Summary
इस पेपर का उद्देश्य एक कदम दर कदम प्रक्रिया को चूहों से अलग सफेद वसा ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए, वसा के नमूनों की प्रक्रिया और आरएनए निकालने के लिए प्रस्तुत है ।
Abstract
अंय ऊतकों की तुलना में, सफेद वसा ऊतक एक काफी कम आरएनए और ऐसे वास्तविक समय पीसीआर और पश्चिमी दाग के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए प्रोटीन सामग्री है, क्योंकि यह ज्यादातर लिपिड शामिल हैं । वसा ऊतक नमूनों से आरएनए अलगाव भी चुनौतीपूर्ण है के रूप में अतिरिक्त कदम इन लिपिड से बचने के लिए आवश्यक हैं । यहाँ, हम चूहों से तीन शारीरिक विभिन्न सफेद वसा ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं, इन नमूनों की प्रक्रिया और आरएनए अलगाव प्रदर्शन करने के लिए. हम आगे वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग सीडीएनए और जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के संश्लेषण का वर्णन । इसके द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल पशु के बाल और वसा पैड पर रक्त के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पार-ऊतक संग्रह के दौरान अलग मोटी पैड के बीच संदूषण से संक्रमण की कमी की अनुमति देता है । यह भी पर्याप्त मात्रा और आरएनए निकाली की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है. इस प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से किसी भी माउस मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है जहां वसा ऊतक नमूनों को नियमित प्रयोग के लिए आवश्यक है जैसे वास्तविक समय पीसीआर लेकिन प्राथमिक adipocytes सेल संस्कृति से अलगाव के लिए इरादा नहीं है ।
Introduction
मोटापा एक विश्वव्यापी महामारी है जो इस प्रकार के रूप में जटिलताओं को जन्म दे सकता है 2 मधुमेह1. आहार-प्रेरित मोटापे से ग्रस्त और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल अक्सर मोटापे और उससे जुड़े जटिलताओं में अनुसंधान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । परंपरागत रूप से, सफेद वसा ऊतक अतिरिक्त ऊर्जा के लिए एक भंडारण डिब्बे के रूप में जाना जाता है और ज्यादातर लिपिड से बना है, जबकि ब्राउन वसा ऊतक गर्मी में ऊर्जा धर्मांतरित2,3. वसा ऊतक गतिशील है और विस्तार और इस तरह के भोजन के सेवन और शारीरिक गतिविधि के रूप में कई कारकों के आधार पर हटना होगा । इसलिए, इन परिवर्तनों के लिए योगदान कारकों का निर्धारण करने के लिए, पर्याप्त वसा ऊतक संग्रह और हैंडलिंग की आवश्यकता है4।
सफेद वसा ऊतकों के बीच, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि चमड़े के नीचे और आंत में वसा डिपो संरचनात्मक स्थानीयकरण और समारोह2,5जैसे विभिन्न गुण हैं । नतीजतन, विरोधी परिणामों या बड़ी परिवर्तनशीलता से बचने के लिए ध्यान की जरूरत है जब वसा पैड इकट्ठा इन विभिन्न वसा डिपो के बीच पार संदूषण से बचने के लिए लिया जाना है ।
इसके अलावा, वहां तीन प्रमुख चुनौतियों जब आरएनए या चूहों सफेद वसा ऊतक से प्रोटीन अलग कर रहे हैं । सबसे पहले, मोटापे से ग्रस्त चूहों में वसा पैड का संग्रह विभिन्न सफेद वसा डिपो अलग करता है जो सीमा के रूप में एक आसान काम नहीं है, इस तरह के गुर्दे और दिल6के रूप में अन्य अंगों के विपरीत हमेशा स्पष्ट नहीं है. दूसरा, वसा ऊतक के उच्च लिपिड सामग्री के कारण, आरएनए या प्रोटीन अलगाव के दौरान, लिपिड की एक परत शीर्ष पर तैरता है और नमूने के लिए सीधी पहुँच रोकता है । तीसरा, ब्राउन वसा ऊतक या अंय ऊतकों के विरोध के रूप में, सफेद वसा ऊतक काफी कम आरएनए और प्रोटीन सामग्री है और यह प्रमुख चिंता का विषय है जब युवा चूहों का उपयोग कर, चूहों एक सामांय (N) आहार और चूहों जो कम वसा द्रव्यमान की उंमीद कर रहे है खिलाया (यानी KO मॉडल, दवाओं के साथ उपचार, व्यायाम प्रशिक्षण, आदि) 7 , 8.
इसलिए, वसा ऊतक से आरएनए को अलग करने के लिए उपयुक्त विधि का चयन महत्वपूर्ण है. phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण करने के लिए वैकल्पिक तरीकों वाणिज्यिक किट हैं । वे आम तौर पर एक प्रारंभिक phenol निष्कर्षण कदम पर आधारित है, एक कॉलम9पर आरएनए शुद्धि के बाद । हालांकि, उन किट आम तौर पर कर रहे है और अधिक महंगी और कम उपज के नमूने दे, जबकि आरएनए गुणवत्ता चर सकता है लेकिन कम समय लगता है । हालांकि, phenol समाधान/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए सबसे बड़ा लाभ में से एक यहां वर्णित आरएनए, डीएनए, और एक नमूना10से प्रोटीन अलग करने की संभावना है । के बाद से चूहों वसा पैड आम तौर पर छोटे हैं और आरएनए और प्रोटीन की छोटी मात्रा (विशेष रूप से दुबला माउस मॉडल में) दे, इन प्रोटोकॉल डेटा एक एक छोटे से नमूने से बाहर निकल सकते हैं अधिकतम ।
इस पत्र के उद्देश्य के लिए विस्तार से एक विधि के लिए तीन चूहों सफेद वसा ऊतक डिपो से पर्याप्त नमूना संग्रह के रूप में अच्छी तरह से मात्रा और आरएनए अलगाव की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए वर्णन है । इस प्रोटोकॉल का पालन करके प्राप्त आरएनए वास्तविक समय पीसीआर परख प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक adipocytes से आरएनए अलगाव के लिए इरादा नहीं है ।
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Protocol
जानवरों के संरक्षण के लिए कनाडा की परिषद द्वारा निर्धारित की देखभाल और प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग के लिए मानकों के अनुरूप प्रक्रियाओं में इस्तेमाल चूहों की देखभाल. सभी प्रक्रियाओं दोस्त अनुसंधान केंद्र में विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. पुरुष चूहों से Necropsy और वसा ऊतक संग्रह
- अध्ययन के उद्देश्यों के अनुसार प्रयोगात्मक समूह बनाओ । इस अध्ययन में, नमूने एक C57Bl/6 पृष्ठभूमि (n = 12-14/समूह) पर पुरुष चूहों के दो समूहों से एकत्र किए गए थे । यह सुनिश्चित करें कि यहां उपयोग किए गए चूहे 12-15 सप्ताह की आयु के हैं और 10 सप्ताह11की अवधि के लिए या तो सामांय (N) या उच्च-वसा (HF) आहार और पानी विज्ञापन libitum तक पहुंच के साथ 12-h लाइट/
- Euthanize एक सील कक्ष में माउस रखकर एक माउस जहां यह 6% सह के दौरान उजागर है2 10 मिनट के दौरान ।
- धीरे एक 1 मिलीलीटर सिरिंज एक 26G 1/2po सुई बस जानवर उरोस्थि के बाईं ओर के साथ घुड़सवार और धीरे से जानवर के रक्त की सबसे दूर करने के लिए पिस्टन खींच द्वारा कार्डियक पंचर प्रदर्शन । सुनिश्चित करें कि सिरिंज जानवर के शरीर के समानांतर है । धीरे सिरिंज घुमाएं जबकि पिस्टन खींच अगर रक्त सिरिंज में नहीं आता है ।
नोट: सफल कार्डियक पंचर (०.८ और 1 मिलीलीटर रक्त मात्रा के बीच) रक्त के साथ वसा ऊतक के संदूषण में कमी होगी । - अपनी पीठ पर चूहों रखना और 22G सुई का उपयोग कर पैड पर प्रत्येक पंजा पिन के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है ।
- एक धुंध के साथ, कई बार शराब के साथ माउस की त्वचा रगड़ गर्दन सभी एक एकतरफ़ा गति का पालन करके जननांग अंगों के लिए नीचे रास्ते से शुरू करने के रूप में यह सुनिश्चित करता है कि बाल फ्लैट रहता है और वसा ऊतक नमूनों की बाल संदूषण कम कर देता है बिना बालों को हटाने के ।
- साफ लेकिन नहीं बाँझ संदंश और सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, जननांग अंगों के पास केंद्रीय त्वचा तरक्की और एक छोटे से ०.३ mm चीरा बनाते हैं ।
- खुले हुए छिद्र में क्षैतिज रूप से कैंची डालें और उदर की दीवार से उदर की त्वचा को अलग करें ।
नोट: यह त्वचा और पेट की दीवार और इस अंतरिक्ष में पाया झिल्ली को काटने से नहीं के बीच अंतरिक्ष में कुंद विच्छेदन द्वारा किया जाता है । - संदंश का प्रयोग, खोला छेद के पास केंद्रीय त्वचा तरक्की और लीनिया अल्बा पर त्वचा में कटौती जब तक आप रिब पिंजरे के पास है (~ 4 सेमी माउस आकार पर निर्भर करता है) ।
नोट: यह हवा के लिए आंत वसा ऊतक बेनकाब हो सकता है और वसा पैड जो ऊतक और इसकी सामग्री की अखंडता को बदल सकता है सुखाने के लिए नेतृत्व के रूप में पेट की मांसपेशी काटने से बचें । - रिब पिंजरे के बीच से, ~ 2 सेमी पर दाईं बांह की ओर त्वचा में कटौती । जननांग अंगों के पास से, ~ 2 सेमी पर सही हिंद अंग के ऊपर त्वचा में कटौती ।
- खोला त्वचा के एक कोने खींचो और यह एक 22G सुई का उपयोग पैड पर नीचे पिन । दूसरे कोने के साथ दोहराएं ।
नोट: वसा ऊतक त्वचा पर उजागर उदर चमड़े के नीचे वसा (एससीएफ) (चित्रा 1ए) है । - कुंद विदारक द्वारा एससीएफ इकट्ठा करने और त्वचा के खिलाफ संभव के रूप में फ्लैट के रूप में तैनात शल्य कैंची का उपयोग कर स्किन से काटने । एक बार एकत्र, पूर्व की पहचान एल्यूमीनियम पंनी पर एससीएफ डाल दिया ।
नोट: त्वचा या बालों के साथ वसा ऊतक का संग्रह या दूषित RNases के कारण नमूना गुणवत्ता और आरएनए उपज में परिवर्तन होगा । यदि बहुत अधिक समय वसा ऊतक इकट्ठा करने का खर्च किया जाता है, नमूना भी सूख सकता है जो भी नमूना की गुणवत्ता में परिवर्तन कर सकते हैं । - १.९ के लिए कदम दोहराएं पशु के बाईं ओर पर १.११ । एल्यूमीनियम पंनी में पूल दोनों बाएँ और दाएँ वसा पैड और तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज.
- आंत वसा ऊतकों तक पहुँच प्राप्त करने के लिए, पेट की मांसपेशी में कटौती का उपयोग कर स्वच्छ लेकिन नहीं बाँझ शल्य कैंची और लीनिया अल्बाके साथ संदंश, पर ~ 4 cm, माउस आकार पर निर्भर करता है, गुप्तांग से रिब पिंजरे. तो पेट अंगों की ओर करने के लिए उपयोग किया है ~ २.५ सेमी पर माउस के पीछे की ओर जननांगों से उदर की मांसपेशियों में एक चीरा बनाने.
- प्रजनन अंगों के आसपास वसा पेरि-जननांगों वसा (PGF) (चित्रा 1बी) है । के रूप में PGF अधिवृषण, वृषण और डक्टस deferensसे जुड़ा हुआ है, ध्यान से उन संरचनाओं से छोड़ दिया वसा पैड अलग और पूर्व की पहचान एल्यूमीनियम पंनी पर डाल दिया । दाईं ओर के लिए दोहराएं । एक बार दोनों PGFs एकत्र कर रहे हैं, तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज ।
- बाएं हाथ की ओर से शुरू, पेट की गुहा के दाहिने हाथ की ओर से पेट दूर ले जाकर गुर्दे का पर्दाफाश । गुर्दे के आसपास के वसा ऊतक पेरि-गुर्दे की चर्बी (PRF) (चित्रा 1सी) है । PRF भी अधिवृक्क ग्रंथियों के चारों ओर (चित्रा 1डी).
- अलग और PRF इकट्ठा करने से पहले अधिवृक्क ग्रंथियों को दूर. यह थकाऊ के रूप में वे सिर्फ वसा ऊतक से थोड़ा pinker हो सकता है ।
नोट: गुर्दे वसा ऊतक दूषित हो सकता है और यह इस वसा पैड के भीतर अधिवृक्क ग्रंथियों की पहचान करने के लिए और अधिक कठिन बनाने के रूप में इस कदम के दौरान नहीं हटाया जाना चाहिए. - वापस पेशी दीवार से PRF को अलग, यूरेटर काटने से समाप्त, गुर्दे की धमनी, और नस जो शरीर के बाकी हिस्सों से PRF और गुर्दे अलग । गुर्दे के कैप्सूल को काटने और हटाने से किडनी से PRF को अलग करें । PRF कैप्सूल से जुड़ी रहती है.
- दाईं ओर के लिए चरण १.१५ और १.१७ दोहराएँ । एल्यूमीनियम पंनी में दोनों PRF रखो और तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज ।
- प्रक्रिया चरण १.२ से १.१८ करने के लिए सभी चूहों को एकत्रित करने के लिए दोहराएँ ।
- इस बिंदु पर, वसा ऊतक पीस या एक-८० ° c में नमूनों की दुकान बाद में निष्कर्षण के लिए फ्रीजर के साथ आगे बढ़ें । नमूने छुरा कई वर्षों के लिए-८० ° c में संग्रहित किया जा सकता है4।
2. आरएनए अलगाव के लिए जमीन सफेद वसा ऊतक की तैयारी
नोट: हर कदम के लिए दस्ताने पहनें के रूप में त्वचा RNases जो आरएनए गिरावट को बढ़ावा देने और इस तरह के रूप में, बदल नमूना गुणवत्ता और शाही सेना अलगाव के बाद उपज कर सकते हैं ।
- तैयार करने और पहचान तीन RNase-मुक्त १.५ एमएल शंकु पेंच टोपी ट्यूबों प्रति माउस, एक सफेद वसा ऊतक के प्रत्येक प्रकार के लिए, और उंहें एक रैक पर जगह है ।
नोट: मोटापे से ग्रस्त जानवरों के रूप में वे वसा द्रव्यमान वृद्धि हुई है अतिरिक्त ट्यूबों की आवश्यकता हो सकती है । यह एससीएफ के लिए विशेष रूप से सच है जिसके लिए अप करने के लिए 7 ट्यूबों एक माउस के लिए प्राप्त किया गया था । - ७०% इथेनॉल के साथ पीठ साफ और सतह पर एक स्वच्छ और नए बेंच कागज डाल दिया ।
- चाहे वसा ऊतकों ताजा चूहों से एकत्र किए गए थे या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पहले से संग्रहीत, प्रक्रिया की शुरुआत तक एक तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में सभी नमूनों को इकट्ठा ।
- उंहें तरल नाइट्रोजन कंटेनर में रखकर मोर्टार, मूसल, और रंग को फ्रीज करें । जब तरल नाइट्रोजन ' ' उबाल ' ' के लिए बंद हो जाता है, वसा ऊतक के पीसने शुरू किया जा सकता है ।
नोट: इस कदम से, मोर्टार, रंग, शंकु ट्यूब और वसा ऊतक पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंडा रहने की जरूरत है । किसी भी गर्मी वसा ऊतक पिघल जाएगा और यह शाही सेना निकालने के लिए कठिन बना । इसके अलावा, अगर एक चीनी मिट्टी मोर्टार और मूसल का उपयोग कर, एक सूखी बर्फ और/ - सभी RNase-मुक्त १.५ एमएल शंकु पेंच टोपी ट्यूब सूखी बर्फ पर कदम २.२ पर तैयार उंहें ठंडा करने के लिए जगह है ।
- हाथों पर शीतदंश से बचने के लिए, तरल नाइट्रोजन से मोर्टार उठाने के लिए ब्राउन पेपर की कुछ परतों का उपयोग करें और इसे एक वर्किंग बेंच पर रखें ।
- संदंश का उपयोग करने के लिए तरल नाइट्रोजन से एक वसा ऊतक नमूना इकट्ठा और यह मोर्टार में डाल दिया । जल्दी से एल्यूमीनियम पंनी खोलना और मोर्टार के केंद्र पर नमूना ड्रॉप ।
नोट: यदि वसा ऊतक नमूना बहुत बड़ा है, के रूप में मोटापे से ग्रस्त चूहों के साथ मामला है, एल्यूमीनियम पंनी में छोटे भागों में नमूने अपने अंगूठे का उपयोग कर तोड़ और प्रत्येक भाग अलग से चूर । - तरल नाइट्रोजन से खल उठा और यह मोर्टार में फिट करने के लिए भूरे रंग के कागज की कुछ परतों का प्रयोग करें । जबकि भूरे कागजों के साथ खल धारण करते हुए हथौड़े का प्रयोग कर एक या दो बार मूसल के ऊपर से दबाते हैं । एक ठीक पाउडर प्राप्त किया जाता है जब तक नमूना पीस घूर्णन गति के साथ मोर्टार के खिलाफ नीचे खल दबाएँ.
नोट: यह कदम पर्याप्त आरएनए अलगाव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । वास्तव में, बड़ा टुकड़े की उपस्थिति आरएनए अलगाव में बाधा और उपज को कम करेगा । - एक बार एक ठीक पाउडर प्राप्त है, मूसल को हटाने और तरल नाइट्रोजन से रंग उठाओ और इसका इस्तेमाल करने के लिए इसी पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में नमूना हस्तांतरण ।
नोट: रंग वापस तरल नाइट्रोजन में समय समय पर डुबकी पिघल से नमूने को रोकने के लिए । इसके अलावा, सूखी बर्फ में शंकु ट्यूब हमेशा पिघला से नमूने को रोकने के लिए रखें । एक शंकु ट्यूब के बारे में 2/3 क्षमता के लिए जमीन के नमूने से भरा (~ 1 एमएल) पर्याप्त आरएनए उपज और मात्रा के लिए आवश्यक है । - एक बार के बारे में 1 मिलीलीटर से भर, ट्यूब बंद करो और यह अंय तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में छोड़ ।
नोट: अतिरिक्त नमूने अलग पूर्व ठंडा RNase-मुक्त १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में रखा जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत । - साफ मोर्टार, मूसल, और भूरे रंग के कागजात के साथ रंग से बचने के लिए ले-पर अगले वसा ऊतक नमूने में । डाल मूसल और रंग वापस तरल नाइट्रोजन में ठंडा करने के लिए । हालांकि ब्राउन पेपर RNase-मुक्त नहीं है, हम आरएनए अलगाव के प्रत्येक दिन के लिए भूरे रंग के कागज के एक ताजा खोला पैक का उपयोग करें ।
- अगले नमूने के साथ २.११ करने के लिए २.४ चरणों को दोहराएँ ।
- एक बार सभी नमूनों संसाधित कर रहे हैं, बाद में उपयोग के लिए आरएनए अलगाव या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों की दुकान शुरू करते हैं ।
नोट: ट्यूब को फटने से रोकने के लिए, पूरी तरह से तरल नाइट्रोजन कंटेनर में यह विलय द्वारा एक नमूना बॉक्स फ्रीज । जब काफी शांत बॉक्स से अधिक नाइट्रोजन निकालें और इसे तरल नाइट्रोजन के शीर्ष पर फ्लोट । नमूने बॉक्स में क्रमबद्ध करें और यह एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दिया ।
3. भूमि वसा ऊतक से आरएनए अलगाव
सावधानी: Phenol सॉल्यूशन त्वचा के लिए नुकसानदेह होता है । एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, सुरक्षा चश्मा पहनते है और एक रासायनिक हुड के तहत प्रक्रिया को अंजाम । चरण-दर-चरण फ़्लोचार्ट आरेख 2में दिखाया गया है ।
- तैयार करें और RNase-मुक्त १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के दो सेट की पहचान और एक रैक में डाल दिया ।
- चाहे वसा ऊतकों हौसले से जमीन या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूर्व संग्रहीत थे, प्रक्रिया है जो ज्यादातर कमरे के तापमान पर किया जाता है की शुरुआत तक एक तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में सभी नमूनों को इकट्ठा ।
- का प्रयोग करें संदंश तरल नाइट्रोजन से एक जमीन वसा ऊतक नमूने का चयन करने के लिए और एक ट्यूब रैक में डाल दिया । ट्यूबों पाउडर के ~ 1 मिलीलीटर शामिल करना चाहिए, जो ऊतक पाउडर के आसपास १०० मिलीग्राम से मेल खाती है ।
- धीरे से ट्यूब खोल कर ।
नोट: कमरे के तापमान पर एक बंद ट्यूब छोड़ने या ट्यूब के ढक्कन खोलने भी जल्दी से दबाव के रूप में नुकसान या चोट के लिए सीसा हो सकता है नाइट्रोजन से ट्यूब से बचने के लिए जाता है । - नमूना (phenol समाधान के 1:2 अनुपात: टिशू पाउडर) के लिए phenol समाधान के ५०० µ एल जोड़ें ।
- के बारे में 5 एस के लिए अधिकतम गति पर ट्यूब और भंवर के ढक्कन बंद धीरे और ध्यान से नाइट्रोजन (ट्यूब से बाहर आ हवा की एक आवाज सुना जा सकता है) से दबाव जारी करने के लिए ट्यूब खुला ।
- चरण ३.५ और ३.६ दोहराएँ । नमूना में जोड़ा गया अंतिम phenol समाधान वॉल्यूम 1 mL है ।
- दोहराएं चरण ३.६ तक नमूना पूरी तरह से भंग है ।
नोट: ट्यूब को फटने से रोकने के लिए आगे बढ़ने से पहले सभी दबाव को जारी रखना जरूरी है । - अगले नमूनों के लिए ३.८ से ३.४ कदम दोहराते हुए नमूना कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ ।
- एक बार सभी नमूनों संसाधित कर रहे हैं, अधिकतम गति पर संक्षेप भंवर और कमरे के तापमान पर सभी नमूनों 5 मिनट की मशीन ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर १२ ००० x g पर 10 मिनट के केंद्रापसारक । ट्यूबों वापस कमरे के तापमान को लाओ ।
नोट: केंद्रापसारक के बाद, 3 चरणों चित्रा 2में दिखाया गया है के रूप में उपस्थित हैं: वसा (ऊपर), आरएनए (मध्य) और गोली (नीचे). - प्रत्येक नमूने के लिए, अधिक शाही सेना (मध्य गुलाबी परत) के रूप में संभव के रूप में एक P1000 पिपेट एक फ़िल्टर टिप का उपयोग कर के साथ इसी ट्यूबों के पहले सेट में स्थानांतरण । नमूनों के बीच युक्तियां बदलें ।
- (ऊपर परत) लिपिड द्वारा आरएनए (मध्यम परत) के ंयूनतम संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, पियर्स ट्यूब के पक्ष के पास टिप के साथ शीर्ष चरण । नई शंकु ट्यूबों में आरएनए को नए ट्यूब के किनारों को छूने के बिना इस टिप के बाहर हो सकता है कि लिपिड स्थानांतरित करने को रोकने के लिए वितरण ।
- प्रत्येक नमूना और मिश्रण करने के लिए 15 एस के लिए उलटा से २०० µ एल जोड़ें शुद्ध क्लोरोफॉर्म के कमरे के तापमान पर 10 मिनट ।
- 4 ° c पर १२ ००० x g पर 15 मिनट के केंद्रापसारक और ट्यूबों को वापस कमरे के तापमान पर ले आओ ।
नोट: केंद्रापसारक के बाद, 3 चरणों में मौजूद हैं: आरएनए (ऊपर), जो डीएनए (मध्य) और लाल phenol-क्लोरोफॉर्म जिसमें प्रोटीन (नीचे) शामिल हैं । - प्रत्येक नमूने के लिए, अधिक जलीय पारदर्शी आरएनए-युक्त चरण (शीर्ष चरण) के रूप में एक P1000 पिपेट के साथ इसी शंकु ट्यूबों का दूसरा सेट करने के लिए फ़िल्टर-सुझावों का उपयोग कर स्थानांतरण । प्रत्येक नमूने के बीच युक्तियां बदलें ।
नोट: चरण नाजुक है और अगर आकांक्षा भी जल्दी से किया जाता है शीर्ष चरण दूषित कर सकते हैं । एक विकल्प के रूप में, एक P200 पिपेट का उपयोग करने के लिए एक दौर परेशान करने की संभावना को कम । - 15 सेकंड के लिए उलटा करके प्रत्येक नमूना और मिश्रण करने के लिए १००% isopropanol के ५०० µ एल जोड़ें ।
- गर्मी कमरे के तापमान पर 10 मिनट
- 4 ° c पर १२ ००० x g पर 10 मिनट के केंद्रापसारक और ट्यूबों वापस लाने के कमरे के तापमान के लिए । प्रत्येक ट्यूब पलटने से isopropanol त्यागें ।
नोट: एक छोटी सी सफेद आरएनए गोली आमतौर पर देखा जा सकता है लेकिन अवसर पर नहीं हो सकता है । - ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (१००% इथेनॉल और RNase से तैयार मुक्त पानी) प्रत्येक नमूने और संक्षेप में अधिकतम गति पर प्रत्येक ट्यूब भंवर ।
- 4 ° c पर ७ ५०० x g पर 5 मिनट के केंद्रापसारक और ट्यूबों वापस लाने के कमरे के तापमान के लिए ।
- प्रत्येक ट्यूब औंधा द्वारा ७५% इथेनॉल त्यागें और हल्के से किसी भी बचे हुए को दूर करने के लिए एक भूरे रंग के कागज के खिलाफ नल ।
नोट: यदि आवश्यक हो, आरएनए गोली के पास शराब को हटाने के लिए एक फ़िल्टर-टिप का उपयोग करें । नमूनों के बीच टिप बदलें । - ढक्कन खुला छोड़ दो और हवा के बारे में 15-20 मिनट के लिए आरएनए गोली सूखी ।
नोट: आरएनए छर्रों इस कदम के दौरान पारदर्शी हो सकता है । - आरएनए के रूप में गोली से solubilization आकार पर निर्भर है, RNase-मुक्त पानी की मात्रा का निर्धारण करने के लिए आरएनए solubilize करने के लिए इस्तेमाल किया जा गोली के आकार का मूल्यांकन. नीचे की मात्रा लिखें (10 से 25 µ एल) प्रत्येक नमूने के लिए ।
नोट: यह कदम महज गुणात्मक है । आरएनए गोली नहीं देखा जा सकता है, तो नमूना के लिए आरएनए-मुक्त पानी की 10 µ एल जोड़ें । - प्रत्येक नमूने के लिए RNase-मुफ्त पानी की 10-25 µ एल जोड़ें (३.२४ कदम पर पूर्व निर्धारित मात्रा).
- ६० डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्मी ब्लॉक में नमूना 5 मिनट की मशीन । संक्षेप में ट्यूबों भंवर ।
- ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ही गर्मी ब्लॉक में एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- त्वरित-एक मिनी स्पिन में सभी नमूनों स्पिन केंद्रापसारक और तुरंत बर्फ पर डाल दिया ।
- आरएनए एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण । बाद में उपयोग के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सीडीएनए या स्टोर नमूनों को प्राप्त करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) प्रदर्शन करें ।
नोट: इस नीचा दिखा आरएनए नमूनों के रूप में कई फ्रीज/
4. वसा ऊतक आरएनए एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण
- चाहे वसा ऊतक आरएनए नमूने हौसले से निकाले गए थे और solubilized या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूर्व संग्रहीत, सभी नमूनों को इकट्ठा करने और उन्हें प्रक्रिया के शुरू होने तक बर्फ पर गल करने के लिए अनुमति देते हैं । यह बस अगले कदम के शुरू होने से पहले या अलगाव के अंत में किया जाना चाहिए करने के लिए कई फ्रीज/गल चक्र से बचने के ।
- तैयार करें और RNase-मुक्त १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के दो सेट की पहचान और एक ट्यूब रैक में डाल दिया ।
- सभी आरएनए नमूने पूरी तरह से गल रहे हैं, 1 एस के लिए एक नमूना भंवर और बर्फ पर वापस डाल दिया ।
- अपनी आरएनए १००-RNase-free १.५ एमएल शंकु ट्यूबों के पहले सेट में RNase-मुक्त युक्तियां का उपयोग कर (९९ µ के लिए 1x ते समाधान का l डाल और आरएनए के 1 µ एल ट्यूब करने के लिए)
- प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएँ ।
नोट: संस्करणों का उपयोग किया cuvette के आधार पर प्रत्येक spectrophotometer के लिए भिन्न हो सकता है । - एक बार सभी नमूनों संसाधित कर रहे हैं, भंवर प्रत्येक पतला नमूना ।
- पतला आरएनए नमूनों को संसाधित करने से पहले एक रिक्त (1x TE) का उपयोग करके साधन जांचने के लिए spectrophotometer के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- क्वार्ट्ज cuvette को पतला आरएनए नमूने हस्तांतरण और २६० एनएम में प्रत्येक नमूने की एकाग्रता का निर्धारण ।
नोट: spectrophotometer अंतिम आरएनए एकाग्रता प्रदान नहीं करता है, तो गणना करने के लिए इस सूत्र का उपयोग करें: आरएनए (µ g/µ l) = OD२६० x कमजोर कारक x (४० µ g आरएनए/1 000 µ l). - अनुपात आयुध डिपो२६०/OD२८०की गणना करके प्रत्येक नमूने की आरएनए शुद्धता का निर्धारण ।
नोट: २.० के आसपास एक अनुपात आयुध डिपो२६०/OD२८० आम तौर पर आरएनए12के लिए शुद्ध के रूप में माना जाता है । यह उच्च आरएनए गुणवत्ता सत्यापित है कि सिफारिश की है । आदेश में ऐसा करने के लिए, एक 1% agarose ब्लीच 1x TBE बफर (८९ mm Tris बेस, ८९ mm बोरिक एसिड और 2 मिमी EDTA, पीएच ८.०) और 1% ब्लीच समाधान13 (चित्रा 3) के साथ बनाया जेल पर आरएनए के 1 µ जी डाल दिया । बहुत अच्छी गुणवत्ता की आरएनए दोनों 28S और 18S rRNA बैंड से पता चलता है और 28S बैंड 18S की तुलना में अधिक तीव्र होना चाहिए । आरएनए गुणवत्ता स्वीकार्य है जब दोनों rRNA बैंड एक समान तीव्रता पर दिखाई दे रहे हैं । आरएनए गुणवत्ता 18S बैंड 28S बैंड की तुलना में अधिक तीव्र है पल की कमी हो जाती है, और जब एक धब्बा दिखाई दे रहा है, आरएनए क्षरण का संकेत है । - प्रत्येक नमूने के लिए, ०.५ µ g/µ के दूसरे सेट में शेयर से आरएनए के 10 µ l तैयार करें RNase-फ्री १.५ एमएल शंकु ट्यूबों का उपयोग RNase-मुक्त पानी के रूप में जरूरत के नमूनों को पतला करने के लिए । इन नमूनों सीडीएनए प्राप्त करने के लिए RT के लिए उपयोग किया जाता है ।
- एक बार सभी नमूनों संसाधित कर रहे हैं, प्रारंभ RT या स्टोर नमूनों में एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर बाद में उपयोग के लिए.
5. रिवर्स-प्रतिलेखन (आरटी)
- चाहे वसा ऊतक आरएनए नमूने हौसले से ०.५ µ g/µ l या पूर्व संग्रहित करने के लिए एक-८० ° c फ्रीजर में थे, सभी नमूनों को इकट्ठा, और reएजेंट और प्रक्रिया के शुरू होने तक बर्फ पर गल करने के लिए उन्हें अनुमति देते हैं.
- पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप रैक को बर्फ पर लगा दिया । एक बार ठंडा पर्याप्त तैयार है और RNase मुक्त पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के एक सेट की पहचान और रैक पर डाल दिया । एक रिक्त शामिल हैं ।
- आरएनए के DNase उपचार के लिए प्रतिक्रिया तैयार करें: (1 नमूना के लिए मात्रा) निम्नलिखित में से (नमूना + 1 नमूना की आवश्यक राशि के लिए) एक मास्टर मिश्रण बनाओ: 1 MgCl के साथ 10x प्रतिक्रिया बफर के µ एल2, ०.५ µ एल के DNase मैं (1 यू/µ एल) और ७.५ µ के एल RNase-मुक्त पानी का उपयोग छान-टिप्स. प्रत्येक ट्यूब में 9 µ l बांटो ।
- जोड़ें 1 µ l की ०.५ µ g/µ एल आरएनए के प्रत्येक नमूने से इसी ट्यूब के लिए, प्रत्येक पट्टी पर टोपियां और त्वरित स्पिन एक मिनी स्पिन में सभी स्ट्रिप्स डाल करने के लिए ट्यूब के नीचे नमूना लाने के लिए केंद्रापसारक । रिक्त के लिए आरएनए-मुक्त जल के 1 µ एल जोड़ें ।
- एक थर्मल साइकिल चालक या 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में सभी ट्यूब स्ट्रिप्स गर्मी । ट्यूब बर्फ पर रैक पर वापस पट्टी रखो ।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए EDTA के 1 µ एल जोड़ें (५० मिमी) और एक थर्मल साइकिल चालक में सभी ट्यूब स्ट्रिप्स या एक हीटिंग ब्लॉक में ६५ ° c 10 मिनट के लिए । बर्फ पर रैक पर ट्यूब पट्टी वापस रखो ।
- (1 नमूने के लिए मात्रा) निम्नलिखित में से एक मास्टर मिश्रण (नमूने प्लस के लिए आवश्यक संख्या 1 नमूना): यादृच्छिक hexamers के 1 µ l (०.२ µ g/µ l) और µ मिश्रण के 1 dNTP l (10 मिमी की एकाग्रता पर चार deoxynucleotides में से प्रत्येक शामिल हैं). फ़िल्टर-युक्तियों का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 2 µ एल बांटना । नमूनों के बीच टिप बदलें ।
- 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिल चालक या एक हीटिंग ब्लॉक में सभी ट्यूब स्ट्रिप्स गर्मी । ट्यूब पट्टी बर्फ पर रैक में वापस रखो ।
- (1 नमूने के लिए मात्रा) निम्नलिखित में से एक मास्टर मिश्रण (नमूने प्लस के लिए आवश्यक संख्या 1 नमूना): 5x आरटी बफर के 4 µ l, 1 µ l का RNase अवरोध करनेवाला (20 u/µ l), ०.२५ µ l का रिवर्स transcriptase (२०० u/µ l) और १.७५ µ l का nuclease-मुक्त पानी. तिरस्कृत एक ट्यूब में 7 µ एल फ़िल्टर सुझावों का उपयोग कर । नमूनों के बीच टिप बदलें ।
- निम्न प्रोग्राम की स्थापना करके एक थर्मल साइकिल चालक में आरटी प्रदर्शन: 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, ५० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, ८५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट. ट्यूब स्ट्रिप्स वापस बर्फ पर रैक पर रखो ।
- तैयार करने और RNase मुक्त पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के एक सेट की पहचान और रैक पर डाल दिया ।
- प्रत्येक नमूने के लिए, नए ट्यूब ultrapure पानी का उपयोग स्ट्रिप्स में शेयर से पतला सीडीएनए 1:5 की वांछित मात्रा तैयार करते हैं । 1:5 पतला सीडीएनए नमूनों का प्रयोग रीयल टाइम पीसीआर के लिए किया जाएगा ।
- एक बार सभी नमूनों संसाधित कर रहे हैं, बाद में उपयोग के लिए एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वास्तविक समय पीसीआर या दुकान के नमूनों (स्टॉक और पतला नमूनों) शुरू करते हैं ।
6. वसा ऊतक में जीन अभिव्यक्ति के लिए वास्तविक समय पीसीआर
नोट: प्रकाश के लिए फ्लोरोसेंट डाई को उजागर करने से बचें । नीचे प्रोटोकॉल संदर्भ जीन s16 के प्रवर्धन का वर्णन करता है14। प्राइमरी और पीसीआर की स्थितियों को ब्याज के जीन के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए ।
- चाहे सीडीएनए नमूने हौसले से पतला 1:5 या पूर्व में एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत, सभी नमूनों और रिएजेंट इकट्ठा और उंहें प्रक्रिया के शुरू होने तक बर्फ पर गल की अनुमति ।
- बर्फ पर वास्तविक समय पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के लिए रैक रखो । एक बार ठंड काफी तैयार है और वास्तविक समय पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के एक सेट की पहचान और रैक पर डाल दिया । प्रत्येक नमूना और डुप्लिकेट में रिक्त तैयार करें ।
- (1 नमूने के लिए मात्रा) निम्नलिखित में से एक मास्टर मिश्रण (नमूने प्लस के लिए आवश्यक संख्या 1 नमूना): ultrapure पानी के १.९ µ एल, फ्लोरोसेंट डाई के 5 µ एल (जैसे SYBR ग्रीन) और एक फॉरवर्ड प्राइमरी के ०.३ µ एल और रिवर्स प्राइमर के ०.३ µ एल । प्रत्येक ट्यूब में ७.५ µ एल तिरस्कृत ।
- जोड़ें २.५ µ के l 1:5 पतला सीडीएनए प्रत्येक नमूने से संबंधित ट्यूब करने के लिए. रिक्स के लिए ultrapure जल के २.५ µ l को जोड़ें । प्रत्येक पट्टी पर टोपियां रखो ।
- रीयल-टाइम पीसीआर पर निम्न प्रोग्राम सेट करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें: 10 मिनट में ९५ ° c और 15 एस के ४० चक्र ५० ° c, 30 s पर ६० ° c, 30 s at ७० ° c. वास्तविक समय पीसीआर मशीन के रोटर में नमूना स्ट्रिप्स रखो और कार्यक्रम शुरू करते हैं ।
नोट: थर्मल साइकिल चालक की स्थिति का इस्तेमाल किया तंत्र और ब्याज की जीन के आधार पर भिंन हो सकते हैं । mRNA अभिव्यक्ति परिणाम में प्रस्तुत चित्रा 3 शो लेप्टिन mRNA वर्धन द्वारा सामान्यीकृत संदर्भ जीन S16 mRNA वर्धन14,15.
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Representative Results
necropsy प्रक्रिया के बाद, तीन सफेद वसा ऊतकों और एकत्र चूहों के दो समूहों (एन और HF आहार खिलाया चूहों) से भारित किया गया । जैसा कि उंमीद थी, HF आहार पर चूहों अंतिम शरीर के वजन और वजन N आहार पर littermates की तुलना में वृद्धि हुई थी (तालिका 1) । इन टिप्पणियों से अधिक के साथ थे PGF के वजन में 2 गुना वृद्धि, PRF, और मोटापे से ग्रस्त चूहों में एन आहार पर उन की तुलना में एससीएफ.
पृथक आरएनए के साथ कोई भी प्रयोग करने से पहले, चरण ४.९ में वर्णित के रूप में इसकी शुद्धता का मूल्यांकन किया गया. प्रत्येक सफेद वसा ऊतक के लिए, आरएनए अलगाव phenol समाधान द्वारा पर्याप्त गुणवत्ता के साथ नमूनों का उत्पादन किया के रूप में अनुपात OD260/OD280 २.० के आसपास था जो आरएनए के लिए शुद्ध माना जाता है (तालिका 2) । रीयल टाइम पीसीआर डेटा से पता चला है कि लेप्टिन mRNA अभिव्यक्ति PGF, PRF, और एन आहार पर उन की तुलना में मोटापे से ग्रस्त चूहों के एससीएफ में काफी बढ़ गया था (चित्रा 4ए) । दरअसल, लेप्टिन mRNA अभिव्यक्ति में मनाया मतभेद s16 की भिंनता के कारण नहीं थे, संदर्भ जीन परिणामों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया, सीटी मूल्यों के रूप में चूहों के दो समूहों के बीच बदल नहीं थे (चित्रा 4बी). इस प्रकार, s16 मज़बूती से PGF, PRF, और एससीएफ में mRNA अभिव्यक्ति के लिए एक संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब HF आहार एक अध्ययन प्रोटोकॉल में एक पैरामीटर है ।
चित्र 1 . चूहों में सफेद वसा ऊतक के संरचनात्मक स्थानीयकरण । N आहार पर एक पुरुष माउस को प्रत्येक वसा ऊतक डिपो और अधिवृक्क ग्रंथियों के स्थानीयकरण दिखाने के लिए विच्छेदित किया गया है । एससीएफ (A), PGF (B), PRF (C) और अधिवृक्क ग्रंथि (D). PGF, पेरि-जननांगों वसा; PRF, पेरि-गुर्दे वसा; एससीएफ, उदर चमड़े के नीचे वसा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . आरएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल प्रवाह phenol समाधान का उपयोग कर चार्ट. जमीनी सफेद वसा ऊतक से आरएनए को अलग करने के लिए आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . आरएनए ब्लीच जेल पर गुणवत्ता आकलन । 1. आरएनए के यूजी चमड़े के नीचे वसा (एससीएफ) और पेरि-जननांगों वसा (PGF) से अलग agarose द्वारा एक 1% ट्रो ब्लीच जेल पर अलग है । 28s और 18s rRNA यूवी transillumination द्वारा कल्पना कर रहे हैं । जेल में आरएनए एक सामान्य आहार खिलाया एक चूहे के एससीएफ और PGF से अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . सफेद वसा ऊतक में लेप्टिन और s16 mRNA अभिव्यक्ति पर HF आहार का प्रभाव । लेप्टिन (अ) व s16 (ब) mRNA अभिव्यक्ति. लेप्टिन के लिए डेटा s16 mRNA स्तर को सामान्यीकृत कर रहे हैं, जबकि s16 के लिए डेटा सीटी मूल्य के रूप में दिखाए जाते हैं और दोनों के रूप में n = 12-13 प्रति समूह के साथ मतलब ± एसई प्रस्तुत कर रहे हैं । * p < ०.०५ की तुलना में N diet. N, normal; HF, उच्च वसा; PGF, पेरि-जननांगों वसा; PRF, पेरि-गुर्दे वसा; एससीएफ, उदर चमड़े के नीचे वसा । यह आंकड़ा टैन, पी एट अल, मोटापा (२०१४) 22, 2201-2209 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| एन डाइट | HF आहार | |
| अंतिम शारीरिक वजन (g) | ३७.५ ± १.३ | ४६.७ ± १.७ * |
| वजन बढ़ना (g) | ६.६ ± ०.७ | १६.७ ± १.० * |
| PGF (छ) | १.०८ ± ०.१७ | २.१९ ± ०.१५ * |
| PRF (छ) | ०.७९ ± ०.१५ | १.७१ ± ०.०६ * |
| एससीएफ (छ) | १.६२ ± ०.३५ | ३.५५ ± ०.२० * |
तालिका 1. शरीर और सफेद वसा ऊतक वजन पर HF आहार का प्रभाव । मान के रूप में व्यक्त कर रहे है ± एसई के साथ n = 14-15 प्रति समूह । * p < ०.०५ की तुलना में N diet. N, normal; HF, उच्च वसा; PGF, पेरि-जननांगों वसा; PRF, पेरि-गुर्दे वसा; एससीएफ, उदर चमड़े के नीचे वसा । यह आंकड़ा टैन, पी एट अल, मोटापा (२०१४) 22, 2201-2209 से संशोधित किया गया है ।
| नमूने | प्रमाणत OD260/OD280 |
| PGF १ | २.०४ |
| PGF २ | २.०४ |
| PGF ३ | २.०२ |
| PRF १ | १.९५ |
| PRF २ | २.०८ |
| PRF ३ | २.०८ |
| एससीएफ १ | २.०४ |
| एससीएफ २ | २.०२ |
| एससीएफ ३ | २.०६ |
तालिका 2. आरएनए सफेद वसा ऊतकों से अलगाव के बाद शुद्धता । n = 3 प्रति वसा ऊतक । PGF, पेरि-जननांगों वसा; PRF, पेरि-गुर्दे वसा; एससीएफ, उदर चमड़े के नीचे वसा ।
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Discussion
निंनलिखित HF-आहार खिला, मोटापे से ग्रस्त चूहों के लिए शरीर और सफेद वसा ऊतक वजन में वृद्धि हुई चूहों की तुलना में एक एन आहार खिलाया पाया गया । आरएनए phenol समाधान का उपयोग कर निकाला अच्छी पवित्रता के साथ नमूने झुकेंगे । लेप्टिन एक adipokine मुख्य रूप से वसा ऊतक द्वारा उत्पादित है और वसा द्रव्यमान के साथ सकारात्मक सहसंबंधी करने के लिए जाना जाता है16. जैसी कि अपेक्षा थी, लेप्टिन mRNA अभिव्यक्ति अपने मोटे द्रव्यमान वाले concomitance में लादे हुए चूहों में बढ़ गई.
इस विधि कई महत्वपूर्ण कदम है । प्रमुख एक दूसरे के साथ एक सफेद वसा ऊतक डिपो के संदूषण है के रूप में यह ज्ञात है कि विभिंन वसा ऊतक डिपो विभिंन कार्यों2,5है । संदूषण बहाव अनुप्रयोगों में भ्रामक परिणाम ला सकता है । इसके अलावा, के रूप में वसा हवा के साथ संपर्क में एक बार शुष्क करने के लिए, चूहों के बीच में एक नियमित और लगातार गति से सफेद वसा ऊतक इकट्ठा करने की सिफारिश की है, तो वजन लिया जाना चाहिए । अंयथा, एक वसा पैड का कुल वजन गलत हो सकता है । आदेश में अच्छी गुणवत्ता और उपज की आरएनए प्राप्त करने के लिए, हाल ही में प्रकाशित MIQE दिशानिर्देशों का पालन एक निश्चित संपत्ति है17. विशेष रूप से, पीसने के दौरान बहुत ठीक नमूना पाउडर बनाने में मदद कर सकते है उपज को अधिकतम । यह आरएनए अलगाव के दौरान ऊतक पाउडर और phenol समाधान के बीच संपर्क अधिकतम । पिछले नहीं बल्कि सबसे कम से आरएनए अलगाव (चरण ३.१२) के दौरान शाही सेना की परत का अलगाव है । के रूप में वसा पानी की तुलना में कम घने है, यह ब्याज के चरण के शीर्ष पर तैनात है । वसा के ऊपर ले जाने के न्यूनतम करने के लिए बहाव अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए आवश्यक है.
इस विधि की एक सीमा के लिए प्रक्रिया में कई कदम करने के साथ ही आरएनए अलगाव के दौरान हानिकारक रिएजेंट के साथ काम करने की आवश्यकता कौशल की आवश्यकता है । इसके अलावा पूरी प्रक्रिया महकमा गहन है ।
आम तौर पर प्रत्येक उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित कर रहे हैं जो छोटे विवरण से अलग आरएनए अलगाव से पहले वसा ऊतक संग्रह और नमूना प्रसंस्करण की विधि के लिए कई विकल्प नहीं हैं । आरएनए अलगाव के मामले में, कई विकल्प ऐसे phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या आरएनए अलगाव किट के रूप में उपलब्ध हैं । वहां लाभ और नुकसान प्रत्येक विकल्प के लिए कर रहे है और यह उपयोगकर्ता के लिए सबसे अच्छा बहाव अनुप्रयोगों के आधार पर विधि का चयन करें । Phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कम खर्चीला है, लेकिन हानिकारक एजेंट के उपयोग की आवश्यकता है और श्रमसाध्य है । आरएनए अलगाव किट आम तौर पर और अधिक महंगे हैं, लेकिन प्रक्रिया तेजी से और आम तौर पर अच्छी गुणवत्ता और पवित्रता के साथ नमूनों पैदावार है । यह उपज और आरएनए की पवित्रता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि सामग्री सफेद वसा ऊतक जो मुख्य रूप से वसा से बना है में सीमित है । अलगाव (phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण) के लिए phenol समाधान का उपयोग करने में प्रमुख लाभ आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन से एक एकल नमूना18को अलग करने की संभावना है । यह लागत और समय प्रभावी है क्योंकि यह पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या कम कर देता है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, वसा द्रव्यमान कुछ माउस मॉडलों में सीमित है । इन चूहों के लिए, तीन भागों में बंटवारे जमीन वसा ऊतक आरएनए प्राप्त करने के लिए अलग से, डीएनए और प्रोटीन की सिफारिश नहीं है के रूप में इस बहाव अनुप्रयोगों के लिए अपर्याप्त सामग्री के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस मुद्दे को दरकिनार, यह भी संभव है एक साथ पूल करने के लिए कई उपयोगकर्ता के आधार पर चूहों से समान वसा ऊतक डिपो परिभाषित मानदंड है, जो जानवरों की जरूरत की संख्या में वृद्धि की ओर जाता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम मधुमेह कनाडा द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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