Summary
本文的目的是提出一步一步的程序, 收集不同的白脂肪组织的小鼠, 处理脂肪样本和提取 RNA。
Abstract
与其他组织相比, 白脂肪组织的 RNA 和蛋白质含量在诸如实时 PCR 和西方印迹等下游应用中有相当少的成分, 因为它主要含有脂类。RNA 分离从脂肪组织样本也有挑战性, 因为需要额外的步骤, 以避免这些脂质。在这里, 我们提出了一个程序收集三从小鼠解剖不同的白色脂肪组织, 以处理这些样本和执行 RNA 隔离。我们进一步描述了用实时 PCR 技术合成 cDNA 和基因表达实验。本协议允许减少动物的头发和血液对脂肪垫的污染, 以及在组织收集期间不同的脂肪垫之间的交叉污染。它也被优化, 以确保足够数量和质量的 RNA 提取。该协议可广泛应用于任何小鼠模型, 其中脂肪组织样本需要进行常规实验, 如实时 PCR, 但不打算与原发脂肪细胞培养分离。
Introduction
肥胖是一种世界性的流行病, 可能导致并发症, 如2型糖尿病1。饮食诱导的肥胖和转基因动物模型经常用于肥胖及其相关并发症的研究。传统上, 白脂肪组织被称为过剩能量的储存室, 主要由脂质组成, 而褐色脂肪组织将能量转化为热能2,3。脂肪组织是动态的, 并将扩大和收缩取决于许多因素, 如食物摄入量和体力活动。因此, 为了确定促成这些变化的因素, 需要有足够的脂肪组织收集和处理4。
在白色脂肪组织中, 一般认为皮下和内脏脂肪库有不同的性质, 如解剖定位和功能2,5。因此, 为了避免产生冲突的结果或大的变异性, 需要注意避免这些不同的脂肪库之间的交叉污染收集脂肪垫。
此外, 从小鼠白脂肪组织中分离 RNA 或蛋白质有三大挑战。首先, 在肥胖小鼠身上收集脂肪垫并不是一件容易的事, 因为与其他器官如肾脏和心脏6相比, 不同的白色脂肪库的边界并不总是清晰的。其次, 由于脂肪组织的高脂质含量, 在 RNA 或蛋白质分离期间, 一层油脂漂浮在顶部, 防止直接进入样品。第三, 相对于褐色脂肪组织或其他组织, 白脂肪组织有相当低的 RNA 和蛋白质含量, 这是主要的关注, 当使用小鼠, 喂食正常 (N) 饮食和小鼠, 预计将有低脂肪质量 (即KO 模型, 药物治疗, 运动训练等)7,8。
因此, 选择适当的方法分离 RNA 从脂肪组织是关键的。苯酚/氯仿萃取的替代方法是商业套件。它们通常基于最初的苯酚提取步骤, 然后在一列9上进行 RNA 纯化。然而, 这些套件通常更昂贵, 并提供较低的产量样本, 而 RNA 质量可能是可变的, 但更少的时间消耗。然而, 这里所描述的苯酚溶液/氯仿萃取的最大优点之一是可能从单个样本10中分离出 RNA、DNA 和蛋白质。由于小鼠脂肪垫通常是小的, 并给出少量的 RNA 和蛋白质 (特别是在精益小鼠模型), 这些协议最大化的数据, 你可以得到一个小样本。
本文的目的是详细描述一个方法, 以确保足够的样本收集从三小鼠白脂肪组织仓库, 以及数量和质量的 RNA 隔离。通过遵循该协议获得的 RNA 可用于实时 PCR 检测。该协议不是为了 RNA 分离培养的原发脂肪细胞。
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Protocol
在该程序中使用的小鼠的护理符合加拿大动物保护委员会规定的实验动物的护理和使用标准。所有的程序都由大学动物保护和使用委员会在密友研究中心批准。
1. 雄性小鼠尸检和脂肪组织的收集
- 根据学习目标制作实验组。本研究从两组雄性小鼠的 C57Bl/6 背景 (n=12-14/group) 中采集样本。确保在这里使用的小鼠有12-15 周的年龄, 并且在12小时的光照/暗循环中保持正常 (N) 或高脂肪 (HF) 饮食和水的ad 随意, 为期10周,11。
- 通过将鼠标放置在一个密封的腔中, 在10分钟内接触到 6% CO2 , 安乐鼠标。
- 执行心脏穿刺, 慢慢插入一个1毫升注射器安装与 26G 1/2 宝针刚刚在动物的胸骨左侧, 并慢慢拉动活塞, 以消除大部分动物的血液。确保注射器与动物的身体平行。如果血液不进入注射器, 在拉动活塞的同时慢慢旋转注射器。
注意:成功的心脏穿刺 (0.8 和1毫升血容量) 将减少脂肪组织的血液污染。 - 将鼠标放在背上, 用22G 针将每个爪子固定在垫子上, 如图 1所示。
- 用纱布, 用酒精摩擦老鼠的皮肤, 从颈部一直到生殖器官, 通过单向运动, 这样可以确保头发保持扁平, 减少脂肪组织样本的毛发污染。没有脱毛。
- 使用干净但不消毒的镊子和外科剪刀, 提高生殖器官附近的中央皮肤, 并做一个小0.3 毫米切口。
- 将剪刀水平插入到打开的孔中, 并将腹部的皮肤从腹壁中分离出来。
注意:这是通过在皮肤和腹壁之间的空间的钝解剖, 而不是通过切割在这个空间发现的膜。 - 使用镊子, 提高中央皮肤附近的打开孔, 并削减皮肤的式阿尔巴, 直到你靠近肋骨笼 (〜4厘米取决于鼠标大小)。
注意:避免切割腹部肌肉, 因为这可能暴露内脏脂肪组织的空气和导致干燥的脂肪垫, 这可能会改变完整性的组织及其内容。 - 从肋骨中间, 将皮肤朝右手臂的2厘米方向切开。从生殖器官附近, 将右后肢上的皮肤切成2厘米。
- 伸展开的皮肤的一个角落, 用22G 针把它钉在垫子上。与另一个角落重复。
注意:暴露在皮肤上的脂肪组织是腹部皮下脂肪 (图 1A)。 - 通过钝的解剖和切割它从皮肤上使用的外科剪刀的位置尽可能平坦的皮肤。一旦收集, 将在预先确定的铝箔的流体流量。
注意:收集或污染脂肪组织与皮肤或头发将改变样品质量和 RNA 产量由于 RNases。如果花太多时间收集脂肪组织, 样品也可以干燥, 也可以改变样品的质量。 - 在动物的左侧重复步骤1.9 到1.11。将左、右脂肪垫放入铝箔中, 并将样品冷冻在液氮中。
- 要进入内脏脂肪组织, 用干净但不消毒的手术剪刀和钳沿式阿尔巴切割腹部肌肉, 在〜4厘米, 根据鼠标大小, 从生殖器到肋骨笼。然后做一个切口在腹部肌肉从生殖器往后面的老鼠在 ~ 2.5 cm 有通入腹部器官的边。
- 生殖器官周围的脂肪是围性腺脂肪 (PGF) (图 1B)。当 PGF 附着在附睾、睾丸和输精管上时, 小心地将左脂肪垫从这些结构上分离出来, 并放在预先识别的铝箔上。对右手边重复。一旦两个 PGFs 收集, 冷冻样品在液氮。
- 从左手边开始, 通过将肠道从腹腔移到右手边来暴露肾脏。围绕肾脏的脂肪组织是围肾脂肪 (重复脉冲) (图 1C)。重复脉冲也围绕肾上腺 (图 1D)。
- 在收集脉冲前分离和切除肾上腺。这可能是单调乏味的, 因为它们只是比脂肪组织的一点点的粉色。
注意:在这一步中, 肾脏不应被移除, 因为血液可能会污染脂肪组织, 使它更难以识别这个脂肪垫内的肾上腺。 - 从背部的肌肉壁中分离出脉冲, 以切断输尿管、肾动脉和静脉, 从而将重脉冲和肾脏与身体其他部分分开。通过切除肾囊和切除肾脏来分离肾脉冲。重复频率脉冲保持附在胶囊。
- 对右手边重复步骤1.15 和1.17。在铝箔中放入两个重复脉冲, 并将样品冷冻在液氮中。
- 重复步骤1.2 至1.18 的所有小鼠要收集的过程。
- 在这一点上, 进行脂肪组织研磨或储存样品在一个-80 ° c 冰箱后提取。样品可以稳定地被存放在-80 ° c 几年4。
2. 用于 RNA 分离的地面白脂肪组织的制备
注意:每一个步骤都要戴上手套, 因为皮肤含有 RNases, 可以促进 rna 的降解, 因此, 分离后的样品质量和 rna 的产量都会改变。
- 准备和识别三无核糖核酸1.5 毫升锥形螺旋帽管每只老鼠, 一个为每种类型的白色脂肪组织, 并把它们放在一个架子上。
注意:肥胖动物可能需要额外的管, 因为它们增加了脂肪的质量。这是特别正确的, 为7管为一只老鼠获得了。 - 用70% 乙醇清洁工作台, 并在表面上放一张干净的新的台式纸。
- 脂肪组织是否新鲜地从小鼠收集或预先储存在一个-80 ° c 冷冻库, 收集所有样品在一个液态氮填充容器, 直到程序开始。
- 将砂浆、杵和刮刀放在液氮容器中, 将其冷冻。当液氮停止 "沸腾" 时, 可以启动脂肪组织的研磨。
注意:从这一步, 砂浆, 刮刀, 锥形管和脂肪组织需要保持冷藏在整个过程中。任何热量都会融化脂肪组织, 使其难以提取 RNA。此外, 如果使用陶瓷砂浆和杵, 你可以使用干冰和/或液氮来保持它的冷。 - 将所有核糖核酸的1.5 毫升锥形螺旋帽管准备在2.2 步, 在干冰冷却下来。
- 为了避免手上的将, 用几层棕色的纸把砂浆从液氮中抬起, 放在工作台上。
- 使用镊子收集从液氮的脂肪组织样本, 并把它放在砂浆。迅速打开铝箔, 并把样品放在砂浆的中心。
注意:如果脂肪组织样本太大, 如肥胖小鼠的情况下, 用拇指在铝箔的小零件中分解样品, 然后分别粉碎每个部分。 - 用几层棕色的纸把杵从液氮中抬起, 然后放入砂浆中。用棕色的纸拿杵, 用锤子击打杵的顶端一两次。用旋转的动作将杵压在迫击炮上, 研磨样品, 直至获得细粉。
注意:此步骤对于获得足够的 RNA 隔离至关重要。事实上, 存在较大的碎片会阻碍 RNA 的分离和降低产量。 - 一旦获得了细粉, 取出杵和拾起从液氮的刮刀, 并使用它转移到相应的预冷1.5 毫升锥管样品。
注意:不时地将刮刀浸回液态氮, 以防样品熔化。此外, 保持锥形管在干冰总是防止样品解冻。在足够的 RNA 产量和数量上, 需要一个充满地面样品的锥形管, 大约2/3 容量 (约1毫升)。 - 一旦填充到约1毫升, 关闭管, 并把它放到其他液体氮填充容器。
注意:多余的样品可以放在单独的预冷核糖核酸1.5 毫升锥形管, 并储存在一个-80 ° c 冷冻后使用。 - 用褐色的纸擦拭砂浆、杵和刮刀, 以避免携带到下一个脂肪组织样品中。把杵和刮刀放回液氮中冷却。即使棕色纸不是核糖核酸的, 我们还是用一包新开的牛皮纸为每一天的 RNA 隔离。
- 在下一个示例中重复步骤2.4 到2.11。
- 一旦所有样品被处理, 开始 RNA 隔离或存放样品在一个-80 ° c 冰箱为以后使用。
注意:为了防止管子爆裂, 通过将样品箱完全浸入液氮容器来冷冻。当冷却足够的时候, 从盒子中除去多余的氮, 让它漂浮在液态氮的顶端。将样品放入盒子中, 放入-80 ° c 的冷冻柜中。
3. RNA 与地面脂肪组织的分离
警告:苯酚溶液对皮肤有害。穿上实验室大衣、手套、安全眼镜, 并在化学罩下执行程序。分步流程图如图 2所示。
- 准备和识别两套无核糖核酸1.5 毫升锥形管, 并把它们放在一个架子上。
- 无论脂肪组织是新的地面或预储存在一个-80 ° c 冰箱, 收集所有样品在一个液态氮填充容器, 直到开始的程序, 这是主要在室温下完成。
- 用镊子从液氮中选择一个地面脂肪组织样品, 并将其放入管架中。该管应含有〜1毫升的粉末, 这相当于约100毫克的组织粉。
- 慢慢打开管子
注意:由于氮气的压力会从试管中逸出, 所以在室温下关闭封闭管或太快打开管盖可能会导致样品丢失或受伤。 - 在样品中加入500µL 苯酚溶液 (1:2 比苯酚溶液: 组织粉)。
- 关闭管的盖子和漩涡的最大速度约5秒. 慢慢地, 小心地打开管子, 释放来自氮气的压力 (从管子里出来的空气声可以听到)。
- 重复步骤3.5 和3.6。最后的苯酚溶液体积增加到样品是1毫升。
- 重复步骤3.6 直到样品完全溶解。
注意:重要的是要释放所有的压力, 从管, 然后再继续, 以防止管爆裂。 - 让样品在室温下站立, 同时重复步骤3.4 至3.8 为下一个样品。
- 一旦所有样品被处理, 简要地漩涡在最大速度和孵育所有样品5分钟在室温。
- 离心机10分钟在 12 000 x g 在4° c。把管子带回室温
注意:离心后, 3 阶段存在, 如图 2所示: 脂肪 (顶部), RNA (中) 和颗粒 (底部)。 - 对于每个样品, 转移尽可能多的 RNA (中间粉红色层) 尽可能进入第一套相应的管与 P1000 吸管使用过滤尖端。更改示例之间的提示。
- 为了确保由脂质 (顶层) 的 RNA (中间层) 的最小污染, 刺穿顶部与尖端附近的管侧。将 RNA 放入新的锥形管中, 而不接触新管的侧面, 以防止可能出现在尖端外部的脂质转移。
- 将200µL 的纯氯仿添加到每个样品中, 并由十五年代的反转混合. 室温下孵育10分钟。
- 离心机15分钟在 12 000 x g 在4° c 并且使管子回到室温。
注意:离心后, 3 阶段存在: RNA (顶部), 其中含有 DNA (中) 和红色酚-氯仿, 其中含有蛋白质 (底部) 的相间。 - 对于每个样品, 转移尽可能多的含水的透明 RNA 包含相 (顶相) 的第二套相应的锥形管与 P1000 吸管使用过滤-提示。在每个示例之间更改提示。
注意:这种界面是脆弱的, 如果吸入的速度过快, 可能会污染顶部的阶段。作为替代方案, 使用 P200 吸管来减少干扰界面的几率。 - 在每个样品中加入500µL 100% 异丙醇, 并通过反相混合 15 sec。
- 室温孵育10分钟
- 离心机10分钟在 12 000 x g 在4° c 并且使管子回到室温。通过倒置每根管子来丢弃异丙醇。
注意:一个小的白色 RNA 颗粒通常可以看到, 但有时可能不会。 - 加入1毫升的75% 乙醇 (从100% 乙醇和无核糖核酸的水中制备) 到每个样品, 并在最大速度下短暂地涡流每管。
- 离心机5分钟在 7 500 x g 在4° c 并且使管子回到室温。
- 将每根管子倒置, 然后轻拍一张棕色的纸, 去掉剩下的75% 乙醇。
注意:如果需要, 使用过滤头, 以消除酒精附近的 RNA 颗粒。在示例之间更改提示。 - 把盖子打开, 空气干燥的 RNA 颗粒约15-20 分钟。
注意:在这一步, RNA 小球可能变得半透明。 - 由于 rna 的增溶从颗粒的大小依赖, 评估大小的颗粒, 以确定的体积核糖核酸无水将用于溶解的 rna。记下每个样本的音量 (10 到25µL)。
注意:这一步只是定性的。如果不能看到 rna 颗粒, 在样品中加入10µL 的无 rna 水。 - 在每个样品中加入10-25 µL 的无核糖核酸水 (在步骤3.24 前确定的体积)。
- 在60° c 的热块中孵育样品5分钟。简要地漩涡管子。
- 在60° c 的同一个热块中孵育一个额外的5分钟样品。
- 快速旋转所有的样品在一个微型旋转离心机和立即投入冰。
- 确定 RNA 的浓度和纯度。执行反向转录 (RT), 以获得 cDNA 或存储在一个-80 ° c 冰箱样品, 以备日后使用。
注意:避免多次冻结/解冻周期, 因为这会降低 RNA 样本。
4. 脂肪组织 RNA 浓度和纯度的测定
- 是否新鲜提取脂肪组织 RNA 样品, 溶解或预储存在一个-80 ° c 冰箱, 收集所有样本, 并允许他们解冻的冰, 直到程序开始。这应该在下一个步骤开始之前或隔离结束时进行, 以避免多次冻结/解冻循环。
- 准备和识别两套无核糖核酸1.5 毫升锥形管, 并把它们放在一个管架。
- 当所有的 RNA 样品都完全解冻后, 将样品涡旋1秒, 放回冰上。
- 稀释你的 rna 100 倍在 1x te 解决方案中的第一套核糖核酸1.5 毫升锥形管使用过滤核糖核酸免费提示 (99 µL 1x te 溶液和1µL RNA 的管)。
- 对每个示例重复此操作。
注意:根据所使用的试管, 每个分光光度计的体积可能不同。 - 一旦所有样品被处理, 漩涡每个稀释的样品。
- 按照分光光度计的协议, 在处理稀释的 RNA 样品之前使用空白 (1x TE) 来校准仪器。
- 将稀释的 RNA 样品转移到石英试管, 并测定每个样品在 260 nm 的浓度。
注意:如果分光光度计不提供最终的 rna 浓度, 使用此公式计算: rna (µg/µL) = OD260 x 稀释因子 x (40 µg RNA/1 000 µL)。 - 通过计算260/外径280的比率, 确定每个样本的 RNA 纯度。
注意:外径为260/外径280的比率在2.0 左右通常被视为纯为 RNA12。强烈建议对 RNA 质量进行验证。为了做到这一点, 把1µg 的 RNA 的1% 琼脂糖漂白凝胶制成的1x 的缓冲区 (89 毫米三碱, 89 毫米硼酸和2毫米 EDTA, pH 8.0) 和1% 漂白溶液13 (图 3)。非常好质量的 RNA 显示28S 和 18S rRNA 带和28S 带应该比18S 更加强烈。RNA 质量是可以接受的, 当两个 rRNA 波段是可见的, 在一个类似的强度。当18S 波段比28S 波段更剧烈时, 当涂片可见时, rna 质量就变得不足, 表明 rna 降解。 - 为每个样品, 准备10µL 0.5 µg/µL 的 RNA 从股票在第二套核糖核酸1.5 毫升锥形管使用无核糖核酸水, 以稀释样品的需要。这些样品用于 RT 获得 cDNA。
- 一旦所有样品被处理, 启动 RT 或存储在一个-80 ° c 冷冻库样品, 以备日后使用。
5. 反向转录 (RT)
- 脂肪组织 RNA 样品是否刚被稀释到0.5 µg/µL 或预贮存在-80 ° c 的冷冻库中, 收集所有样品和试剂, 并允许它们在冰上解冻直至程序开始。
- 将 PCR 管条架放在冰上。一旦足够冷准备和识别一组无核糖核酸 PCR 管条, 并把它们放在机架上。包括一个空白。
- 为 RNA 的 dnasei 处理准备反应: 做一个主混合 (为所需的样品量 + 1 样品) 以下 (数量为1样品): 1 µL 10X 反应缓冲器与氯化镁2, 0.5 µL dnasei I (1 U/µL) 和7.5 µL 的核糖核酸-自由水使用过滤-提示。每管中分配9µL。
- 添加1µL 0.5 µg/µL 的 RNA 从每个样本到相应的管, 把每条带子上的帽子和快速旋转所有的小条在一个迷你旋转离心机, 使样品到底部的管。为空白添加1µL 的无 RNA 水。
- 在37° c 的热循环或加热块上孵育所有管条, 30 分钟, 将管条放回冰上的机架上。
- 在每根管子上加1µL 的 EDTA (50 毫米), 在热循环或65° c 的加热块上孵育所有的管条, 10 分钟. 把管条放回冰上的架子上。
- 做一个主混合 (为所需的样品数量加1样品) 以下 (数量为1样品): 1 µL 随机 hexamers (0.2 µg/µL) 和1µL 的 dNTP 混合 (包含每四 deoxynucleotides 的浓度 10 mM)。免除2µL 的主混合在每个管使用过滤提示。在示例之间更改提示。
- 在65° c 的热循环或加热块上孵育所有管条, 5 分钟, 将管条放回冰上的机架上。
- 做一个主混合 (为所需的样品数量加1样品) 以下 (数量为1样品): 4 µL 5x RT 缓冲器, 1 µL 核糖核酸抑制剂 (20 u/µL), 0.25 µL 反转录酶 (200 u/µL) 和1.75 µL 无核酸水。使用过滤后的小贴士, 在每管中免除7µL。在示例之间更改提示。
- 通过设置以下程序在热循环中执行 RT:10 分钟在25° c, 30 分钟在50° c, 5 min 在85° c。把管子条放回冰上的架子上。
- 准备并识别一组无核糖核酸的 PCR 管条, 并将其放在机架上。
- 对于每个样品, 用超纯水将新管条中的1:5 稀释的 cDNA 的数量准备好。1:5 稀释的 cDNA 样本将用于实时 PCR。
- 一旦所有样品被处理, 启动实时 PCR 或储存样品 (库存和稀释样品) 在一个-20 ° c 冰箱后使用。
6. 脂肪组织中基因表达的实时 PCR
注意:避免将荧光染料暴露在光线下。下面的协议描述了 s1614的参考基因的放大。应根据感兴趣的基因对引物和 PCR 条件进行修改。
- 无论是新稀释的 cDNA 样本1:5 或预储存在一个-20 ° c 冰箱, 收集所有的样品和试剂, 让他们解冻的冰, 直到程序开始。
- 在冰上放置实时 PCR 管条的机架。一旦足够冷准备和识别一组实时 PCR 管条, 并把它们放在机架上。准备每个样品和空白的一式两份。
- 做一个主混合 (为所需的样品数量加1样品) 以下 (数量为1样品): 1.9 µL 的超纯水, 5 µL 的荧光染料 (如 SYBR 绿色) 和0.3 µL 的前引物和0.3 µL 的反向底漆。每管中分配7.5 µL。
- 从每个样本中添加2.5 µL 1:5 稀释的 cDNA 到相应的管中。为毛坯添加2.5 µL 的超纯水。把帽子放在每个小条上。
- 按照制造商的指示, 在实时 PCR 上设置以下程序:10 分钟在95° c 和40个周期十五年代在50° c, 三十年代在60° c, 三十年代在70° c。将样品带放入实时 PCR 机的转子, 启动程序。
注意:热循环条件可能因所使用的仪器和感兴趣的基因而异。mrna 表达的结果在图 3显示的瘦素 mrna 扩增的参考基因 S16 mrna 放大14,15。
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Representative Results
按照尸检程序, 三白脂肪组织收集和加权两组小鼠 (N 和 HF 饮食喂养小鼠)。正如预期的那样, HF 饮食中的小鼠在 N 饮食 (表 1) 上与窝相比, 增加了最终体重和体重增长。这些观察伴随着超过2倍的体重增加的 PGF, 重复频率和超重的肥胖小鼠相比, 在 N 饮食。
在对分离的 RNA 进行任何实验之前, 它的纯度被评估如步骤4.9 所述。对于每个白色脂肪组织, 由苯酚溶液 rna 分离产生的样品具有足够的质量, OD260/OD280 是大约 2.0, 这被认为是纯粹的 rna (表 2)。实时 PCR 数据显示, 与 N 饮食 (图 4A) 相比, 肥胖小鼠的 PGF、重复脉冲和血清瘦素 mRNA 的表达明显增加。事实上, 在瘦素 mRNA 表达中观察到的差异并不是由于 s16 的变异, 这是用于标准化结果的参考基因, 两组小鼠之间的 Ct 值没有改变 (图 4B)。因此, 当 HF 饮食是研究协议中的一个参数时, s16 可以被可靠地用作 PGF、重复脉冲和临界流体中 mRNA 表达的参考基因。
图 1.小鼠白脂肪组织的解剖定位.对 N 饮食的雄性小鼠进行解剖, 以显示每个脂肪组织库和肾上腺的定位。(A), PGF (B), 脉冲重复频率(C)和肾上腺(D)。PGF, 围性腺脂肪;脉冲, 围肾脂肪;腹部皮下脂肪请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.RNA 隔离协议流程图使用苯酚溶液.将 RNA 从接地的白色脂肪组织中分离出来所需步骤的示意图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.漂白凝胶的 RNA 质量评价。在1% 琼脂糖漂白凝胶中, 用电泳法分离出从皮下脂肪和周围性腺脂肪 (PGF) 中分离出的1微克 RNA。28s 和 18s rRNA 通过 UV 透视进行可视化。在凝胶是 RNA 分离从 PGF 和老鼠哺养正常饮食。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.HF 饮食对白脂肪组织中瘦素和 s16 mRNA 表达的影响.瘦素(A)和 s16 (B) mRNA 表达式。瘦素的数据被正常化为 s16 mRNA 水平, 而 s16 的数据显示为 Ct 值, 两者均为平均± SE, 每组为n = 12-13。* p < 0.05 与 N 饮食相比。N, 正常;HF, 高脂肪;PGF, 围性腺脂肪;脉冲, 围肾脂肪;腹部皮下脂肪这个数字已被修改, 从谭, P. et al, 肥胖 (2014) 22, 2201-2209。请单击此处查看此图的较大版本.
| N 饮食 | HF 饮食 | |
| 最终体重 (g) | 37.5 ±1。3 | 46.7 ± 1.7 * |
| 重量增益 (g) | 6.6 ±0。7 | 16.7 ± 1.0 * |
| PGF (g) | 1.08 ±0.17 | 2.19 ± 0.15 * |
| 重复脉冲 (g) | 0.79 ±0.15 | 1.71 ± 0.06 * |
| (g) | 1.62 ±0.35 | 3.55 ± 0.20 * |
表1。HF 饮食对机体和白脂肪组织重量的影响。值的表达方式为n = 14-15 每组。* p < 0.05 与 N 饮食相比。N, 正常;HF, 高脂肪;PGF, 围性腺脂肪;脉冲, 围肾脂肪;腹部皮下脂肪这个数字已被修改, 从谭, P. et al, 肥胖 (2014) 22, 2201-2209。
| 样品 | 比 OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| 脉冲频率1 | 1.95 |
| 脉冲频率2 | 2.08 |
| 脉冲频率3 | 2.08 |
| 1 | 2.04 |
| 2 | 2.02 |
| 3 | 2.06 |
表2。从白色脂肪组织分离后的 RNA 纯度。 n = 每脂肪组织3。PGF, 围性腺脂肪;脉冲, 围肾脂肪;腹部皮下脂肪
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Discussion
随着 HF 饮食喂养, 肥胖小鼠发现有增加的身体和白脂肪组织重量相比, 喂食一个 N 饮食小鼠。用苯酚溶液提取的 RNA 具有纯度好的样品。瘦素是脂肪主要由脂肪组织产生的, 并且与脂肪质量16呈正相关。正如所料, 瘦素 mRNA 表达增加的肥胖小鼠相伴与他们的脂肪质量。
此方法有几个关键步骤。主要一个是一个白色脂肪组织仓库的污染与另一个, 因为它是已知的不同的脂肪组织仓库有不同的功能2,5。污染会给下游应用带来误导性的结果。此外, 当脂肪在与空气接触时趋于干燥, 如果需要服用, 建议在老鼠之间定期和一致的速度收集白脂肪组织。否则, 脂肪垫的总重量可能不正确。为了获得良好的质量和产量的 RNA, 遵循最近发布的 MIQE 指南是一个明确的资产17。特别是, 在磨削过程中制作非常细的样品粉可以使产量最大化。这在 RNA 隔离期间最大化组织粉末和苯酚解答之间的联络。最后但并非最不重要的是 rna 包含层在 rna 隔离期间的隔离 (步骤 3.12)。因为脂肪比水密度小, 所以它被放置在感兴趣的阶段的顶端。减少脂肪的携带对降低下游应用的干扰是必要的。
这种方法的一个局限性是在过程中执行几个步骤所需的技能, 以及在 RNA 隔离期间使用有害试剂的需要。此外, 整个过程是劳动密集型。
除了通常由每位用户调整的小细节外, 在 RNA 分离之前, 脂肪组织的采集和样品处理方法没有多少替代品。在 rna 隔离的情况下, 许多选择是可用的, 如苯酚/氯仿萃取或 rna 隔离套件。每个选项都有优缺点, 用户可以根据下游应用程序选择最佳方法。苯酚/氯仿提取物成本较低, 但需要使用有害试剂, 且费时费力。RNA 隔离套件通常更昂贵, 但程序更快, 并通常产生质量和纯度好的样品。重要的是要考虑的产量和纯度的 RNA, 因为材料是有限的白色脂肪组织, 主要是由脂肪组成。使用苯酚溶液进行分离 (苯酚/氯仿萃取) 的主要好处是可以从单个样本18中分离出 RNA、DNA 和蛋白质。这是成本和时间效益, 因为它减少了需要获得足够的材料的老鼠的数量。如前所述, 脂肪质量在一些小鼠模型中是有限的。对这些小鼠来说, 不建议将地脂肪组织分成三份, 分别获得 RNA、DNA 和蛋白质, 因为这可能导致下游应用材料不足。为了规避这一问题, 也可以根据用户定义的标准, 将类似的脂肪组织库从几个小鼠聚集在一起, 从而导致需要的动物数量增加。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大糖尿病患者的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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