크기는 1 이며 오프셋은-15. "현재 위치" 및 "전류 주위 범위" 상자도 선택 됩니다. 빨간 상자를 참조 하십시오. (왼쪽) 캡처 창에서 하나 또는 여러 개의 포인트를 선택 하는 방법 및 초점 창 (오른쪽)에 개별 포인트를 선택 하는 방법을 보여 주며. 녹색 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Photoconversion 창을 열고. 스크린샷 timelapse 캡처 유형을 묘사 이전에 설정한 매개 변수에 따라 선택 됩니다. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 설정에서 Photoconversion. 원 도구 (위) 및 캡처 제어 창이 나타나면 (오른쪽)의 위치를 보여주는 스크린샷. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 단일 셀 Photoconversion. 원 photoconversion 도구는 오른쪽 클릭의 사용을 묘사 하는 스크린샷 드롭 다운 메뉴. "졸라 모든 지역" 변환 작업은 오른쪽 클릭 드롭 다운 메뉴에서 합니다. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 포스트-Photoconversion c561Laser 매개 변수. C561 레이저에 대 한 특정 매개 변수를 보여주는 캡처 창의 스크린샷. 노출은 500 양 레이저 파워는 10 이다. 강화는 75. 빨간 상자를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 : 단일 셀 Photoconversion. (A). photoconversion 전에 말 초 신 경계에서 48 hpf 보여주는 지 루트 중추에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 파선은 DRG 척수 항목의 대략적인 위치를 나타냅니다. (B). photoconversion 중 말 초 신 경계에서 48 hpf 보여주는 지 루트 중추에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 파선은 DRG 척수 항목을 나타냅니다. 노란색 원 변환 사이트 나타내고 조명 볼트 나타냅니다 자외선 가벼운 노출. (C). 48 hpf 보여주는 지 루트 신경 절 말 초 신 경계 게시물-photoconversion에서에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 파선은 DRG 척수 항목을 나타냅니다. CNS는 중추 신 경계에 대 한 약어 그리고 PNS는 말 초 신 경계 (A-C)에 대 한 약어입니다. 눈금 막대는 10을 um 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 : 큰 척수 영역에 Photoconversion 절차. (A). 48 hpf 보여주는 OPCs photoconversion 전에 척수의 복 부 지역에 지 루트 중추에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 파선 척수의 등 쪽 영역을 나타냅니다. (B). 48 hpf 보여주는 OPCs와 photoconversion 중 척수의 복 부 지역에 지 루트 중추에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 노란 실선 photoconversion에 대 한 선택된 영역을 나타냅니다. 파선 척수의 등 쪽 영역을 나타냅니다. (C). 48 hpf 보여주는 OPCs photoconversion 후 척수의 복 부 지역에 지 루트 중추에서 Tg(sox10:eos) zebrafish의 회로도 confocal z 계획. 파선 척수의 등 쪽 영역을 나타냅니다. 눈금 막대는 10을 um 같습니다.
그림 12 : 휴대 전화 추적 및 시각화 게시물-photoconversion. (A). 48 hpf 보여주는 OPCs photoconversion 후 척수의 복 부 지역에 지 루트 중추에서 척수 zebrafish Tg(sox10:eos) 의 도식. 번개는 UV 빛 변환을 나타냅니다. (B). Tg(sox10:eos) zebrafish 척수 photoconversion 후 48 hpf 보여주는 OPCs 지 루트 중추는 척수의 복 부 지역에서에서 시작의 Confocal z 계획. 번개는 UV 빛 변환을 나타냅니다. 눈금 막대는 10을 um 같습니다.
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Discussion
복잡 한 조직에서 다른 세포 유형 특정 도메인으로 구성합니다. 최근 기술 이러한 큰 조직 구조1,2,3내에서 개별 셀 라벨에 이용 되어 있다. 여기 마찬가지로 단일 세포 상호 작용 및 복잡 한 조직 내의 세포 인구 상호 작용을 시각화를 활용할 수 있는 두 가지 방법을 설명 합니다. Photoconversion 기술의 장점은 분명히 셀 라벨 과학자는 공간 제어입니다. 능력을 더 작은 노출은 현미경으로 큰 이미지 창에서 영역 지역으로 단일 세포 또는 단일 셀의 다른 세포와는 다르게 표시 될 수 있습니다 작은 이미지입니다. 지금 여러 photoconvertible 단백질이 더 광범위 하 게 기술7을 만드는 사회에 도입 되었습니다. Photoconvert 단백질을 세포 내에서 능력, 과학자는이 기술 또는 셀 마이그레이션, 세포 분화 및 신경 회로 분석 조사에 유사한 접근 활용 하.
특정 레이저 매개 변수 및 소프트웨어 연구소에 있지만,이 문서에서는 신경 절 내의 단일 셀을 구별에 Eos photoconvertable 단백질을 사용 하는 보편적인 능력을 보여줍니다. 불행히도, 대부분 유전적 규제 영역을 형광 단백질 중추 내 널리 익스프레스 초기 발달 단계에서 사용할 수 있는입니다. 이러한 셀 비슷한 뿌리 풀에서 생성 되 있기 때문에 마커 식별 그 조상 상태9이 높습니다. 따라서 이러한 이전 발달 단계 동안 큰 중추 내의 단일 셀의 상호 작용을 시각화 하기가 어렵습니다. 여기에 표시 하는 방법을 신경 절 내에서 개별 셀을 레이블 수 및 따라서 중추 개발에 대 한 과학적인 질문을 해 부 하는 데 사용 될 수 있는 하나의 기법을 나타냅니다.
그러나,이 photoconversion 기술은 중추 개발의 연구에 국한 되지 않습니다. 예를 들어 중생의 연구, 사전 부상 조건의 photoconversion 부상 다음 절의 반응 내에서 특정 세포가 어떻게 결정을 활용할 수 있습니다. 이 연구는 신경 절에서 특정 셀의 뿌리와 같은 잠재력을 명료 하 게 도울 수 있다. 마찬가지로, 특정 종양 세포의 photoconversion 및 추적 시간이 지남에 따라 그 세포의 복잡 한 종양 내의 단일 셀의 속성을 공개 수 있습니다. 단일 셀 photoconversion의이 응용 프로그램은 따라서 생물 지역 사회에 의미 있는 발견을 기술의 잠재력을 확장 합니다.
이 방법은 척수의 영역 내의 셀 라벨 또한 선택적으로 수 있습니다. 개발, 세포는 자주 성숙한 위치11,14에서 차별화 된 세포를 생산 하기 위해 전조 지역에서 마이그레이션할. Cre 장기 운명을 매핑은 그런 과정을 해 부를 효율적으로 이용 되어. Cre 기법, 공간 해상도 Cre 전사15드라이브 게놈 규제 지역으로 제한 됩니다. Photoconversion와 함께이 공간 해상도 photoconversion 발생 시간과 시간적 해상도 선택할 수 있는 능력과 함께 얻을 수 있습니다. 따라서, 짧은 기간 운명-매핑,이 photoconversion 기술은 Cre 운명-매핑을 통해 많은 이점이 있다. 그러나, 샘플 UV 빛을 쉽게 얻을 수 없다 어디에서 처럼 그대로 마우스에이 photoconversion 접근 가능성이 크다15일. 또한, Cre 운명-매핑 영구적으로 단백질의 photoconverted 버전 방출 하 고 새로운 비전향된 단백질 세포에 의해 생산 되는 레이블이 photoconversion 보다 더 장기 운명 매핑 허용 셀 라벨. 그럼에도 불구 하 고, 과학적인 질문에 따라 photoconversion 세포 인구의 운명-매핑을 위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.
Photoconversion의 응용 프로그램의 두 가지 예제를 제공 하지만 수많은 연구의 효능을 증명 하고있다. 필요한 공간 정밀도 따라 photoconversion UV 광원에 대 한 액세스를 수행할 수 있습니다. 욕망은 단일 레이블을 경우 셀 또는 2 광자 공초점 현미경 같은 이미징 고급 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그대로 조직 내의 다른 셀에서 명백 하 게 레이블이 지정 된 셀의 공간 및 시간 영역을 선택 하는 능력이 했다 photoconversion UV 유도 된 생물학 질문을 해 부 수 있는 강력한 기술을.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리가 버나드 Kulemaka 및 그들의 도움이 의견과 시 지도, 샘 Connell 및 이미징 질문 및 데보라 뱅, 카 렌 주 및 케이 스튜어트 zebrafish 치료 비 위한 3i의 브렌 트 레드에 대 한 스미스 연구소의 회원을 감사 합니다. 이 작품 노 대학 및 줄기 세포의 센터에서 Zebrafish 연구 노 대학에서 재생 의학에 대 한 노트르담의, Elizabeth와 마이클 갤러거 가족, 알프레드 P. 슬로 안 재단, 센터에 의해 지원 되었다 담입니다. 모든 동물 연구 박사 코디 스미스의 Notre Dame 대학 IACUC에 따라 수행 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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