Summary
מטרת מאמר זה היא להציג הליך שלב אחר שלב כדי לאסוף רקמות adipose לבן שונים של עכברים, לעבד את דגימות השמן ולחלץ את ה-RNA.
Abstract
בהשוואה לרקמות אחרות, שומן לבן יש הרבה פחות RNA וחלבון תוכן עבור יישומים במורד הזרם כגון PCR בזמן אמת המערבי כתם, שכן הוא בעיקר מכיל שומנים. בידוד RNA מדגימות רקמת שומן הוא מאתגר גם צעדים נוספים נדרשים להימנע שומנים אלה. כאן, אנו מציגים את הליך איסוף שלוש רקמות adipose שונה מבחינה אנטומית לבן עכברים, לעבד את דגימות אלה ולבצע בידוד ה-RNA. בהמשך נתאר את הסינתזה של ניסויים ביטוי cDNA וג'ין באמצעות PCR בזמן אמת. הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הפחתת זיהום מן הדם על רפידות השמן, כמו גם זיהום צולב בין פדים שמנים שונים במהלך איסוף רקמת והשיער של החיה. זה גם מוטבה כדי להבטיח ובאיכות של RNA חילוץ. פרוטוקול זה ניתן להחיל באופן נרחב על כל דגם העכבר בו דוגמאות רקמת שומן נדרשים לניסויים שגרתיות כגון PCR בזמן אמת, אך אינו מיועד לבידוד מתרבות תא adipocytes הראשי.
Introduction
השמנה היא מגפה עולמית אשר יכול להוביל לסיבוכים כגון סוג 2 סוכרת1. דיאטה-induced מהשמנת יתר, מהונדסים מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות למחקר, השמנת יתר, סיבוכים הקשורים. באופן מסורתי, שומן לבן המכונה בה תא אחסון אנרגיה עודפת, מורכב בעיקר שומנים בזמן רקמת שומן חום ממירה אנרגיה חום2,3. רקמת שומן הוא דינמי, להתרחב ולהתכווץ בהתאם לגורמים רבים כגון צריכת המזון ופעילות גופנית. לפיכך, כדי לקבוע את הגורמים התורמים לשינויים אלה, רקמת שומן מספקת אוסף וטיפול הם נדרשים4.
בין רקמות adipose לבן, זה מקובל כי המחסנים שומן תת עורית של הקרביים שיש לה מאפיינים שונים כגון לוקליזציה אנטומיים, לתפקד2,5. כתוצאה מכך, כדי למנוע תוצאות סותרות או השתנות גדולה, תשומת הלב צריך לקחת כדי למנוע זיהום צולב בין אלה המחסנים שומן שונה בעת איסוף שמן רפידות.
יתר על כן, ישנם שלושה אתגרים מרכזיים כאשר בידוד RNA או החלבון של רקמת שומן עכברים לבנים. ראשית, איסוף רפידות שומן בעכברים שמנים אינה משימה קלה כפי הגבול המפריד בין המחסנים שומן לבן שונה אינה חד משמעית, בניגוד לאיברים אחרים כגון הכליות, הלב6. שנית, בגלל התוכן שומנים גבוהה בדם של רקמת שומן, במהלך בידוד RNA או החלבון, שכבה של ליפידים צף למעלה, מונע גישה ישירה המדגם. שלישית, בניגוד רקמת שומן חום או רקמות אחרות, שומן לבן תוכן RNA וחלבונים נמוך משמעותית, זו הדאגה העיקרית בעת שימוש עכברים צעירים, עכברים האכיל דיאטה רגילה (N) ויש עכברים אשר צפויים ההמונים שומן נמוכה (קרי KO מודלים, טיפול עם תרופות, תרגיל אימונים, וכו '.) 7 , 8.
לכן, בחירת השיטה המתאימה כדי לבודד את הרנ א של רקמת שומן חיוני. שיטות אלטרנטיביות למניעת פנול/כלורופורם החילוץ הם ערכות מסחריות. הם מבוססים בדרך כלל על צעד החילוץ הראשוני פנול, ואחריו RNA טיהור על עמודה9. עם זאת, ערכות אלה בדרך כלל יקרים יותר, לתת דוגמאות תשואה נמוכה יותר, תוך איכות RNA יכול להיות משתנה אבל פחות זמן רב. עם זאת, אחד היתרונות הגדולים של פנול פתרון/כלורופורם החילוץ המתוארים כאן היא האפשרות של בידוד RNA DNA, חלבונים מן מדגם יחיד10. כיוון רפידות השמן עכברים קטנים בדרך כלל לתת כמות קטנה של RNA וחלבונים (במיוחד במודלים העכבר רזה), פרוטוקולים אלה למקסם את הנתונים אחד יכול לצאת מדגם קטן.
מטרת המאמר היא לתאר בפירוט שיטה כדי להבטיח מדגם נאותה מהאוסף מחסני רקמת שומן לבן שלושה עכברים וכן בכמות ובאיכות של RNA בידוד. RNA מושגת על ידי ביצוע פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מבחני ה-PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה אינו מיועד לבידוד RNA מ adipocytes הראשית בתרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול של העכברים המשמשים את ההליכים נענים תקנים עבור טיפול והשתמש של חיות ניסוי מוגדר על ידי המועצה הקנדית למען הגנה על החיות. כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת חיה אכפת ועל שימוש הוועדה במכון המחקר צ'אם.
1. necropsy רקמת שומן אוסף של עכברים זכרים
- להפוך קבוצות הניסוי על פי מטרות המחקר. במחקר זה, דגימות נאספו משתי קבוצות של עכברים זכרים על רקע C57Bl/6 (n = 12-14/קבוצה). ודא כי עכברים המשמש כאן הם בגיל 12-15 שבועות נשמרים במחזור 12-h/כהה עם גישה רגילה (N) או תזונה עתירת שומן (HF), מים ad libitum לתקופה של 10 שבועות11.
- המתת חסד עכבר על-ידי הצבת העכבר בחדר אטום שבו הוא נחשף 6% CO2 במשך 10 דקות.
- לבצע ניקוב הלב על ידי לאט הוספת מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 1/2po 26 גרם לשמאל של החזה של החיה ומושך באיטיות את הבוכנה כדי להסיר את רוב הדם של החיה. ודא כי המזרק הוא מקביל גוף החיה. לסובב את המזרק לאט תוך כדי למשוך את הבוכנה אם הדם לא מגיע לתוך המזרק.
הערה: ניקוב לב מוצלח (בין 0.8 לנפח הדם 1 מ"ל) יקטן זיהום של רקמת שומן בדם. - שכב העכברים על גבו, להפיל את כל כף הרגל על משטח באמצעות מחטים 22 גרם כמוצג באיור1.
- עם גזה, לשפשף העור של העכבר עם אלכוהול מספר פעמים החל בצוואר כל הדרך אל האברים באברי המין על-ידי ביצוע תנועה חד כיווני זה מבטיח כי השיער נשאר שטוח ומפחית את הזיהום השיער של רקמת שומן דגימות ללא הסרת שיער.
- משתמש נקי אבל לא סטרילי מלקחיים ומספריים כירורגי, לרומם את העור המרכזית ליד האיברים באברי המין, עושים חתך קטן 0.3 מ מ.
- הכנס את המספריים אופקית לתוך החור נפתח ולנתק את העור הבטן הבטן מהקיר.
הערה: זה נעשה ע י ניתוח עמום במרחב שבין העור לקיר הבטן, ולא על ידי חיתוך על הממברנות נמצאו בשטח זה. - עם המלקחיים, לרומם את העור המרכזית ליד החור נפתח ולחתוך את העור מעל לינאה אלבה עד שאתה קרוב הצלעות (~ 4 ס מ בהתאם לגודל עכבר).
הערה: הימנע לחתוך את שריר הבטן כפי זה עשוי לחשוף את רקמת שומן הקרביים לאוויר, להוביל ייבוש של הידיות שומן אשר עשוי לשנות את התקינות של הרקמה ואת התוכן שלה. - מהאמצע של כלוב הצלעות, לחתוך את העור לכיוון היד הימנית על ~ 2 ס מ. מ ליד האיברים באברי המין, לחתוך את העור מעל האיבר הינד נכון על ~ 2 ס מ.
- למתוח פינה אחת של העור שנפתחו ותגיד לי במדויק על משטח באמצעות מחט 22 גרם. חזור על מעבר לפינה אחרת.
הערה: רקמת שומן חשוף על העור הוא השומן התת עורית בטן (SCF) (איור 1א'). - לאסוף את SCF בוטה לנתח, חיתוך זה העור בעזרת מספריים כירורגיים מוצבים שטוחים ככל האפשר על העור. לאחר שנאספו, לשים את SCF על רדיד האלומיניום שזוהו מראש.
הערה: איסוף או מזהם אדיפוז רקמת העור או שיער תשנה לטעום איכות ועם תשואה RNA בשל RNases. אם זמן רב מדי מושקע איסוף של רקמת שומן, המדגם עשוי גם יבש אשר יכול גם לשנות את איכות המדגם. - חזור על שלבים 1.9 עד 1.11 בצד שמאל של החיה. בריכה השמאלי והן ממש שמנה דפדפות רדיד האלומיניום, להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי.
- כדי לקבל גישה אל רקמות adipose מהבטן, לחתוך את שריר הבטן בעזרת מספריים כירורגיים נקיים אך לא סטרילי ומלקחיים לאורך לינאה אלבה, ב ~ 4 ס מ, בהתאם לגודל עכבר, של אברי המין, לכלוב הצלעות. ואז לעשות חתך בשרירי הבטן של אברי המין לכיוון החלק האחורי של העכבר על ~2.5 ס מ, כדי לגשת אל הצד של אברי הבטן.
- השומן סביב איברי הרבייה היא השומן פרי-האשכים (PGF) (איור 1B). כפי PGF מצורפת יותרת האשך, בזרמה את הזרע והצינורות, נתק בזהירות את השמאלי של משטח השמן של אותם מבנים ולשים על רדיד האלומיניום שזוהו מראש. חזור על הצד הימני. ברגע PGFs שני נאספים, להקפיא את הדגימה בחנקן נוזלי.
- החל מבצד שמאל, חושפים את הכליות ידי מתרחק הבטן חלל הבטן בצד ימין. רקמת שומן סביב הכליה הוא השומן פרי-כליות (PRF) (איור 1C). PRF המקיף גם בלוטות יותרת הכליה (איור 1D).
- לבודד ולהסיר את בלוטות יותרת הכליה לפני איסוף PRF. זה יכול להיות מייגע כמו שהם פשוט pinker קצת יותר רקמת שומן.
הערה: הכליות אין להסירו במהלך שלב זה כמו דם עשויים לזהם את רקמת שומן, שיהיה קשה יותר לזהות בלוטות האדרנל בתוך כרית השומן הזה. - לבודד את PRF מהקיר שרירי בחזרה, סיום על ידי חיתוך השופכן, עורק הכליות ו וריד אשר מפריד את PRF וכליות משאר חלקי הגוף. לבודד את PRF מן הכליה על ידי חיתוך והסרת הקפסולה כליות. PRF נשאר צמוד הקפסולה.
- חזור על הצעדים 1.15, 1.17 לצד הימיני. להכניס שני PRF רדיד האלומיניום, להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי.
- חזור על הפעולות מצעדי 1.2-1.18 עבור עכברים כל להיות שנאספו.
- בשלב זה, להמשיך עם רקמת שומן שחיקה או לשמור דגימות במקפיא-80 ° C לחילוץ מאוחר יותר. דוגמאות stably ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנים מספר4.
2. הכנת הקרקע לבן רקמת שומן לבידוד RNA
הערה: ללבוש כפפות עבור כל שלב העור מכיל RNases אשר יכול לקדם השפלה RNA ומשנה ככזה, מדגם איכות ו- RNA התשואה לאחר בידוד.
- להכין, לזהות שלושה ללא RNase 1.5 mL פקקי בורג חרוטי צינורות לכל עכבר, אחד עבור כל סוג של שומן לבן, ולמקם אותם על מתלה.
הערה: חיות מהשמנת יתר עשויים לדרוש צינורות נוספים כפי הם הגדילו את ההמונים השמן. זה במיוחד נכון SCF עבורו עד 7 צינורות עבור עכבר אחד הושג. - לנקות את הספסל עם 70% אתנול ולשים נייר נקי וחדש ספסל על פני השטח.
- רקמות adipose היו טריים שנאספו עכברים או שאוחסנו מראש במקפיא-80 ° C, מתאספים כל דוגמאות בתוך אחד מיכל מלא חנקן נוזלי עד תחילת ההליך.
- להקפיא את המרגמה, כמוה, מרית על-ידי הצבתם מיכל חנקן נוזלי. עצירת "להרתיח" החנקן הנוזלי, שחיקה של רקמת שומן ניתן להתחיל.
הערה: שלב זה, פצצות מרגמה, מרית, צינור חרוטי רקמת שומן צריך להישאר צוננים במהלך התהליך כולו. להתייחם יתמוססו ובינות לרקמה ואת להקשות לחלץ את הרנ א. כמו כן, אם באמצעות ומכתש מקרמיקה, אחד רשאי להשתמש קרח יבש ו/או חנקן נוזלי כדי לשמור אותה בקירור. - מקם כל נטולת RNase 1.5 mL פקקי בורג חרוטי צינורות המוכנים בשלב 2.2 בקרח יבש לקרר אותם.
- כדי להימנע frostbites על הידיים, להשתמש כמה שכבות של נייר חום כדי להרים את חומר המליטה החנקן הנוזלי. ושים אותו על ספסל עבודה.
- השתמש המלקחיים כדי לאסוף דוגמה רקמת שומן החנקן הנוזלי ושם אותו בתוך המרגמה. במהירות עטיפה רדיד האלומיניום ושחרר את הדגימה על מרכז חומרי המליטה.
הערה: אם המדגם רקמת שומן גדול מדי, כפי שקורה עם העכברים המשמינים, לשבור את הדגימות בחלקים קטנים ברדיד האלומיניום באמצעות האגודלים שלך ולא pulverize כל חלק בנפרד. - השתמש כמה שכבות של נייר חום כדי להרים את איחדו בין החנקן הנוזלי ולהתאים אותו המליטה. בעוד אתה מחזיק את המרוסקים עם ניירות חומים, השתמש הפטיש להכות בראש איחדו פעם או פעמיים. תלחץ איחדו את נגד המליטה עם סיבוב תנועות לטחון את הדגימה עד אבקה מתקבל.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להשיג בידוד RNA נאותה. אכן, הנוכחות של שברים גדולים יותר לעכב RNA בידוד ולהפחית התשואה. - ברגע אבקה מתקבל, להסיר את המרוסקים, לאסוף את המרית של החנקן הנוזלי ולהשתמש בו להעביר את הדגימה לתוך הצינור המתאים של חרוט טרום מקורר mL 1.5.
הערה: טובלים המרית בחזרה לתוך חנקן נוזלי מדי פעם כדי למנוע את הדגימה נמס. גם, לשמור את הצינור חרוט בתוך קרח יבש תמיד כדי למנוע את הדגימה מפשיר. צינור חרוטי מלא עם דגימת קרקע קיבולת בערך 2/3 (~ 1 מ"ל) דרוש עבור ה-RNA תשואה נאותה וכמות. - ברגע מלא כ- 1 מ ל, לסגור את הצינור ושחרר אותו לתוך אחרים נוזלי מלא חנקן המיכל.
הערה: עודף יכול להיות להכניס נפרד מראש מצוננים ללא RNase 1.5 mL חרוט צינורות ודוגמאות לאחסן במקפיא-80 ° C לשימוש מאוחר יותר. - נקה את חומר מליטה המרוסקים, מרית עם ניירות חומים כדי להימנע carry-over לתוך הדגימה רקמת שומן הבא. לשים המרוסקים, מרית בחזרה לתוך החנקן הנוזלי ולהירגע. אף-על-פי הנייר החום הוא לא חינם RNase, נשתמש חפיסת שנפתחו טרי נייר חום עבור כל יום של RNA בידוד.
- חזור על שלבים 2.4 ל 2.11 עם הדוגמה הבאה.
- לאחר כל דוגמאות מעובדים, להתחיל RNA בידוד או לאחסן דגימות במקפיא-80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
הערה: כדי למנוע הצינורות מתפוצצים, להקפיא תיבה לדוגמה על ידי לחלוטין השוקע אותה לתוך המיכל חנקן נוזלי. כאשר מגניב מספיק להסיר את עודפי החנקן תיבת ולתת לזה לצוף על-החנקן הנוזלי. למיין את הדגימות לתוך התיבה ושם אותה במקפיא-80 ° C.
3. RNA בידוד מן הקרקע רקמת שומן
התראה: פתרון פנול מזיק לעור. ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, משקפי ובצע את ההליך ברדס כימי. תרשים זרימה-צעד אחר צעד מוצג באיור2.
- היכונו, לזהות שני זוגות 1.5 mL ללא RNase חרוט צינורות ולשים אותם בארון תקשורת.
- רקמות adipose היו טריים קרקע או מראש לאחסן במקפיא-80 ° C, מתאספים כל דוגמאות במיכל מלא חנקן נוזלי עד תחילת ההליך שבו הוא נעשה בעיקר בטמפרטורת החדר.
- להשתמש מלקחיים כדי לבחור מדגם רקמת שומן הקרקע החנקן הנוזלי ושם אותו בתוך ארון תקשורת צינור. הצינורות צריך להכיל ~ 1 מ"ל של אבקת, המתאים בסביבות 100 מ ג של אבקת רקמות.
- לאט לאט פתח את הצינור.
הערה: עוזב צינור סגור בטמפרטורת החדר או פתיחת המכסה של הצינור מהר מדי עלול להוביל מדגם או פציעה כמו לחץ החנקן נוטה לברוח ברכבת התחתית. - להוסיף 500 µL של פנול פתרון המדגם (יחס 1:2 של פנול פתרון: אבקת רקמות).
- סגור המכסה של הרכבת התחתית, מערבולת במהירות המרבית לאורך כ-5 ס' לאט, בזהירות לפתוח את הצינור כדי לשחרר את הלחץ החנקן (קול של האוויר יוצא הצינור ניתן לשמוע).
- חזור על שלבים 3.5 ו- 3.6. האחסון הפתרון הסופי פנול נוספו המדגם הוא 1 מ"ל.
- חזור על שלב 3.6 עד המדגם היא התפרקה לחלוטין.
הערה: חשוב לשחרר את כל הלחץ מהצינור לפני שתמשיך עוד יותר כדי למנוע את הצינור מתפוצץ. - תן את הדגימה לעמוד בטמפרטורת החדר תוך כדי לחזור על השלבים 3.4 ל 3.8 על הדגימות הבא.
- לאחר כל דוגמאות עיבוד, בקצרה מערבולת במהירות המרבית, דגירה בדגימות כל 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 12 000 ב 4 º C. להחזיר את הצינורות בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר צנטריפוגה, 3 שלבים הם מציגים כמוצג באיור2: fat (למעלה), ה-RNA (באמצע) וגלולה (למטה). - עבור כל דגימה, להעביר כמה שיותר RNA (שכבה אמצעית ורוד) ככל האפשר לתוך הקבוצה הראשונה של צינורות המתאים עם פיפטה P1000 באמצעות טיפ מסוננים. לשנות טיפים בין הדגימות.
- כדי להבטיח זיהום מזערי של RNA (שכבה אמצעית) על ידי השומנים (שכבה עליונה), פירס פזה בראש עם הקצה ליד הצד של הצינור. לחלק את הרנ א לתוך הצינורות חרוט חדש בלי לגעת בצדדים של הצינור החדש כדי למנוע העברת שומנים שעשויים להיות בצד החיצוני של הקצה.
- להוסיף 200 µL של כלורופורם טהור כל מדגם ומערבבים על ידי היפוך למשך 15-ס' 10 דגירה דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה 15 דקות ב g x 12 000 ב 4 ° C, להחזיר את הצינורות בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר צנטריפוגה, 3 שלבים נוכחים: RNA (למעלה), לאטמוספרה אשר מכיל דנ א (באמצע), כלורופורם-פנול אדום המכיל חלבונים (למטה). - עבור כל דגימה, העברה כשלב הרבה מימית שקוף המכיל RNA (פזה בראש) ככל האפשר בערכה השניה של צינורות חרוט המתאים עם פיפטה P1000 באמצעות סינון-טיפים. לשנות טיפים בין כל דגימה.
הערה: לאטמוספרה שביר, יכול לזהם את השלב העליון אם השאיפה מתבצעת מהר מדי. כחלופה, להשתמש פיפטה P200 כדי להקטין את הסיכויים של מטריד את לאטמוספרה. - להוסיף 500 µL של 100% אלכוהול איזופרופיל כל מדגם ומערבבים על ידי היפוך במשך 15 שניות.
- דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 12 000 ב 4 ° C, להחזיר את הצינורות בטמפרטורת החדר. למחוק את אלכוהול איזופרופיל על-ידי היפוך כל שפופרת.
הערה: גלולה RNA קטן לבן בדרך כלל ניתן לראות אבל לפעמים אולי לא. - להוסיף 1 מ"ל של 75% אתנול (להכין מ- 100% אתנול ומים ללא RNase) כל דגימה של קצרה מערבולת כל שפופרת במהירות המרבית.
- צנטריפוגה 5 דקות ב g x 7 500 ב 4 ° C, להחזיר את הצינורות בטמפרטורת החדר.
- למחוק האתנול 75% על-ידי היפוך כל שפופרת והקש בקלילות נגד נייר חום כדי להסיר את כל שארית.
הערה: אם נדרש, השתמש מסונן-טיפ כדי להסיר אלכוהול ליד בגדר RNA. עצה שינוי בין הדגימות. - השאירו פתח המכסה ואוויר יבש בגדר RNA במשך כ- 15-20 דקות.
הערה: RNA כדורי עשויה להפוך שקוף במהלך שלב זה. - כמו ה-RNA solubilization מ בגדר תלויי-גודל, להעריך את גודל בגדר כדי לקבוע את כמות המים ללא RNase כדי לשמש solubilize את הרנ א. רשום את עוצמת הקול (10-25 µL) עבור כל דגימה.
הערה: השלב זה בסך הכל איכותי. אם ה-RNA צניפה תואריהל, להוסיף 10 µL של מים נטולי RNA המדגם. - להוסיף 10-25 µL של מים נטולי RNase כל דגימה (שנקבע מראש נפח בשלב 3.24).
- דגירה המדגם 5 דקות בתוך גוש חום ב 60 מעלות צלזיוס. בקצרה מערבולת הצינורות.
- דגירה המדגם של 5 דקות נוספות באותו בלוק חום ב 60 מעלות צלזיוס.
- מהיר-ספין כל מכונית קטנה ספין צנטריפוגה ודוגמאות מיד לשים על קרח.
- לקבוע את ריכוז ה-RNA וטוהר. לבצע שעתוק במהופך (RT) כדי להשיג cDNA או לאחסן דגימות במקפיא-80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
הערה: הימנע מחזורים ההקפאה/ההפשרה מרובים כמו זה מבזה דגימות ה-RNA.
4. קביעת ריכוז שומן RNA וטוהר
- אם טרי, רקמת שומן RNA הדגימות היו חילוץ ו solubilized או מראש לאחסן במקפיא-80 ° C, לאסוף את כל הדגימות ולאפשר להם להפשיר על הקרח עד תחילת ההליך. זה צריך להיעשות לפני ההתחלה של השלב הבא או בסוף הבידוד להימנע מספר מחזורים ההקפאה/ההפשרה.
- להכין לזהות שני זוגות 1.5 mL ללא RNase חרוט צינורות, מכניסים אותם מתלה צינור.
- כאשר כל הדגימות RNA הם לגמרי הקרת, מערבולת מדגם עבור 1 s ולשים בחזרה על הקרח.
- שתדללו הפתרון טה 100-fold x 1 ב RNA במערכה הראשונה של נטול RNase 1.5 mL חרוט צינורות באמצעות סינון ללא RNase טיפים (לשים µL 99 בפתרון טה 1 x ו- 1 µL של RNA הצינור).
- חזור על כל דגימה.
הערה: אמצעי האחסון עשוי להיות שונה עבור כל ספקטרופוטומטרים בהתאם cuvette פעם. - לאחר כל דוגמאות מעובדים, מערבולת כל מדולל הדגימה.
- לפי התקנון של ספקטרופוטומטרים כדי לכייל את המכשיר באמצעות כרטיס ריק (1 x טה) לפני עיבוד הדגימות RNA מדולל.
- להעביר את הדגימות RNA מדולל cuvette קוורץ ולקבוע את הריכוז של כל דגימה-260 ננומטר.
הערה: אם ספקטרופוטומטרים אינו מספק את הריכוז הסופי של RNA, השתמש בנוסחה זו כדי לחשב: RNA (µg/µL) = OD260 x מקדם דילול (µL רנ א/1 000 µg 40). - לקבוע את טוהר RNA כל דגימה על-ידי חישוב היחס OD260/OD280.
הערה: יחס OD260/OD280 סביב 2.0 נחשבת בדרך כלל טהור רנ א12. מומלץ מאוד איכות ה-RNA מאומתת. כדי לעשות זאת, לשים µg 1 של RNA-agarose.1% ג'ל אקונומיקה עם מאגר x TBE 1 (בסיס טריס 89 מ מ, חומצה בורית 89 מ מ ו- 2 מ מ EDTA, pH 8.0), 1% מלבין פתרון13 (איור 3). RNA באיכות טובה מאוד מראה להקות rRNA 28S והן 18S, הלהקה 28S. צריך להיות יותר חזק 18S. איכות ה-RNA מקובל כאשר שתיהן rRNA גלויים בעוצמה דומה. איכות ה-RNA הופך לקוי הרגע שהלהקה 18S הוא חזק יותר מאשר הלהקה 28S, וכאשר כתם הוא גלוי, הרומז על מצבה העגום של RNA השפלה. - עבור כל דגימה, להכין 10 µL של 0.5 µg/µL של RNA מן המלאי בקבוצה השנייה של נטול RNase 1.5 mL חרוט צינורות באמצעות RNase ללא מים כדי לדלל את הדגימות לפי הצורך. דגימות אלה משמשים RT להשיג cDNA.
- לאחר כל דוגמאות מעובדים, להתחיל RT או לאחסן דגימות במקפיא-80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
5. הפוך-שעתוק (RT)
- דוגמאות רקמת שומן RNA היו טריים מדולל כדי µg 0.5/µL או מראש לאחסן במקפיא-80 ° C, לאסוף דגימות, וכל ריאגנטים ולאפשר להם להפשיר על הקרח עד תחילת ההליך.
- לשים המדף רצועת צינור PCR על קרח. ברגע? מספיק קר להכין ולזהות ערכה אחת של PCR RNase ללא צינור רצועות ולשים אותם על המדף. כוללים כרטיס ריק.
- להכין את התגובה לטיפול DNase הרנ א: להפוך את תערובת הבסיס (עבור הכמות הדרושה של מדגם + 1 לדוגמה) של הבאות (כמויות עבור מדגם 1): µL 1 של 10 X תגובת מאגר עם MgCl2, µL 0.5 של DNase (U 1/µl), ואני µL 7.5 של RNase ללא מים באמצעות סינון-טיפים. לוותר על µL 9 ב כל שפופרת.
- להוסיף 1 µL של 0.5 µg µL של RNA כל מדגם אל הצינור המתאים, לשים את הפקקים על כל רצועת ו מהיר-ספין רצועות כל מיני להסתובב צנטריפוגה כדי להביא את הדגימה לתחתית הצינור. להוסיף 1 µL של מים נטולי RNA הריק.
- דגירה רצועות כל שפופרת של הצנטרפוגה תרמית או בלוק חימום ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לשים את הרצועה צינור בחזרה על המדף על קרח.
- להוסיף 1 µL של EDTA (50 מ מ) כל שפופרת, דגירה רצועות כל שפופרת של הצנטרפוגה תרמית או בלוק חימום-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לשים את הרצועה צינור בחזרה על המדף על קרח.
- להפוך את תערובת הבסיס (עבור המספר הנדרש של דגימות בתוספת 1 לדוגמה) של הבאות (כמויות עבור מדגם 1): 1 µL של hexamers אקראיים (0.2 µg/µL), µL 1 של מיקס dNTP (מכיל כל אחד deoxynucleotides 4-ריכוז של 10 מ מ). לוותר על 2 µL של המיקס מאסטר כל צינור באמצעות סינון-טיפים. עצה שינוי בין הדגימות.
- דגירה רצועות כל שפופרת של הצנטרפוגה תרמית או בלוק חימום-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. תחזיר את רצועת צינור לתוך הגוף של קרח.
- להפוך את תערובת הבסיס (עבור המספר הנדרש של דגימות בתוספת 1 לדוגמה) של הבאות (כמויות עבור מדגם 1): 4 µL של 5 x RT מאגר, µL 1 של RNase מעכב (20 U µL), µL 0.25 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL), µL 1.75 נוקלאז ללא מים. לוותר על µL 7 כל צינור באמצעות טיפים מסוננים. עצה שינוי בין הדגימות.
- לבצע RT הצנטרפוגה תרמי על-ידי הגדרת התוכנית הבאה: 10 דקות 25 ° c, 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס. לשים את רצועות צינור בחזרה על המדף על קרח.
- להכין לזהות ערכה אחת של PCR RNase ללא צינור רצועות, לשים אותם על המדף.
- עבור כל דגימה, להכין את הנפח הרצוי של 1:5 cDNA מדולל מן המלאי ברצועות צינור חדש באמצעות הנדסה גנטית מים. הדגימות cDNA מדולל 1:5 ישמש עבור ה-PCR בזמן אמת.
- לאחר כל דוגמאות מעובדים, להתחיל PCR בזמן אמת או לאחסן דגימות (מניות and דגימות מדולל) במקפיא-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
6. בזמן אמת PCR על ביטוי גנים ברקמת שומן
הערה: למנוע חשיפת של הפלורסנט לאור. להלן הפרוטוקול מתאר ההגברה של הפניה ג'ין s1614. את צבעי בסיס ותנאי PCR צריך להיות שונה על פי הגן עניין.
- אם cDNA הדגימות היו טריים מדולל 1:5 או מראש לאחסן במקפיא-20 ° C, לאסוף את כל דגימות של ריאגנטים ולאפשר להם להפשיר על הקרח עד תחילת ההליך.
- לשים ארון התקשורת עבור רצועות צינור PCR בזמן אמת על קרח. ברגע? מספיק קר להכין ולזהות ערכה אחת של אמת PCR צינור רצועות ולשים אותם על המדף. להכין כל מדגם הריק של כפילויות.
- להפוך את תערובת הבסיס (עבור המספר הנדרש של דגימות בתוספת 1 לדוגמה) של הבאות (כמויות עבור מדגם 1): 1.9 µL של מים הנדסה גנטית, µL 5 של הפלורסנט (למשל SYBR ירוק), µL 0.3 של פריימר לפנים, µL 0.3 של ומהצמיגים הפוכה. לוותר על µL 7.5 בכל שפופרת.
- להוסיף 2.5 µL של cDNA מדולל 1:5 מתוך כל מדגם הצינור המתאים. להוסיף 2.5 µL של מים הנדסה גנטית החסר. לשים את הפקקים על כל רצועת קומיקס.
- בצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את התוכנית הבאה ב- PCR בזמן אמת: 10 דקות-95 ° C ו 40 מחזורי 15 s-50 ° C, 30 s ב 60 מעלות צלזיוס, 30 s-70 מעלות צלזיוס. מכניסים את רצועות מדגם הרוטור של המכונה PCR בזמן אמת, הפעלת התוכנית.
הערה: הצנטרפוגה תרמי התנאים עשויים להשתנות בהתאם את המנגנון המשמש ואת הגן עניין. תוצאות הביטוי mRNA המוצגים באיור 3 הצג לפטין mRNA הגברה מנורמל על ידי הגן הפניה S16 mRNA הגברה14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות ההליך necropsy, שלוש רקמות adipose לבן היו נאספים, משוקלל של שתי הקבוצות של עכברים (N ו- HF דיאטה-fed עכברים). כצפוי, עכברים על הדיאטה HF עלה במשקל הגוף הסופי ועודף משקל בהשוואה הארנבונים מאותה בדיאטה N (טבלה 1). תצפיות אלה היו מלוות יותר מאשר עלייה 2-fold במשקל של PGF, PRF, SCF בעכברים שמנים בהשוואה לאלו בדיאטה N.
לפני ביצוע ניסוי מדעי עם הרנ א מבודד, הטוהר שלו הוערך כפי שמתואר בשלב 4.9. עבור כל שומן לבן, מיוצר RNA בידוד באמצעות פנול פתרון דגימות עם איכות נאותה כיחס ש-od260/OD280 היה בסביבות 2.0 אשר נחשב טהור כמו עבור ה-RNA (טבלה 2). נתוני זמן-אמת PCR הראה כי לפטין mRNA הביטוי היה משמעותי מוגברת ב PGF, PRF ו- SCF של עכברים שמנים בהשוואה לאלו בדיאטה N (איור 4א). ואכן, ההבדלים נצפתה בביטוי mRNA לפטין היו לא בשל וריאציה של s16, ההתייחסות הגן נהגה לנרמל את התוצאות, בין שתי הקבוצות של עכברים כמו Ct ערכים שונו (איור 4B). לפיכך, s16 יכול באופן אמין לשמש גן הפניה להבעה mRNA PGF, PRF ו- SCF בעת דיאטה HF הוא פרמטר ב פרוטוקול המחקר.
איור 1 . לוקליזציה האנטומי של שומן לבן בעכברים. עכבר זכר בדיאטה N יש כבר גזור כדי להראות הלוקליזציה של כל רקמת שומן דיפו בלוטת יותרת הכליה. SCF (א), PGF (B), PRF (C) , בלוטת יותרת הכליה (D). PGF, פרי-האשכים שומן; PRF, שומן פרי-כליות; SCF, שומן תת עורית בבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . RNA פרוטוקול בידוד תרשים זרימה באמצעות פנול פתרון. ייצוג סכמטי של השלבים הנדרשים כדי לבודד RNA של שומן לבן מקורקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הערכת איכות RNA על ג'ל אקונומיקה. 1 ug של RNA מבודד מן השומן התת-עורית (SCF) ושומן פרי-האשכים (PGF) מופרדים על 1% agarose מלבין ג'ל אלקטרופורזה. 28s ו- 18s rRNA הם דמיינו ידי UV-transillumination. על ג'ל RNA מבודד SCF ו- PGF של עכבר אכלו דיאטה רגילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ההשפעה של דיאטה HF על ביטוי mRNA לפטין, s16 שומן לבן. לפטין () s16 (B) mRNA הבעה. נתונים עבור לפטין הם מנורמל s16 mRNA רמות ואילו נתונים עבור s16 מוצגים כערך Ct שתיהן מוצגות כחלק זאת אומרת ± SE עם n = 12-13 לכל קבוצה. * p < 0.05 בהשוואה לתזונה N. N, נורמלי; HF, עתירת שומן; PGF, פרי-האשכים שומן; PRF, שומן פרי-כליות; SCF, שומן תת עורית בבטן. איור זה שונה מטאן, פ ואח, השמנת יתר (2014) 22, 2201-2209. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| N דיאטה | דיאטה HF | |
| משקל הגוף הסופי (g) | 37.5 ± 1.3 | 1.7* 46.7 ± |
| עלייה במשקל (g) | 6.6 ± 0.7 | 1.0* 16.7 ± |
| PGF (ז) | 1.08 ± 0.17 | 0.15* 2.19 ± |
| PRF (g) | 0.79 ± 0.15 | 0.06* 1.71 ± |
| SCF (g) | 1.62 ± 0.35 | 0.20* 3.55 ± |
טבלה 1. השפעת תזונה HF על משקולות רקמת שומן הגוף ואת הלבן. הערכים מבוטאים כפי שאומר ± SE עם n = 14-15 לכל קבוצה. * p < 0.05 בהשוואה לתזונה N. N, נורמלי; HF, עתירת שומן; PGF, פרי-האשכים שומן; PRF, שומן פרי-כליות; SCF, שומן תת עורית בבטן. איור זה שונה מטאן, פ ואח, השמנת יתר (2014) 22, 2201-2209.
| דגימות | יחס OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
בטבלה 2. טוהר RNA לאחר בידוד של רקמות adipose לבן. n = 3 בכל רקמת שומן. PGF, פרי-האשכים שומן; PRF, שומן פרי-כליות; SCF, שומן תת עורית בבטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבאים HF-דיאטה האכלה, העכברים המשמינים נמצאו הגדילו הגוף ועובי שומן לבן לעומת עכברים שקיבלו תזונה N. RNA חילוץ באמצעות פנול פתרון הניב דגימות עם טוהר טוב. לפטין adipokine המיוצר בעיקר על ידי רקמת שומן, ידוע כדי להתאים באופן חיובי עם מסת שומן16. כצפוי, לפטין mRNA הביטוי עלה בעכברים שמנים ב concomitance עם מסת שומן.
בשיטה זו יש מספר שלבים קריטיים. האחד העיקריים הוא זיהום של דיפו שומן לבן אחד עם השני, כפי שהיא מכונה רקמת שומן שונה מחסני שיש פונקציות שונות2,5. זיהום יכול להביא תוצאות מטעות יישומים במורד הזרם. בנוסף, כפי השומן נוטה להתייבש פעם במגע עם האוויר, איסוף שומן לבן בקצב קבוע ובצורה עקבית בין עכברים מומלץ אם המשקל צריך להילקח. אחרת, המשקל הכולל של כרית השומן עלולים להיות שגויים. על מנת לקבל RNA של איכות טובה, תשואה, בעקבות MIQE שפורסמו לאחרונה את הנחיות הוא נכס מובהק17. בפרט, ביצוע דגימה מצוין אבקת במהלך טחינת יכול לסייע למקסם את התשואה. זה הגדלת המגע בין רקמות אבקת פנול הפתרון, במהלך ה-RNA בידוד. אחרון חביב הוא הבידוד של השכבה המכילות RNA בתקופת הבידוד RNA (שלב 3.12). כמו שומן הוא פחות צפוף מאשר מים, ממוקם מעל השלב של ריבית. מזעור carry-over של שומן יש צורך להפחית הפרעות עם יישומים במורד הזרם.
מגבלה אחת של שיטה זו היא מיומנות נדרש לבצע מספר צעדים ההליך, כמו גם את הצורך לעבוד עם חומרים כימיים מזיקים במהלך בידוד ה-RNA. יתר על כן, התהליך כולו הוא עמל רב.
אין חלופות רבות בשיטה של רקמת שומן אוסף ודגימת עיבוד לפני ה-RNA בידוד מלבד הפרטים הקטנים אשר מותאמים בדרך כלל על-ידי כל משתמש. במקרה של RNA בידוד, אפשרויות רבות זמינות כמו פנול/כלורופורם חילוץ או RNA אלייזה. ישנם יתרונות וחסרונות לכל אפשרות, זה תלוי למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתבסס על יישומים במורד הזרם. פנול/כלורופורם החילוץ הוא פחות יקר אבל מחייב שימוש ריאגנטים מזיקים והוא מפרך. אלייזה RNA הם בדרך כלל יקרים יותר אך ההליך מהיר בדרך כלל מניבה דגימות עם איכות טובה, טוהר. חשוב לשקול את התשואה והטוהר של RNA כיוון החומר מוגבל שומן לבן אשר מורכבת בעיקר של שומן. היתרון העיקרי באמצעות פנול פתרון לבידוד (פנול/כלורופורם מיצוי) היא האפשרות של בידוד RNA DNA, חלבונים מ מדגם יחיד18. זוהי עלות, זמן-אפקטיביות זה מקטין את מספר עכברים נדרש להשיג מספיק חומר. כפי שהוזכר קודם לכן, מסת שומן מוגבל דגמים העכבר. עבור אלו עכברים, פיצול רקמת שומן הקרקע לשלושה חלקים להשיג בנפרד RNA, DNA וחלבון לא מומלץ כי זה עלול להוביל חומר לא מספיקות עבור יישומים במורד הזרם. כדי לעקוף בעיה זו, אפשרי גם בריכה יחד דומה דיפו רקמת שומן מן מספר עכברים בהתבסס על קריטריונים המוגדרים על-ידי המשתמש, אשר מוביל מספר רב יותר של בעלי חיים צריך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי סוכרת קנדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
