Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.
Abstract
Tecidos animais e vegetais é composto de populações distintas de células. Estas células interagem ao longo do tempo para construir e manter o tecido e podem causar doenças quando interrompido. Os cientistas desenvolveram técnicas inteligentes para investigar características e dinâmica natural dessas células no tecido intacto por expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos de células. No entanto, às vezes, experiências exigem mais selecionada visualização de células dentro do tecido, às vezes a forma unicelular ou população de células. Para alcançar este objectivo e Visualizar células únicas dentro de uma população de células, os cientistas têm utilizado a célula única photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demonstrar essa técnica, mostramos aqui como direcionar a luz UV para uma célula Eos-expressando um interesse de uma intacta, vivendo zebrafish. Nós então imagem essas células de Eos+ photoconverted 24h depois para determinar como eles mudaram no tecido. Descrevemos duas técnicas: única célula photoconversion e photoconversions das populações de células. Estas técnicas podem ser usadas para visualizar interações célula-célula, célula-destino e diferenciação e migrações de célula, tornando-se uma técnica que é aplicável em numerosas questões biológicas.
Introduction
Várias células distintas interagem para construir e manter o complexos tecidos animais e vegetais. Estas células são frequentemente intercalados e difícil de distinguir de vizinhos em um nível de célula única sem microscopia de alta resolução que exigem a fixação do tecido. No entanto, para compreender a forma como estes tecidos, são mantidas e tornar-se doente, tem sido essencial para investigar como single as células dentro do tecido estão interagindo ao longo do tempo. Idealmente, estas experiências exigem a rotulagem de células únicas dentro de um tecido de forma não-invasiva, sem a exigência de fixação. Os cientistas agora desenvolveram inúmeras técnicas para realizar esta tarefa1,2,3,4.
A descoberta e a implementação da proteína medusas verde fluorescente (GFP) foi uma abordagem interessante que permitiu para a rotulagem de células distintas em um ambiente de tecido1. Usando promotores de célula específica, é possível geneticamente, selecionar um subconjunto de células que são rotulados1. Alternativamente, viral induzida expressão de GFP pode ser utilizada para usuário-selecionado expressão de GFP3,4. Embora bastante útil, expressão mediada genética de GFP não permite expressão selecionado pelo usuário dentro de um subconjunto de células no tecido; e a expressão viral de GFP, apesar de vantajoso, pode ser invasiva. Com o advento de técnicas inteligentes como Brainbow expressar proteínas fluorescentes distintas mais escassa dentro de tecidos e derivados GFP, tornou-se possível visualizar células únicas e as interações entre eles em tecido complexo2, 5. no entanto, essas abordagens rotular as células de uma forma aleatória. Se o experimento desejado requer a visualização de uma única célula ou a população de células é definido pelo experimentador, são, portanto, limitados. Com tais experiências, seria vantajoso ter uma proteína fluorescente geneticamente expressa que pode ser manipulada para distinguir, de forma única célula, que de outras células não-fluorescente fluorescentes.
Para atingir esse objetivo e visualizar a biologia celular de células únicas dentro de um tecido vivo complexo, a comunidade científica usa única célula photoconversion de proteínas fluorescentes distintas6,7,8. Usando geneticamente controlado a expressão de uma proteína de photoconvertible (i.e., eos, kaede, etc.) que transita de um verde para vermelho estado fluorescente quando exposto aos raios UV (488 nm) a luz, podemos distinguir uma única célula de sua fluorescente etiquetadas vizinhos de7,6,8. Esta abordagem utiliza um aparelho ligado ao nosso microscópio confocal que pode direcionar a luz de uma pilha de laser para uma região de difração limitada de interesse. Com esta técnica, podemos rotular ou células únicas ou maiores populações em uma maneira definida pelo usuário9,10,11. A técnica é minimamente invasiva em comparação com injeções de célula única de GFP viral. Como uma prova de conceito, mostramos que podemos photoconvert células únicas dentro de um gânglio no sistema nervoso periférico e as maiores populações de photoconvert como células localizadas no lado ventral da medula espinhal9,10, 11,12. Podemos então Visualizar estas photoconverted populações de células 24h mais tarde para ganhar a introspecção em seu movimento e diferenciação durante o desenvolvimento.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Notre Dame institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização.
1. preparação da amostra de Zebrafish
- Coloque um macho adulto e um adulto feminino Tg (proteína conversível) para a câmara de acasalamento por procedimentos-padrão13. Neste manuscrito, use Tg(sox10:eos) peixe9 por causa do acesso, mas outras linhas transgénicas com proteína de photoconvertible pode ser igualmente utilizado. Configure mais de uma câmara no caso de peixe não fazer lay. Permitir que os peixes que permanecem na câmara durante a noite.
- Na manhã seguinte, colete ovos em caixas de Petri 100 mm. Permitem a ovos amadurecer-se à fertilização de pós 24h (hpf) antes de triagem.
- Se animais acima eram heterozigotos para o transgene, pratos de hpf tela 24 Tg(sox10:eos) + embriões com uma fonte de luz nm 488 e GFP filtram conjuntos em um microscópio de dissecação. Tg(sox10:eos) + embriões de isolar e permitir para amadurecer-se 48 hpf.
- Dechorionate embriões manualmente com uma agulha ou pinça.
- Preparar e 5 mL de solução de ponto de agarose de baixo ponto de fusão de 0,8% no microondas.
- Uma vez que a agarose é frio ao toque, coloque 3-4 anestesiados Tg (sox10:eos) + 48 peixe hpf no centro de um vidro de 10mm-lamela inferior placa de Petri.
- Adicione suficiente agarose para cobrir a superfície da lamela, cerca de 1 mL. Use uma agulha de sonda para organizar peixe em seus lados. Permitir que a agarose solidificar para garantir a montagem de animais. Pode ser necessário para continuamente re-organizar o zebrafish até o ágar solidifies14. Solidificação leva aproximadamente 2 minutos.
- Depois que a agarose solidificou-se por 2 min, adicione lentamente o meio de embrião contendo 0,02% éster de ácido aminobenzoico (tricaina) para prato até a superfície inferior do ágar e prato está submersa. Isto deve ser de aproximadamente 3mL.
2. microscópio montagem e pre-conversão imagens
- Confocal software aberto e selecionar os windows captura e foco [Figura 1]. Sob a janela de captura, selecione a configuração de conversão específicas do laboratório de imagem sob a captura de configuração drop-down guia [Figura 1]. Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de "peixe Imaging".
- Coloque a amostra no escopo confocal e colocar em foco usando o curso e os botões de ajuste fino.
- Abra a janela de foco e localizar a região desejada de interesse (ou seja, o gânglio da raiz dorsal).
- Selecione o laser c488 sob o menu filtro definido. Definir a exposição a 300 ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2].
- Marque a caixa 3D na seção tipo de captura . Na seção de captura 3D , selecione usar atual posição e verificar o intervalo ao redor de corrente. Na mesma seção, defina o intervalo de 35 anos, o número de aviões a 36 e o tamanho da etapa 1. O intervalo pode ser aumentado ou diminuído para acomodar para a profundidade da área de imagem. Para a medula espinhal, um valor de intervalo entre 35-40 pilhas normalmente é suficiente [Figura 5].
- Selecione o local atual [Figura 5].
- Clique em Iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir a imagem.
3. single-cell Photoconversion
- Confocal software aberto e selecionar os windows captura e foco [Figura 1]. Sob a janela de captura, selecione a configuração de conversão específicas do laboratório de imagem sob a captura de configuração drop-down guia [Figura 1]. Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de "Peixe ablate chip completo."
- Selecione o laser c488 e c541 sob o menu filtro definido. Se não utilizar o mesmo software de microscópio, encontre o menu para selecionar diferentes lasers e selecione o 488 nm e 541 lasers de nm. Definir os riscos relativos a 300 ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2]. Essas configurações do laser são selecionadas com base na produção suficiente sinal fluorescente sem causar fotobranqueamento ou toxicidade. Se toxicidade ou fotobranqueamento é visualizado, reduza a potência do laser ou exposição.
- Abra a janela de foco e clique na guia photomanipulation na janela de foco. Ajuste os parâmetros do laser em conformidade. Mudar a potência da pilha do laser para 2 e clique em ir. Alterar o tamanho de bloco de Raster para 1 e clique em definir. Altere o tamanho de clique duplo para 4. Altere a linha de laser para v405 [Figura 3].
- Abra as configurações de captura avançada na janela de captura. Selecione a guia photomanipulation e alterar as repetições de clique duplo para 2. Clique Okey [Figura 4].
- Selecione a guia XY na janela de foco. Verifique os parâmetros do laser da etapa 2 na guia photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Definir configurações do laser para photoconvert a célula de interesse sem photoconversion das células circundantes.
- Se houver photoconversion de células adjacentes, reduza a potência do laser. Se photoconversion de células não ocorre, poderes do laser podem ser aumentados. Idealmente, conjunto potência do laser para photoconvert apenas a região de interesse e não áreas circunvizinhas.
- Marque a caixa de timelapse sob o tipo de captura. Em seguida, clique em Iniciar [figura 6A].
- Uma vez que abre a janela de timelapse ao vivo, selecione a ferramenta círculo na barra superior [Figura 7]
- Desenhe um círculo na região centermost da célula. O círculo desenhado com o botão direito, selecione a região FRAPe aguarde 3 segundos. A área selecionada deve tornar-se redutor [Figura 8]. Clique em parar captura.
- Se mais de um animal de imagem, volte para o guia XY no foco menu e selecione posição 2. Em seguida, repita etapas 4.1-4.6.
- Para converter uma população de células, segui os parâmetros de protocolo e laser para etapas 4.1-4.4 exceto em vez de um círculo para FRAP a região de interesse, use a ferramenta de linha de desenho. Desenhar uma linha na região de interesse e FRAP região usando os mesmos parâmetros listados acima.
4. post-photoconversion Imaging
- Uma vez que todos os pontos são photoconverted. Selecione a pilha de imagem padrão de laboratório específicas configuração descrita na precoversion de imagem passo 3. Isto é encontrado sob a captura de configuração drop-down guia na janela de captura [Figura 5].
- Selecione o laser c488 e definir a exposição a 300ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2].
- Selecione o laser c541 encontrado sob o mesmo menu como o laser c488. Definir a exposição de 500 ms, poder para 10 laser e intensificar a 75 [Figura 9].
- Marque a caixa 3D na seção tipo de captura . Na seção de captura 3D , selecione usar atual posição e verificar o intervalo ao redor de corrente. Na mesma seção, defina o intervalo de 35 anos, o número de aviões a 36 e o tamanho da etapa 1. O número de série pode aumentar ou diminuir para acomodar a desejada profundidade de imagem [Figura 5].
- Se houver vários pontos no guia de foco XY, selecione a opção lista multiponto na janela de captura. Se não, selecione o local atual.
- Clique em Iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir a imagem.
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Representative Results
Photoconversion de proteínas fluorescentes pode ser usado para rotular células distintas dentro de um tecido de6. Para demonstrar isso, Tg(sox10:eos) peixe9 foram usados para expressar a proteína photoconvertible Eos sob as sequências reguladoras de sox10. Os animais Tg(sox10:eos) em 48 hpf foram montados primeiro e então fotografada para detectar qualquer photoconversion não-específicos que possam ter ocorrido. O Eos unconverted sinal fluorescente com pequeno sinal fluorescente photoconverted de Eos foi então visualizada (Figura 10). Os animais foram mantidos no escuro para garantir a photoconversion de não-específica é mínima. Em seguida, as regiões de interesse foram expostas à luz UV usando a instalação do microscópio confocal. Para confirmar que células únicas foram photoconverted como resultado da exposição aos raios UV, tomamos pilhas de z da área de abrangência da região de photoconverted. Consistente com sucesso photoconversion, lá foi pouco detecção de não-convertidos Eos fora da região de interesse e photoconverted Eos estava claramente presente dentro da região de interesse. A imagem resultante mostra uma única célula dentro de um gânglio que é rotulado definitivamente de seus vizinhos (Figura 10).
Para demonstrar a utilidade desta técnica de photoconversion, uma população de células também foi exposta à luz UV. Neste paradigma, pre-photoconversion foram tomadas imagens e nenhum sinal de Eos un-photoconverted estava presente. Em seguida, pelo lado ventral da medula espinhal foi exposto aos raios UV usando uma linha (Figura 11). Para confirmar o sucesso photoconversion, post-photoconversion foram tomadas imagens e photoconverted Eos nas células da medula espinhal ventral no local da linha de interesse que atraímos foram visualizadas (Figura 11). Sinal de Eos non-photoconverted era visível em todas as outras áreas. Para estender esta técnica fomos imagens idênticas 24 horas após o photoconversion. Nestas imagens, células de Eos+ photoconverted foram vistas espalhados em toda a região da medula espinhal em posições dorsais e ventrais (Figura 12). Estes dados são consistentes com a hipótese de que as células da coluna ventrais mudou-se para locais dorsais como anteriormente descrito10. Juntos, essas duas técnicas demonstram essa photoconversion de Eos pode ser utilizada para visualizar células únicas ou populações de células dentro de uma região de tecido de uma forma definida pelo usuário. Isto contribuiu para uma melhor compreensão das características celulares tais como migração celular, comunicação e dinâmica.
Figura 1 : Capturar e concentrar-se Windows. Screenshot do software mostrando a localização do windows captura e foco e laboratório específico "Peixe ablate chip completo" drop-down guia. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : parâmetros de Laser c488. Imagem da janela de captura, mostrando os parâmetros específicos para o laser c488. A exposição é de 300 ms. poder do Laser é 5. Intensificar é 75. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Parâmetros do Laser Photoconversion. Screenshot da guia photomanipulation na janela foco delineando as configurações específicas do laser necessário para photoconversion. Poder Laserstack é 2. Clique duas vezes o tamanho é 4. Tamanho do bloco de raster é 1. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Photoconversion Laser parâmetros avançados. Captura de tela das configurações avançadas do laser na janela de captura. Isto abre a janela de preferências de captura com guia photomanipulation. As repetições de clique duplo é definido como 2. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Pré-conversão de parâmetros de imagem. Screenshots do windows foco e captura. Destaca os parâmetros específicos de captura janela necessários para pré-conversão tratamento de imagens. A configuração de captura é uma "Imagem de peixe." A caixa 3D é verificada sob o tipo de captura. E as configurações de captura 3D são especificadas como; Intervalo é de 35, número de aviões é 36, passo tamanho é 1, e deslocamento -15. As caixas "variam em torno de corrente" e "posição atual" também são selecionadas. Ver caixas vermelhas. Descreve como selecionar um ou vários pontos na janela de captura (à esquerda) e como selecionar pontos individuais na janela do foco (à direita). Ver caixas verdes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Abrir a janela de Photoconversion. Captura de tela mostrando o tipo de captura de timelapse é selecionada de acordo com parâmetros previamente definidos. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Configurando o Photoconversion. Captura de tela mostrando a localização da ferramenta círculo (topo) e a janela de controle de captura que aparece (à direita). Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Photoconversion de célula única. Captura de tela mostrando o uso da ferramenta de photoconversion do círculo e o botão direito menu suspenso. A ação de conversão de "FRAP todas as regiões" situa-se o botão direito menu drop-down. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Parâmetros de post-Photoconversion c561Laser. Imagem da janela de captura, mostrando os parâmetros específicos para o laser c561. A exposição é de 500 ms. poder do Laser é 10. Intensificar é 75. Ver caixas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Photoconversion de célula única. (A). z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 hpf apresentando gânglio da raiz dorsal no sistema nervoso periférico antes photoconversion. Linha tracejada indica a localização aproximada da entrada de medula espinhal DRG... (B). z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 hpf apresentando gânglio da raiz dorsal no sistema nervoso periférico durante photoconversion. Linha tracejada indica entrada de medula espinhal DRG. Círculo amarelo indica local de conversão e iluminação indica a exposição à luz UV. C. z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 hpf apresentando gânglio da raiz dorsal na borne-photoconversion do sistema nervoso periférico. Linha tracejada indica entrada de medula espinhal DRG. CNS é uma abreviatura de sistema nervoso central e PNS é uma abreviação para sistema de nervoso periférico (A-C). Barra de escala é igual a 10.... Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 : Photoconversion procedimento numa região medular maior. (A). z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 OPCs apresentando hpf e gânglios das raízes dorsais na região ventral da medula espinhal, antes de photoconversion. Linha tracejada indica a região dorsal da medula espinhal. (B). z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 OPCs apresentando hpf e gânglios das raízes dorsais na região ventral da medula espinhal durante photoconversion. Linha amarela contínua indica a área selecionada para photoconversion. Linha tracejada indica a região dorsal da medula espinhal. C. z-projeções esquemáticas e confocal de zebrafish Tg(sox10:eos) em 48 OPCs apresentando hpf e gânglios das raízes dorsais na região ventral da medula espinhal após photoconversion. Linhas tracejadas indicam a região dorsal da medula espinhal. Barra de escala é igual a 10....
Figura 12 : Celular rastreamento e visualização post-photoconversion. (A). esquemático de zebrafish do Tg(sox10:eos) da medula espinhal em 48 OPCs apresentando hpf e gânglios das raízes dorsais na região ventral da medula espinhal após photoconversion. Raio indica conversão de luz UV. B. Confocal z-projeções de Tg(sox10:eos) zebrafish medular começando em 48 OPCs apresentando hpf e gânglios das raízes dorsais na região ventral da medula espinhal após photoconversion. Raio indica conversão de luz UV. Barra de escala é igual a 10....
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Discussion
Em tecidos complexos, distintos tipos de células organizam em domínios específicos. Recentemente, as técnicas têm sido utilizadas para células individuais de etiqueta dentro destes tecidos grandes estruturas1,2,3. Aqui vamos demonstrar duas técnicas que podem ser utilizadas da mesma forma para visualizar tanto interações célula única e interações de população celular dentro de tecidos complexos. A vantagem da técnica photoconversion é o controle espacial, que o cientista tem que rotular distintamente uma célula. Com um microscópio que tem a capacidade de expor menores de imagens áreas dentro da janela de imagem maior, tão pequeno como células únicas ou áreas de células únicas podem ser rotuladas de forma diferente de outras células. Várias proteínas photoconvertible agora foram introduzidas para a Comunidade, tornando esta a mais difundida técnica7. Com a capacidade de photoconvert proteínas dentro das células, os cientistas têm utilizado esta técnica ou abordagens semelhantes para investigar a migração celular, diferenciação celular e análise de circuitos neurais.
Embora o software e os parâmetros específicos do laser são específicos para o nosso laboratório, este artigo demonstra a capacidade universal de usar a proteína photoconvertable Eos em distinguir células únicas dentro de um gânglio. Infelizmente, a maioria dos normativas regiões genéticas que podem ser utilizadas para perfurar proteínas fluorescentes expressa amplamente dentro dos gânglios das primeiras fases do desenvolvimento. Isto é provável porque estas células são geradas a partir de pools de progenitoras similares e os marcadores de identificam essas progenitoras Estados9. É, portanto, difícil de visualizar as interações de células únicas os gânglios maiores durante esses estágios de desenvolvimento mais cedo. As abordagens mostradas aqui representa uma técnica que pode rotular células individuais dentro de um gânglio e, portanto, poderia ser usada para dissecar questões científicas sobre desenvolvimento de gânglios.
No entanto, esta técnica de photoconversion não está limitada a estudos de desenvolvimento de gânglios. Por exemplo, em estudos de regeneração, photoconversion das condições pré-lesão pode ser utilizado para determinar como específicos as células dentro de uma resposta do gânglio após lesão. Estes estudos podem ajudar a elucidar o potencial como progenitor de células específicas em um gânglio. Da mesma forma, photoconversion de células tumorais específicos e acompanhamento dessas células ao longo do tempo poderiam revelar Propriedades de células únicas dentro complexos tumores. Esta aplicação de uma única célula photoconversion expande-se, portanto, o potencial da técnica de fazer descobertas significativas na Comunidade biomédica.
Esta abordagem também seletivamente rotular as células dentro de uma área da medula espinhal. Em desenvolvimento, células migram frequentemente de áreas de precursor para produzir células diferenciadas maduras locais11,14. Mapeamento de destino a longo prazo com Cre tem sido utilizado eficazmente para dissecar tais processos. Com técnicas de Cre, resolução espacial é limitada às regiões genômicas regulamentares que impulsionam Cre transcrição15. Com photoconversion, esta resolução espacial pode ser alcançada juntamente com a capacidade de escolher o tempo quando ocorre a photoconversion e a resolução temporal. Portanto, para mapeamento-destino de prazo mais curto, essa técnica de photoconversion tem muitas vantagens sobre o destino de Cre-mapeamento. No entanto, em amostras onde a luz UV não pode ser facilmente alcançada, como em um mouse intacto, esta abordagem photoconversion é improvável que funcione15. Além disso, mapeamento de destino Cre permanentemente rótulos células permitindo a mais longo prazo mapeamento de destino do que photoconversion que perde seu rótulo como se dissipa a versão photoconverted da proteína e proteína não convertida nova é produzida pela célula. No entanto, dependendo da questão científica, photoconversion pode ser uma ferramenta útil para o mapeamento de destino de populações de células.
Embora apenas dois exemplos da aplicação do photoconversion são fornecidos, numerosos estudos têm demonstrado a sua eficácia. Dependendo da precisão espacial necessária, photoconversion pode ser realizada com acesso a uma fonte de luz UV. Se o desejo é de rótulo único mais avançados de imagem como microscopia confocal ou dois fotões de células podem ser necessárias. No entanto, a capacidade de selecionar a área espacial e temporal de pilhas etiquetadas distintamente de outras células dentro de um tecido intacto fez photoconversion UV-induzida uma técnica poderosa para dissecar questões biológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Bernard Kulemaka e membros do laboratório de Smith para seus comentários úteis e orientação de reagente, Sam Connell e Brent Redford de 3i para responder perguntas de imagem e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart para cuidados de zebrafish. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Notre Dame, a Elizabeth e Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigação de Zebrafish na Universidade de Notre e centro de células-tronco e medicina regenerativa da Universidade de Notre Dame. Todos os estudos animais foram feitos em conformidade com a Universidade de Notre Dame IACUC ao Dr. Cody Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
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