Summary
Le but de cet article est de présenter une procédure étape par étape pour rassembler différents les tissus adipeux blancs de souris, de traiter les échantillons de matières grasses et d’extraire des RNA.
Abstract
Par rapport à d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a une beaucoup moins teneur en ARN et des protéines pour des applications en aval comme la PCR en temps réel et Western Blot, puisqu’il contient surtout des lipides. Isolement d’ARN d’échantillons de tissus adipeux est aussi difficile que des mesures supplémentaires sont nécessaires pour éviter ces lipides. Nous présentons ici une procédure pour rassembler le tissu adipeux blanc trois anatomiquement différent de souris, pour traiter ces échantillons et effectuer des ARN. Nous décrivons plus loin la synthèse de cDNA et gène expériences d’expression à l’aide de la PCR en temps réel. Le protocole décrit par les présentes permet la réduction de la contamination de cheveux et de sang sur les coussinets adipeux ainsi que la contamination croisée entre les coussinets adipeux différents au cours de la collection de tissus de l’animal. Il a également été optimisé afin d’assurer une quantité adéquate et la qualité de l’ARN extrait. Ce protocole peut être largement appliqué à n’importe quel modèle de souris où des échantillons de tissus adipeux sont requises pour des expériences courantes comme la PCR en temps réel mais n’est pas prévu pour l’isolement de la culture de cellules primaires adipocytes.
Introduction
L’obésité est une épidémie mondiale qui peut conduire à des complications comme le type 2 diabète1. Induite par l’alimentation obèses et génétiquement modifiés des modèles animaux sont fréquemment utilisés pour la recherche dans l’obésité et ses complications associées. Traditionnellement, le tissu adipeux blanc est connu comme un compartiment de rangement pour excès d’énergie et est surtout composé de lipides alors que le tissu adipeux brun convertit l’énergie en chaleur2,3. Le tissu adipeux est dynamique et agrandira et rétrécir en fonction de nombreux facteurs tels que la prise alimentaire et l’activité physique. Par conséquent, pour déterminer les facteurs ayant contribué à ces changements, manutention et collecte adéquate du tissu adipeux sont requis4.
Parmi les tissus adipeux blancs, il est généralement admis que les dépôts de graisse sous-cutanée et viscérales ont des propriétés différentes comme la localisation anatomique et fonctionnent2,5. Par conséquent, pour éviter des résultats contradictoires ou grande variabilité, attention doit être prises pour éviter la contamination croisée entre ces différents dépôts de graisse lors de la collecte des coussinets adipeux.
En outre, il y a trois défis majeurs lorsque isoler l’ARN ou les protéines du tissu adipeux blanc souris. Tout d’abord, le collecte des coussinets adipeux chez des souris obèses n’est pas une tâche facile car la frontière qui sépare les différents dépôts de graisse blanches n’est pas toujours claire, contrairement à d’autres organes comme les reins et le coeur6. Deuxièmement, en raison de la teneur élevée en lipides du tissu adipeux, lors de l’ARN ou protéine isolation, une couche de lipides flotte sur le dessus et empêche l’accès direct à l’échantillon. Troisièmement, par opposition au tissu adipeux brun ou d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a considérablement plus faible teneur en ARN et des protéines et il s’agit d’une préoccupation majeure lors de l’utilisation de jeunes souris, souris nourries d’une normale (N) et souris qui sont censés ont faibles masses grasses (par exemple KO modèles, traitement par des médicaments, exercent de formation, etc..) 7 , 8.
Choisir la méthode appropriée pour isoler l’ARN du tissu adipeux est donc essentiel. Méthodes alternatives à l’extraction de phénol/chloroforme sont les kits commerciaux. Ils reposent généralement sur une étape d’extraction de phénol initiale, suivie de purification RNA sur une colonne9. Cependant, ces kits sont en général plus coûteuses et donnent des échantillons de rendement plus faible, tandis que la qualité de RNA peut être variable mais sont beaucoup moins de temps. Cependant, un des grands avantages de l’extraction de solution/chloroforme phénol décrite ici est la possibilité d’isoler l’ARN, ADN et protéine d’un seul échantillon10. Étant donné que les coussinets adipeux de souris sont généralement petits et donnent la petite quantité d’ARN et de protéines (en particulier dans les modèles de souris maigre), ces protocoles maximisent les données on peut sortir d’un petit échantillon.
L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode afin d’assurer un prélèvement adéquat de dépôts de tissu adipeux blanc trois souris ainsi que de quantité et de qualité des ARN. RNA obtenu en suivant ce protocole peut être utilisé pour effectuer des analyses par PCR en temps réel. Ce protocole n’est pas prévu pour l’isolement des adipocytes primaires cultivées.
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Protocol
Soins des souris utilisées dans les procédures respectées des normes pour le soin et l’utilisation des animaux fixés par le Conseil canadien pour la Protection des animaux. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme dans le centre de recherche du CHUM et de l’Université animalier.
1. l’autopsie et le tissu adipeux Collection de souris mâles
- Faire des groupes expérimentaux selon les objectifs de l’étude. Dans cette étude, les échantillons ont été prélevés de deux groupes de souris mâles sur un fond de C57Bl/6 (n = 12-14/groupe). Veiller à ce que les souris utilisées ici sont âgés de 12 à 15 semaines et sont gardées dans le cycle de lumière/obscurité de 12 h avec accès normal (N) ou alimentation riche en graisses (HF) et ad libitum d’eau pendant une période de 10 semaines11.
- Euthanasier une souris en plaçant la souris dans une enceinte étanche où elle est exposée à 6 % de CO2 pendant 10 min.
- Effectuer la ponction cardiaque en insérant doucement une seringue de 1 mL montée avec une aiguille de 1/2po de 26G juste à gauche du sternum de l’animal et en tirant doucement sur le piston pour enlever la plupart de sang de l’animal. Assurez-vous que la seringue est parallèle au corps de l’animal. Tournez lentement la seringue tout en tirant sur le piston, si le sang ne vient pas dans la seringue.
Remarque : Ponction cardiaque réussie (entre 0,8 et 1 mL sang volume) diminuera la contamination du tissu adipeux avec du sang. - Posez les souris sur son dos et la broche chaque patte sur le clavier à l’aide d’aiguilles de 22G tel qu’illustré à la Figure 1.
- Avec de la gaze, frotter la peau de la souris avec de l’alcool plusieurs fois à partir de l’encolure jusqu’aux organes génitaux en suivant un mouvement unidirectionnel car cela garantit que les cheveux reste plat et réduit la contamination de cheveux d’échantillons de tissus adipeux sans épilation.
- En utilisant propres, mais non stérile pinces et ciseaux chirurgicaux, élever la peau centrale près des organes génitaux et pratiquer une incision petite 0,3 mm.
- Insérez les ciseaux horizontalement dans le trou ouvert et détacher la peau abdominale de la paroi abdominale.
Remarque : Cela se fait par une dissection émoussée dans l’espace entre la peau et la paroi abdominale et ne pas en coupant les membranes trouvés dans cet espace. - À l’aide de la pince, élever la peau centrale près du trou ouvert et couper la peau sur les linea alba jusqu'à ce que vous êtes près de la cage thoracique (~ 4 cm selon la taille de la souris).
Remarque : Éviter de couper le muscle abdominal car cela pourrait exposer le tissu adipeux viscéral à l’air et entraîner pour le séchage des coussinets adipeux qui peuvent altérer l’intégrité du tissu et son contenu. - Depuis le milieu de la cage thoracique, couper la peau vers le bras droit sur environ 2 cm. De près les organes génitaux, coupe la peau au-dessus de la patte droite sur environ 2 cm.
- Étirer un coin de la peau ouverte et épinglez-le vers le bas sur le clavier à l’aide d’une aiguille de 22G. Répéter l’opération avec l’autre coin.
Remarque : Le tissu adipeux exposé sur la peau est la graisse sous-cutanée abdominale (SCF) (Figure 1A). - Recueillir le CSAH par dissection émoussée et le coupant de la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux positionné aussi plat que possible contre la peau. Une fois collectés, mettre du SCF sur la feuille d’aluminium préalablement désignées.
Remarque : Collecte ou contaminer le tissu adipeux avec la peau ou des cheveux va modifier l’échantillon qualité et le rendement de RNA en raison des RNases. Si le tissu adipeux est passa beaucoup trop de temps, l’échantillon peut aussi sec qui peut aussi altérer la qualité de l’échantillon. - Répétez les étapes 1,9 à 1.11 sur le côté gauche de l’animal. Piscine les touches gauche et droite de matières grasses dans le papier d’aluminium et congeler l’échantillon dans l’azote liquide.
- Pour avoir accès aux tissus adipeux viscérales, couper le muscle de l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux propre mais non stérile et forceps le long de la linea alba, sur ~ 4 cm selon la taille de la souris, de l’appareil génital de la cage thoracique. Ensuite, faites une incision dans les muscles abdominaux de l’appareil génital vers l’arrière de la souris sur ~2.5 cm d’avoir accès au côté des organes abdominaux.
- La graisse autour des organes de reproduction est la graisse peri-gonadique (PGF) (Figure 1B). PGF est annexé à l’épididyme, les testicules et le canal déférent, détachez soigneusement la grosse garniture gauche de ces structures et mettre sur la feuille d’aluminium préalablement désignées. Répéter pour le côté droit. Une fois les deux FGP est recueillies, geler l’échantillon dans l’azote liquide.
- Commençant par le côté gauche, exposer les reins en déplaçant le tube digestif de la cavité abdominale vers la droite. Le tissu adipeux entourant le rein est la graisse peri-rénal (PRF) (Figure 1C). PRF entoure également les glandes surrénales (Figure 1D).
- Isoler et supprimer les glandes surrénales avant de recueillir des PRF. Cela peut être fastidieux, car ils sont juste un peu plus rose que le tissu adipeux.
Remarque : Reins ne devraient pas être retirés au cours de cette étape, car le sang peut contaminer le tissu adipeux et de rendre plus difficile d’identifier les glandes surrénales dans cette grosse garniture. - Isoler le PRF de la paroi arrière musculaire, se terminant en coupant l’uretère, l’artère rénale et la veine qui sépare le PRF et le rein du reste du corps. Isoler le PRF du rein en coupe et en supprimant la capsule rénale. Le PRF reste attaché à la capsule.
- Répétez les étapes 1.15 et 1.17 pour la droite. Mettre les deux PRF dans le papier d’aluminium et congeler l’échantillon dans l’azote liquide.
- Recommencer la procédure depuis les étapes 1,2 à 1,18 pour toutes les souris à collecter.
- À ce stade, procéder à la rectification de tissu adipeux ou stocker les échantillons dans un congélateur à-80 ° C pour l’extraction ultérieure. Échantillons peuvent être conservés de manière stable à-80 ° C pendant plusieurs années4.
2. préparation du sol blanc tissu adipeux pour ARN
Remarque : Porter des gants pour chaque étape comme peau contient des ribonucléases qui peut favoriser la dégradation de l’ARN et à ce titre, modifie la qualité de l’échantillon et le rendement de RNA après l’isolement.
- Préparer et identifier trois exempte de RNase tubes 1,5 mL bouchon à vis conique par souris, un pour chaque type de tissu adipeux blanc et placez-les sur une grille.
Remarque : Animaux obèses peut nécessiter des tubes supplémentaires car ils ont augmenté de masses grasses. Cela est particulièrement vrai pour l’EFC pour laquelle jusqu'à 7 tubes pour une souris a été obtenue. - Nettoyer le banc avec l’éthanol à 70 % et mettre un banc propre et neuf de papier sur la surface.
- Que les tissus adipeux ont été fraîchement récoltés de souris ou stockés au préalable dans un congélateur à-80 ° C, se réunissent tous les échantillons dans un récipient de rempli d’azote liquid jusqu’au début de la procédure.
- Congeler le mortier, le pilon et spatule en les plaçant dans le contenant de l’azote liquide. Lorsque l’azote liquide s’arrête à '' ébullition '', meulage du tissu adipeux peut être démarré.
Remarque : De cette étape, le mortier, spatule, tube à fond conique et le tissu adipeux doivent rester réfrigéré pendant tout le processus. Toute chaleur va faire fondre le tissu adipeux et rendent plus difficile d’extraire l’ARN. En outre, si vous utilisez un pilon et un mortier en céramique, on peut employer neige carbonique ou l’azote liquide pour le maintenir froid. - Placer tous les exempte de RNase 1,5 mL bouchon à vis conique tubes préparé à l’étape 2.2 sur la glace sèche pour les refroidir.
- Pour éviter les engelures sur les mains, utilisez quelques couches de papier brun pour soulever le mortier de l’azote liquide et le mettre sur un banc de travail.
- Utilisez la pince pour recueillir un échantillon de tissu adipeux de l’azote liquide et le mettre dans le mortier. Déballer le papier d’aluminium et déposer l’échantillon sur le centre du mortier rapidement.
Remarque : Si l’échantillon de tissu adipeux est trop gros, comme c’est le cas avec des souris obèses, briser les échantillons en parties plus petites dans le papier d’aluminium à l’aide de vos pouces et pulvériser chaque partie séparément. - Utilisez quelques couches de papier brun pour soulever le pilon de l’azote liquide et insérer celui-ci dans le mortier. Tout en tenant le pilon avec papiers bruns, utiliser le marteau pour frapper le haut du pilon une ou deux fois. Appuyez le pilon contre le mortier avec rotation des requêtes à broyer l’échantillon jusqu'à l’obtention d’une poudre fine.
Remarque : Cette étape est essentielle pour obtenir des ARN adéquate. En effet, la présence des plus grands fragments va entraver l’ARN et réduire le rendement. - Après avoir obtenu une poudre fine, retirer le pilon et ramasser la spatule de l’azote liquide et utilisez-la pour transférer l’échantillon dans le tube à fond conique préalablement réfrigérées 1,5 mL correspondant.
Remarque : Plonger la spatule dans l’azote liquide de temps en temps pour empêcher la fusion de l’échantillon. Aussi, gardez le tube conique à glace sèche toujours pour empêcher la fonte de l’échantillon. Un tube conique rempli avec l’échantillon de sol à capacité environ 2/3 (~ 1 mL) est nécessaire pour le rendement de RNA et la quantité adéquate. - Une fois rempli à environ 1 mL, fermer le tube et déposez-le dans l’autre liquide contenant rempli d’azote.
Remarque : Échantillons excès peuvent être séparé préalablement réfrigérées exempte de RNase 1,5 mL tubes coniques et stockés dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation ultérieure. - Nettoyer le mortier, le pilon et spatule avec papiers marron pour éviter le report dans l’échantillon de tissu adipeux suivant. Remettez un pilon et spatule dans l’azote liquide pour refroidir. Même si le papier brun n’est pas exempte de RNase, nous utilisons un pack fraîchement ouvert du papier brun pour chaque jour de l’ARN.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.11 avec l’exemple suivant.
- Une fois que tous les échantillons sont traités, commencer à ARN ou stocker les échantillons dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation ultérieure.
Remarque : Pour éviter que les tubes d’éclatement, geler une boîte échantillon en l’immergeant complètement dans le contenant de l’azote liquide. Une fois refroidi assez retirer l’excès d’azote de la boîte et laisser flotter sur le dessus de l’azote liquide. Trier les échantillons dans la boîte et placez-la dans un congélateur à-80 ° C.
3. isolement du tissu adipeux au sol
Mise en garde : Solution de phénol est nocive pour la peau. Porter une blouse, des gants, des lunettes de sécurité et d’exécuter la procédure sous une hotte chimique. Un organigramme étape par étape est illustré à la Figure 2.
- Préparer et identifier les deux séries de tubes coniques RNase-libre de 1,5 mL et mettez-les dans un rack.
- Si les tissus adipeux sont fraîchement moulus ou préalablement stockés dans un congélateur à-80 ° C, se réunissent tous les échantillons dans un récipient rempli d’azote liquid jusqu’au début de la procédure qui se fait généralement à température ambiante.
- Forceps permet de sélectionner un échantillon de tissu adipeux au sol de l’azote liquide et le mettre dans un portoir. Les tubes doivent contenir environ 1 mL de poudre, ce qui correspond à environ 100 mg de poudre de tissu.
- Ouvrir lentement le tube.
Remarque : Laissant un tube fermé à température ambiante ou d’ouvrir le couvercle du tube trop rapidement pourrait mener à échantillon pertes ou préjudices comme la pression de l’azote tend à s’échapper du tube. - Ajouter 500 µL de solution de phénol à l’échantillon (ratio 1:2 de solution de phénol : poudre de tissu).
- Fermer le couvercle du tube et vortex à vitesse maximum pendant environ 5 s. lentement et ouvrez soigneusement le tube pour relâcher la pression de l’azote (un bruit d’air sortant du tube peut être entendu).
- Répétez les étapes 3.5 et 3.6. Le volume de solution de phénol final ajouté à l’échantillon est de 1 mL.
- Répétez l’étape 3.6 jusqu'à dissolution complète de l’échantillon.
Remarque : Il est important de libérer toute la pression du tube avant de poursuivre leurs efforts pour empêcher l’éclatement du tube. - Laisser l’échantillon reposer à température ambiante, tout en répétant les étapes 3,4 à 3,8 pour les prochains échantillons.
- Une fois que tous les échantillons sont traités, brièvement vortex à vitesse maximale et incuber les échantillons toutes les 5 min à température ambiante.
- Centrifuger 10 min à 12 000 x g à 4 ° C. Ramener les tubes à température ambiante.
Remarque : Après centrifugation à 3 phases sont présentes comme illustré à la Figure 2: matières grasses (en haut), l’ARN (au milieu) et pellet (en bas). - Pour chaque échantillon, transférer autant ARN (couche intermédiaire de rose) que possible dans la première série de tubes correspondants avec une pipette P1000 en utilisant un embout filtré. Changer de conseils entre les échantillons.
- Afin d’assurer une contamination minimale de l’ARN (couche moyenne) par les lipides (couche supérieure), percer la phase supérieure avec la pointe près de la paroi du tube. Dispense de l’ARN dans les nouveaux tubes coniques sans toucher les parois du tube nouveau pour empêcher transfert des lipides qui peuvent être à l’extérieur de la pointe.
- Ajouter 200 µL de chloroforme pur dans chaque échantillon et mélanger par retournement pendant 15 s. Incuber 10 min à température ambiante.
- Centrifuger 15 min à 12 000 x g à 4 ° C et ramener les tubes à température ambiante.
Remarque : Après centrifugation à 3 phases sont présentes : ARN (en haut), interphase qui contient de l’ADN (au milieu) et le rouge de phénol-chloroforme qui contient des protéines (en bas). - Pour chaque échantillon, transférer comme beaucoup aqueuse transparente contenant du RNA phase (phase supérieure) que possible à la deuxième série de tubes coniques correspondants avec une pipette P1000 à l’aide de conseils filtré. Changer les conseils entre chaque échantillon.
Remarque : L’interphase est fragile et peut contaminer la phase supérieure si l’aspiration est faite trop rapidement. Comme alternative, utiliser une pipette de P200 pour réduire les chances de perturber l’interphase. - Ajouter 500 µL d’isopropanol 100 % à chaque échantillon et mélanger par retournement pendant 15 sec.
- Incuber 10 min à température ambiante
- Centrifuger 10 min à 12 000 x g à 4 ° C et ramener les tubes à température ambiante. Jeter l’isopropanol en retournant chaque tube.
Remarque : Une petite pastille blanche de RNA peut habituellement être vu mais parfois ne peut pas. - Ajouter 1 mL d’éthanol 75 % (préparé à partir de 100 % d’éthanol et d’eau exempte de RNase) pour chaque échantillon et brièvement vortex chaque tube à vitesse maximale.
- Centrifuger 5 min à 7 500 x g à 4 ° C et ramener les tubes à température ambiante.
- Jeter le 75 % d’éthanol en retournant chaque tube et tapoter contre un papier brun pour enlever tout résidu.
Remarque : Si nécessaire, utilisez un embout filtré pour enlever l’alcool près de la pastille de RNA. Changer l’embout entre les échantillons. - Laisser le couvercle ouvert et l’air sec le culot de RNA pendant environ 15-20 min.
Remarque : Boulettes de RNA pourraient devenir translucides au cours de cette étape. - RNA solubilisation de la pastille est fonction de la taille, mesurer la taille de la pastille pour déterminer le volume d’eau exempte de RNase permettant de solubiliser l’ARN. Noter le volume (10 à 25 µL) pour chaque échantillon.
Remarque : Cette étape est purement qualitative. Si granulés RNA ne peut pas être vu, ajouter 10 µL d’eau exempte de RNA à l’échantillon. - Ajouter 10 à 25 µL d’eau exempte de RNase dans chaque échantillon (volume prédéterminé à étape 3.24).
- Incuber l’échantillon 5 min dans un bloc chauffant à 60 ° C. Vortex brièvement les tubes.
- Incuber l’échantillon pour un 5 min supplémentaire dans le même bloc de chaleur à 60 ° C.
- Accès rapide-spin tous les échantillons dans un mini spin centrifugeuse et mettent immédiatement sur la glace.
- Déterminer la concentration en ARN et la pureté. Effectuer la transcription inverse (RT) pour obtenir des ADNc ou stocker les échantillons dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation ultérieure.
Remarque : Évitez de multiples cycles de gel/dégel car cela dégrade échantillons d’ARN.
4. détermination de la Concentration dans les tissus adipeux RNA et pureté
- Que des échantillons de tissus adipeux RNA ont été fraîchement extraites et solubilisées ou préalablement stockés dans un congélateur à-80 ° C, se rassemblent tous les échantillons et laissez-les décongeler sur la glace jusqu’au début de la procédure. Cela devrait être fait juste avant le début de l’étape suivante ou à la fin de l’isolement pour éviter plusieurs cycles de gel/dégel.
- Préparer et identifier les deux séries de tubes coniques RNase-libre de 1,5 mL et mettez-les dans un portoir.
- Lorsque tous les échantillons d’ARN sont complètement décongelés, vortex, un échantillon de 1 s et mettre sur la glace.
- Diluer votre solution de TE RNA 100 fois à 1 x dans la première série de RNase-libre tubes 1,5 mL coniques à l’aide de filtré RNase-libre conseils (mets 99 µL de solution TE 1 x et 1 µL d’ARN au tube).
- Répétez pour chaque échantillon.
Remarque : Les volumes peuvent être différentes pour chaque spectrophotomètre selon la cuve utilisée. - Une fois que tous les échantillons sont traités, vortex chaque échantillon dilué.
- Suivre le protocole du spectrophotomètre pour calibrer l’instrument à l’aide d’un blanc (1 x TE) avant de traiter les échantillons dilués d’ARN.
- Transférer les échantillons dilués d’ARN dans la cuvette de quartz et de déterminer la concentration de chaque échantillon à 260 nm.
Remarque : Le spectrophotomètre ne fournit pas la concentration en ARN définitive, utilisez cette formule pour calculer : RNA (µg/µL) = OD260 x facteur de dilution x (40 µL de RNA/1 000 µg). - Déterminer la pureté de RNA de chaque échantillon en calculant le ratio OD260/OD280.
Remarque : Un ratio OD260/OD280 autour 2.0 est généralement considéré comme pur pour RNA12. Il est fortement recommandé que la qualité de RNA est vérifiée. Pour ce faire, mettez 1 µg d’ARN sur un gel de Javel 1 % d’agarose effectué avec 1 tampon de x TBE (base de 89 mM Tris, d’acide borique 89 mM et 2 mM EDTA, pH 8,0) et 1 % d’eau de Javel solution13 (Figure 3). RNA de très bonne qualité montre des bandes d’ARNr 28 s et de 18 s et la bande de 28 s doit être plus intense que les 18. Qualité de RNA est acceptable lorsque les deux bandes d’ARNr sont visibles à une intensité similaire. RNA qualité devient déficiente à l’heure actuelle, que le groupe de 18 ans est plus intense que la bande de 28 s, et quand un frottis est visible, révélateur de la dégradation de l’ARN. - Pour chaque échantillon, préparer 10 µL de 0,5 µg/µL d’ARN dans le stock dans le deuxième set de RNase-libre tubes 1,5 mL coniques à l’aide de l’eau exempte de RNase pour diluer les échantillons selon les besoins. Ces échantillons sont utilisés pour la RT pour obtenir l’ADNc.
- Une fois que tous les échantillons sont traités, démarrez RT ou stocker les échantillons dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation ultérieure.
5. transcription inverse (RT)
- Que des échantillons de tissus adipeux RNA ont été fraîchement diluées à 0,5 µg/µL ou préalablement stockés dans un congélateur à-80 ° C, se rassemblent tous les échantillons et réactifs et laissez-les décongeler sur la glace jusqu’au début de la procédure.
- Mettre le support de bande de tubes PCR sur la glace. Une fois froid assez préparer et identifier un ensemble de tube PCR exempte de RNase bandes et mettez-les sur la grille. Inclure un blanc.
- Préparer la réaction pour le traitement de la DNase de l’ARN : faire un mélange maître (pour la quantité requise de l’échantillon + 1 échantillon) de ce qui suit (quantités pour 1 échantillon) : 1 µL de 10 X tampon de réaction avec MgCl2, 0,5 µL de DNase I (1 U/µl) et 7,5 µL de RNase-libre de l’eau à l’aide filtrés et conseils. Distribuer 9 µL dans chaque tube.
- Ajouter 1 µL de 0,5 µg/µL d’ARN de chaque échantillon dans le tube correspondant, placez les bouchons sur chaque bande et de spin rapide toutes les bandes en vrille minie centrifuger à amener l’échantillon au fond du tube. Ajouter 1 µL d’eau exempte de RNA pour l’essai à blanc.
- Incuber à toutes les bandes de tube dans un thermocycleur ou un bloc de chauffage à 37 ° C pendant 30 min. remettre la bande de tube sur le panier sur la glace.
- Ajouter 1 µL d’EDTA (50 mM) à chaque tube et incuber toutes les bandes de tube dans un thermocycleur ou un bloc de chauffage à 65 ° C pendant 10 min. Remettez la bande de tube sur le panier sur la glace.
- Faire un mélange principal (pour le nombre d’échantillons plus 1 échantillon) de ce qui suit (quantités pour 1 échantillon) : 1 µL d’hexamères aléatoire (0,2 µg/µL) et 1 µL du mélange dNTP (contient chacune des quatre désoxynucléotides à une concentration de 10 mM). Administrer 2 µL de master mix dans chaque tube à l’aide de conseils filtré. Changer l’embout entre les échantillons.
- Incuber à toutes les bandes de tube dans un thermocycleur ou un bloc de chauffage à 65 ° C pendant 5 min. Remettez la bande de tube dans le panier sur la glace.
- Faire un mélange principal (pour le nombre d’échantillons plus 1 échantillon) de ce qui suit (quantités pour 1 échantillon) : 4 µL de 5 x RT tampon, 1 µL d’inhibiteur de RNase (20 U/µL), 0,25 µL de la transcriptase inverse (200 U/µL) et 1,75 µL d’eau exempte de nucléase. Distribuer 7 µL dans chaque tube à l’aide de conseils filtrées. Changer l’embout entre les échantillons.
- Effectuer la RT dans un thermocycleur en définissant le programme suivant : 10 min à 25 ° C, 30 min à 50 ° C, 5 min à 85 ° C. Remettre les bandes de tube sur le panier sur la glace.
- Préparer et identifier un jeu de bandes de tube PCR exempte de RNase et mettez-les sur la grille.
- Pour chaque échantillon, préparer le volume souhaité de l’ADNc dilué 1:5 du stock dans les nouvelles bandes tube à l’aide de l’eau ultrapure. Les échantillons de cDNA dilué 1:5 seront utilisés pour la PCR en temps réel.
- Une fois que tous les échantillons sont traités, démarrer la PCR en temps réel ou stocker les échantillons (stock et échantillons dilués) dans un congélateur à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
6. Real-time PCR pour l’Expression des gènes dans le tissu adipeux
Remarque : Évitez d’exposer le colorant fluorescent à la lumière. Le protocole ci-dessous décrit l’amplification du gène référence s1614. Les amorces et les conditions de la PCR doivent être modifiées selon le gène d’intérêt.
- Si les échantillons de l’ARNC étaient fraîchement diluée 1:5 ou préalablement stockés dans un congélateur à-20 ° C, se rassemblent tous les échantillons et réactifs et laissez-les décongeler sur la glace jusqu’au début de la procédure.
- Mettre le panier pour bandes de tube PCR en temps réel sur la glace. Une fois froid assez préparer et définir un ensemble en temps réel tube PCR bandes et mettez-les sur la grille. Préparer chaque échantillon et l’essai à blanc en double exemplaire.
- Faire un mélange principal (pour le nombre d’échantillons plus 1 échantillon) de ce qui suit (quantités pour 1 échantillon) : 1,9 µL d’eau ultrapure, 5 µL de colorant fluorescent (p. ex. SYBR green) et 0,3 µL d’un apprêt avant et 0,3 µL de l’amorce de marche arrière. Distribuer 7,5 µL dans chaque tube.
- Ajouter 2,5 µL du cDNA dilué 1:5 de chaque échantillon dans le tube correspondant. Ajouter 2,5 µL d’eau ultrapure pour les blancs. Mettre les bouchons sur chaque bande.
- Suivez les instructions du fabricant de mettre en place le programme suivant sur la PCR en temps réel : 10 min à 95 ° C et 40 cycles de 15 s à 50 ° C, 30 s à 60 ° C, 30 s à 70 ° C. Mettre les bandes de l’échantillon dans le rotor de la machine PCR en temps réel et démarrer le programme.
Remarque : Thermocycleur conditions peuvent varier selon l’appareil utilisé et le gène d’intérêt. résultats d’expression ARNm présentées en Figure 3 Voir la leptine ARNm l’amplification normalisée par le gène de référence S16 ARNm amplification14,15.
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Representative Results
En suivant la procédure de l’autopsie, le tissu adipeux blanc trois ont été recueilli et pondérée en fonction de deux groupes de souris (N et HF régime alimentaire chez les souris nourries). Comme prévu, souris sur le régime de HF avaient augmenté le poids corporel final et gain de poids par rapport à la même portée sur régime N (tableau 1). Ces observations étaient accompagnées par plus qu’une augmentation de 2 fois le poids de la PGF, PRF et SCF chez des souris obèses par rapport aux régime N.
Avant d’effectuer toutes les expériences avec l’ARN isolé, sa pureté a été évaluée comme indiqué au point 4.9. Pour chaque tissu adipeux blanc, ARN de solution de phénol produits échantillons avec la qualité adéquate comme le ratio qu'od260/OD280 a été environ 2.0 qui est considéré comme pure pour RNA (tableau 2). Les données PCR en temps réel ont montré que les ARNm leptine augmente significativement en PGF, PRF et SCF des souris obèses par rapport aux régime N (Figure 4A). En effet, les différences observées dans l’expression de l’ARNm leptine n’étaient pas dû à une variation de la s16, le gène de référence utilisé pour normaliser les résultats, entre les deux groupes de souris comme valeurs Ct n’ont pas été modifiées (Figure 4B). Ainsi, s16 fiable utilisable comme un gène de référence pour l’expression de l’ARNm en PGF, PRF et SCF lorsque la diète FTL est un paramètre dans un protocole de l’étude.
Figure 1 . Localisation anatomique du tissu adipeux blanc chez les souris. Une souris mâle sur alimentation N a été disséquée pour montrer la localisation de chaque dépôt de tissu adipeux et des glandes surrénales. EFC (A), (B)de la PGF, PRF (C) et glande surrénale (D). PGF, graisse peri-gonadique ; PRF, graisse peri-rénal ; SCF, la graisse sous-cutanée abdominale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . RNA isolation protocole diagramme à l’aide de la solution phénolée. Représentation schématique des étapes requises pour isoler l’ARN de mise à la terre le tissu adipeux blanc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Évaluation de la qualité de RNA sur gel de l’eau de Javel. 1 µg d’ARN isolé de la graisse sous-cutanée (SCF) et de la graisse peri-gonadique (PGF) est séparée sur un gel d’eau de Javel 1 % d’agarose par électrophorèse. 28 s et 18 s ARNr sont visualisées par UV-transillumination. Sur gel est ARN isolé du SCF et PGF d’une souris nourris avec un régime alimentaire normal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Effet de la diète de HF sur la leptine et s16 expression de l’ARNm dans le tissu adipeux blanc. Leptine, expression de mRNA (B) (A) et s16. Données de leptine sont normalisées à l’ARNm s16 tandis que les données pour s16 apparaissent en tant que valeur de Ct et les deux sont présentées comme moyenne ± écart type avec n = 12-13 par groupe. * p < 0,05 par rapport au régime N. N, normal ; HF, riche en matières grasses ; PGF, graisse peri-gonadique ; PRF, graisse peri-rénal ; SCF, la graisse sous-cutanée abdominale. Ce chiffre a été modifié par Tan, P. et al., l’obésité (2014) 22, 2201-2209. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Régime alimentaire N | Diète FTL | |
| Poids final (g) | 37,5 ± 1,3 | 46,7 ± 1,7 * |
| Gain de poids (g) | 6,6 ± 0,7 | ± 16,7 1.0* |
| PGF (g) | 1.08 ± 0,17 | 2,19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 0.06* ± 1.71 |
| EFC (g) | 1.62 ± 0,35 | 3.55 ± 0.20* |
Tableau 1. Effet de la diète de HF sur le corps et blanc poids de tissu adipeux. Les valeurs sont exprimées comme moyen ± écart type avec n = 14-15 / groupe. * p < 0,05 par rapport au régime N. N, normal ; HF, riche en matières grasses ; PGF, graisse peri-gonadique ; PRF, graisse peri-rénal ; SCF, la graisse sous-cutanée abdominale. Ce chiffre a été modifié par Tan, P. et al., l’obésité (2014) 22, 2201-2209.
| Échantillons | Ratio OD260/OD280 |
| FGP 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| EFC 1 | 2.04 |
| EFC 2 | 2.02 |
| EFC 3 | 2.06 |
Le tableau 2. Pureté de RNA après l’isolement des tissus adipeux blanc. n = 3 par le tissu adipeux. PGF, graisse peri-gonadique ; PRF, graisse peri-rénal ; SCF, la graisse sous-cutanée abdominale.
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Discussion
HF-régime suivant l’alimentation, les souris obèses se sont avérées ont augmenté le corps et le tissu adipeux blanc poids par rapport aux souris nourries d’un N. ARN extrait à l’aide de solution de phénol ont donné des échantillons avec bonne pureté. La leptine est une adipokine principalement produite par le tissu adipeux et est connue pour la corrélation positive avec la masse grasse16. Comme prévu, expression de l’ARNm leptine a augmenté chez les souris obèses en concomitance avec leur masse grasse.
Cette méthode a plusieurs étapes cruciales. Le majeur est la contamination d’un dépôt de tissu adipeux blanc avec un autre tel qu’il est connu que le tissu adipeux différents dépôts ont différentes fonctions2,5. La contamination peut apporter des résultats trompeurs dans les applications en aval. En outre, que la graisse a tendance à sécher une fois au contact de l’air, recueillant le tissu adipeux blanc à un rythme régulier et uniforme entre souris est recommandé si le poids doit être pris. Dans le cas contraire, le poids total d’une grosse garniture peut être incorrect. Afin d’obtenir des ARN de bonne qualité et le rendement, suivant le MIQE publié récemment lignes directrices est un atout certain17. En particulier, faire en poudre très fine d’échantillon pendant le broyage peut aider à maximiser le rendement. Cela maximise le contact entre la solution de poudre et de phénol de tissus au cours de l’ARN. Dernier mais non des moindres est l’isolement de la couche contenant du RNA pendant l’isolement du RNA (étape 3.12). Comme la graisse est moins dense que l’eau, il est positionné sur le dessus de la phase d’intérêt. Minimiser le report de graisse est nécessaire pour réduire l’interférence avec les applications en aval.
Une des limites de cette méthode sont la compétence nécessaire pour effectuer plusieurs étapes de la procédure ainsi que la nécessité de travailler avec des réactifs dangereux au cours de l’ARN. En outre, l’ensemble du processus est beaucoup de travail.
Il n’y a pas beaucoup d’alternatives à la méthode de prélèvement de tissu adipeux et échantillon de traitement avant d’ARN en dehors de petits détails qui sont habituellement réglées par chaque utilisateur. Dans le cas de l’ARN, de nombreuses options sont disponibles comme l’extraction de phénol/chloroforme ou kits d’isolation de RNA. Des avantages et des inconvénients de chaque option et il appartient à l’utilisateur de sélectionner la meilleure méthode, basée sur les applications en aval. Extraction de phénol/chloroforme est moins cher mais nécessite l’utilisation de réactifs dangereux et laborieuse. RNA isolation kits sont généralement plus coûteux, mais la procédure est plus rapide et entraîne généralement des échantillons de bonne qualité et pureté. Il est important d’examiner le rendement et la pureté de l’ARN, parce que la matière est limitée dans le tissu adipeux blanc qui se compose principalement de matières grasses. Le principal avantage en utilisant la solution de phénol pour isolement (extraction de phénol/chloroforme) est la possibilité d’isoler l’ARN, ADN et protéine d’un seul échantillon18. Il s’agit de coût et temps efficace car il diminue le nombre de souris nécessaire pour obtenir suffisamment de matière. Tel que mentionné précédemment, la masse grasse est limitée à certains modèles de souris. Chez ces souris, fractionnement de tissu adipeux au sol en trois parties pour obtenir séparément des ARN, ADN et des protéines n’est pas recommandé car cela pourrait conduire à l’insuffisance de matériel pour des applications en aval. Pour contourner ce problème, il est également possible de mettre en commun semblable dépôt de tissu adipeux de plusieurs souris basée sur des critères définis par l’utilisateur, qui conduit à un augmentation du nombre d’animaux nécessaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par diabète Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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