Summary
이 문서의 목적은 마우스에서 다른 흰색 adipose 조직 수집, 지방 샘플 처리 RNA를 추출 하는 단계별 절차를 제시 하는 것입니다.
Abstract
다른 조직에 비해, 백색 지방 조직 있으므로 주로 지질 상당히 적은 RNA와 단백질 콘텐츠를 실시간 PCR 및 서쪽 오 점, 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 있다. 추가 단계는이 지질을 방지 하는 데 필요한 지방 조직 샘플에서 RNA 절연은 또한 도전 이다. 여기, 우리 3 해부학 다른 흰색 adipose 조직 생쥐, 이러한 샘플을 처리 하 고 RNA 격리 수행에서 수집 하는 절차를 제시. 우리는 더 실시간 PCR를 사용 하 여 cDNA 그리고 유전자 식 실험의 합성을 설명 합니다. 이로써 설명된 프로토콜에서 동물의 머리와 지방 패드 교차 오염을 조직 수집 하는 동안 다른 지방 패드 사이 혈액 오염의 감소 수 있습니다. 그것은 또한 적절 한 수량 및 RNA 추출의 품질을 보장 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 지방 조직 샘플은 실시간 PCR 등 일상적인 실험에 필요한 모든 마우스 모델에 널리 적용 될 수 있지만 기본 adipocytes 세포 배양에서 격리에 적합 하지 않습니다.
Introduction
비만 타입-2 당뇨병1등 합병증으로 이어질 수 있는 전 세계적으로 유행 하는. 다이어트 유발 된 비만 유전자 변형 동물 모델에 비만 관련 된 합병증의 연구 자주 사용 됩니다. 전통적으로, 백색 지방 조직 초과 에너지를 위한 저장 격실으로 알려져 있다 이며 주로 지질 구성 된 갈색 지방 조직 열2,3로 에너지를 변환 하는 동안. 지방 조직 동적 확장 하 고 음식 섭취 량과 신체 활동 등 많은 요인에 따라 축소 됩니다. 따라서, 이러한 변화에 기여 요인 결정, 적절 한 지방 조직 수집 및 처리는 필요4.
가운데 흰색 adipose 조직, 그것 일반적으로 피하와 내장 지방 저장소 해부학 지역화 등 다른 속성 있고,2,5기능 허용 됩니다. 따라서, 충돌 하는 결과 또는 큰 변화를 방지 하려면 주의 지방 패드를 수집 하는 때이 다른 지방 저장소 간의 교차 오염을 방지로 이동 해야 합니다.
또한, RNA 또는 단백질 흰 쥐의 지방 조직에서 분리 하는 경우 세 가지 주요 과제 있다. 첫째, 비만 쥐에서 지방 패드를 수집 하지 않습니다 쉬운 일 다른 백색 지방 창 고를 분리 하는 테두리는 항상 명확 하 고, 신장과 심장6등 다른 장기와 달리. 둘째, 지방 조직, RNA 또는 단백질 격리 중의 높은 지질 내용 때문에 지질 층 위에 수레 하 고 샘플에 대 한 직접 액세스를 방지. 셋째, 갈색 지방이 많은 직물, 또는 다른 조직, 반대로 백색 지방 조직 내용이 상당히 낮은 RNA와 단백질 및이 젊은 마우스를 사용할 때 주요 관심사의, 쥐 먹이 정상 (N) 다이어트 이며 쥐 것으로 예상 된다 낮은 뚱뚱한 질량 (즉 코 모델, 치료 약물, 운동 훈련, 등.) 7 , 8.
따라서, 지방 조직에서 RNA를 분리 하는 적절 한 방법을 선택이 중요 합니다. 페 놀/클로 프롬 추출 대체 방법을 상용 키트 있습니다. 그들은 일반적으로 RNA 정화 열9에 따라 초기 페 놀 추출 단계를 기반으로 합니다. 그러나, 그 키트는 일반적으로 더 비싼 및 샘플 낮은 수율의 RNA 품질 변수 수도 주지만 적은 시간이 소요 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 페 놀 솔루션/클로 프롬 추출에 가장 큰 장점 중 하나는 RNA, DNA, 그리고 단일 샘플10에서 단백질 분리의 가능성입니다. 쥐 지방 패드는 일반적으로 작은 있기 때문에 (특히 상체 마우스 모델)에서 RNA와 단백질의 소량을 주고, 이러한 프로토콜 작은 샘플에서 얻을 수 있는 데이터를 극대화 합니다.
이 문서의 목적은 3 쥐 백색 지방 조직 창 고 수량 및 RNA 격리의 품질에서 적절 한 샘플 컬렉션을 확인 하는 방법을 자세히 설명 하기 위해. 이 프로토콜에 따라 얻은 RNA 실시간 PCR 분석 실험을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 교양된 기본 adipocytes에서 RNA 격리에 대 한 것이 아닙니다.
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Protocol
절차에 사용 된 쥐의 관심과 동물의 보호를 위한 캐나다 위원회에 의해 설정 하는 실험 동물의 사용에 대 한 표준 준수. 모든 절차는 대학 동물 관리 및 사용 위원회 춤 연구 센터에 의해 승인 되었다.
1. 검 시 및 남성 쥐에서 지방 조직 컬렉션
- 연구 목적에 따라 실험 그룹을 확인 합니다. 이 연구에서는 샘플 C57Bl/6 배경에 남성 쥐의 2 개 그룹에서 수집 된 (n = 12-14/그룹). 여기에 사용 되는 쥐 나이의 12-15 주 12 h 명암 주기 액세스 일반 (N) 또는 (HF) 높은 지방 다이어트에 유지 됩니다 그리고 물 광고 libitum 10 주11의 기간에 대 한 확인 하십시오.
- 10 분 동안 6% CO2 노출은 밀폐 챔버에 마우스를 배치 하 여 마우스를 안락사.
- 천천히 동물의 흉 골의 왼쪽에 단지 26 G 1/2po 바늘으로 장착 1 mL 주사기를 삽입 하 고 천천히 당기는 동물의 혈액의 대부분을 제거 하는 피스톤에 의해 심장 펑크를 수행 합니다. 주사기는 동물의 신체에 평행선 다는 것을 확인 하십시오. 혈액 되지 않을 경우 주사기에 피스톤을 당기면 주사기를 천천히 회전 합니다.
참고: (사이 0.8 및 1 mL 혈액 볼륨) 성공적인 심장 찔린 지방 조직 혈액의 오염을 줄일 것 이다. - 그것의 뒤에 쥐를 그림 1에서 보듯이 22 G 바늘을 사용 하 여 패드에 각 발을 고정.
- 거 즈로 문질러 알코올로 마우스의 피부 몇 단방향 모션으로 이렇게 하면 머리 플랫 남아 지방 조직 샘플의 머리 오염 감소에 따라 생식 기 기관 내려가면서 목에서 시작 시간 없이 머리 제거.
- 하지만 깨끗 하지 소독 집게와 수술가 위를 사용 하 여, 생식 기 기관 근처 중앙 피부 상승 하 고 작은 0.3 m m 절 개.
- 가로로 열린된 구멍에가 위를 삽입 하 고 복 벽에서 복 부 피부를 분리.
참고: 이것은 피부와 복 부 벽 사이 공간에 무딘 해 부 및 하지 막이이 공간에서 발견을 절단 하 여 이루어집니다. - 집게를 사용 하 여 열린된 구멍 근처 중앙 피부 상승과 커트가 피부는 교육 알바 곽 (마우스 크기에 따라 ~ 4 cm) 근처까지.
참고: 이 내장 지방 조직 공기에 노출 하 고 무결성 조직 및 콘텐츠를 변경할 수 있습니다 어떤 지방 패드의 건조 이어질 수도 복 부 근육을 절단 하지 마십시오. - 흉 곽의 중간에서 ~ 2 cm에 오른쪽 팔 쪽으로 피부를 잘라. 생식 기 기관, 근처에서 ~ 2 cm에 오른쪽 뒷 다리 위에 피부 잘라.
- 열린된 피부의 한 모서리를 스트레칭 하 고 22 G 바늘을 사용 하 여 패드에 그것을 아래로 핀. 다른 모서리와 반복.
참고: 지방 조직에 피부 노출은 복 부 피하 지방 (SCF) (그림 1A). - 무딘 해 부 및 수술가 위는 피부에 대 한 가능한 평면 위치를 사용 하 여 피부에서 절단에 SCF를 수집 합니다. 일단 수집, 사전 확인 된 알루미늄 호 일에는 SCF를 넣어.
참고: 수집 또는 피부 또는 머리와 지방이 많은 조직을 변경 됩니다 오염 샘플 품질 및 RNA 항복 RNases 때문. 수집 하는 지방 조직 너무 많은 시간을 지출 하는 경우 샘플 어떤 또한 샘플의 품질을 변경할 수 있습니다 또한 건조 수 있습니다. - 동물의 왼쪽에 1.9 1.11 단계를 반복 합니다. 알루미늄 호 일에 왼쪽 및 오른쪽 지방 패드를 수영장 및 액체 질소에 샘플을 동결.
- 내장 지방이 많은 조직에 대 한 액세스를 얻으려면, 깨끗 한 하지만 하지 무 균 수술가 위를 사용 하 여 집게를 따라 복 부 근육을 잘라는 교육 알바, 흉 곽에 성 기에서 마우스 크기에 따라 ~ 4 cm에. 그런 다음 뒤쪽으로 마우스의 복 부 장기의 측면에 대 한 액세스를 ~2.5 cm에 성 기에서 복 부 근육에 절 개를 확인 합니다.
- 생식 기관 주위 지방이 peri gonadal 지방 (PGF) (그림 1B) 이다. PGF는 epididymis는 고환, ductus 정 관에 연결 되어, 신중 하 게 그 구조에서 왼쪽된 지방 패드를 분리 하 고 미리 확인 된 알루미늄 호 일에 넣어. 오른쪽 측면에 대 한 반복 합니다. 두 PGFs는 수집 되 면 액체 질소에 샘플을 동결.
- Starting 왼쪽으로, 오른쪽 복 부 구멍에서 용기를 이동 하 여 신장 노출. 신장 주위 지방 조직 peri 신장 지방 (PRF) (그림 1C)입니다. PRF는 또한 부 신 땀 샘 (그림 1D)를 포위 한다.
- 분리 하 고 PRF를 수집 하기 전에 부 신 땀 샘을 제거. 그들은 단지 조금 pinker는 지방 조직 보다 지루한 수 있습니다.
참고: 신장 혈액 오염 지방 조직 하 고이 지방 패드 내 아드레날린을 식별 하기 위해 더 어렵게 만들 수 있습니다이 단계 동안 제거할 수 없습니다. - 다시 근육 벽에서 PRF ureter, 신장 동맥, 및 신장 고 PRF는 시체의 나머지 부분에서 분리 하는 정 맥을 절단 하 여 결말을 격리 합니다. 절단 및 신장 캡슐을 제거 하 여 신장에서 PRF를 격리 합니다. PRF 캡슐에 연결 된 유지 됩니다.
- 오른쪽에 1.15, 1.17 단계를 반복 합니다. 두 PRF를 알루미늄 호 일에 넣고 액체 질소에 샘플을 동결.
- 단계 1.2에 1.18 수집 모든 마우스에서 절차를 반복 합니다.
- 이 시점에서, 지방 조직 연 삭으로 진행 하거나 나중 추출-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장 합니다. 샘플 몇 년4에 대 한-80 ℃에서 안정적으로 저장할 수 있습니다.
2. 준비의 RNA 격리에 대 한 지방 조직 흰색
참고: 피부는 RNA 저하를 홍보할 수 있는 등, 절연 후 샘플 품질 및 RNA 수확량을 변경 RNases 포함 각 단계에 대 한 장갑 착용.
- 준비 및 3 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 스크류 캡 튜브 마우스, 백색 지방이 많은 직물의 각 유형에 대 한 하나의 당을 식별 하 고 선반에 그들을 두십시오.
참고: 그들은 뚱뚱한 질량 증가 비만 동물 추가 튜브를 필요할 수 있습니다. 이것은 특히 한 마우스에 대 한 7 튜브까지는 SCF에 대 한 true 얻은 것 이다. - 70% 에탄올과 벤치를 청소 하 고 표면에 깨끗 하 고 새로운 벤치 종이 넣어.
- 지방 조직 갓 마우스에서 수집 된 또는-80 ° C 냉장고에 미리 저장, 프로시저의 시작 부분까지 한 액체 질소 채워진 컨테이너에서 모든 샘플을 수집 합니다.
- 액체 질소 용기에 그들을 배치 하 여 박격포와 유 봉, 주걱을 동결. 액체 질소는 '종'을 중지, 지방이 많은 직물의 연 삭을 시작할 수 있습니다.
참고: 이 단계, 박격포, 주걱, 원뿔 튜브 및 지방 조직 전체 과정에서 냉장 유지 해야 합니다. 어떤 열 지방 조직에 용 해 하 고 RNA를 추출 하기 어렵게 만듭니다. 또한, 세라믹 박격포 및 방 앗 공이 사용 하는 경우에 그것을 차가운 유지 하 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용할 수 있습니다 하나. - 배치 모든 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 스크류 캡 튜브 2.2 드라이 아이스에 단계에 그들을 준비 합니다.
- 손에 동상이 방지 하려면 갈색 종이의 몇 가지 레이어를 사용 하 여 액체 질소에서 박격포 고 작업 벤치에 그것을 넣어.
- 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 지방 조직 샘플을 수집 하 고 박격포에 넣어. 신속 하 게 알루미늄 호 일을 풀 다 고 박격포의 센터에 샘플을 놓습니다.
참고: 비만 쥐의 경우는 지방 조직 샘플 너무 큰 경우 엄지를 사용 하 여 알루미늄 호 일의 작은 부분에는 샘플을 휴식 하 고 각 부분을 별도로 격파. - 갈색 종이의 몇 가지 레이어를 사용 하 여 액체 질소에서 유 봉 고 박격포에 맞는. 갈색 종이와 유 봉 잡고 한 두 번은 유 봉 위에 칠 망치를 사용 합니다. 미세 분말을 얻을 때까지 샘플을 움직임을 회전 박격포는 유 봉 아래로 누르십시오.
참고: 이 단계는 적절 한 RNA 격리를 얻기 위해 중요 한. 사실, 더 큰 조각의 존재 방해 RNA 격리 하 고 수확량을 감소. - 정밀한 분말을 얻은 제거는 유 봉과 액체 질소에서 주걱을 들고 해당 냉장된 미리 1.5 mL 원뿔 관으로 샘플을 전송 하는 데 사용할.
참고: 다시 녹는에서 샘플을 방지 하기 위해 수시로 액체 질소에는 주걱을 찍어. 또한, 항상 녹고에서 샘플을 방지 하기 위해 드라이 아이스에 원뿔 튜브를 유지. 약 2/3 용량 (~ 1 mL) 지상 샘플 가득 원뿔 튜브는 적절 한 RNA 수율 및 수량 필요 합니다. - 일단 약 1 mL 가득, 튜브 닫고 다른 액체 질소 채워진 컨테이너에 놓습니다.
참고: 초과 샘플 별도 미리 냉장된 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브에 넣어 하 고 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 저장 된 수 있습니다. - 박격포와 유 봉, 주걱을 다음 지방 조직 샘플으로 이어지기를 피하기 위해 갈색 서류와 함께 청소. 진정 액체 질소에 유 봉과 주걱 다시 넣어. 갈색 종이 비록 RNA 격리의 매일 갈색 종이의 갓 열린된 팩 사용 하지 RNase 무료.
- 2.4 2.11 다음 예제와 단계를 반복 합니다.
- 모든 샘플 처리 됩니다 일단 RNA 격리를 시작 하거나 나중에 사용-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
참고: 튜브 파열 되지 않도록 완전히 액체 질소 용기에 물속에 의해 샘플 상자를 고정 합니다. 멋진 충분히 상자에서 과잉 질소를 제거 하는 경우 그것은 액체 질소 위에 플 로트. 상자에 샘플을 정렬 하 고-80 ° C 냉동 고에 넣어.
3. RNA 격리 지상 지방 조직에서
주의: 페 놀 솔루션은 피부에 유해한. 실험실 외 투, 장갑, 안전 안경 착용 하 고 화학 후드 프로시저 실행. 단계별 흐름도 그림 2에 표시 됩니다.
- 준비 및 두 집합이 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 식별 하 고 선반에 넣어.
- Adipose 조직 갓 지상 또는 사전-80 ° C 냉동 고에 저장, 여부를 대부분 실 온에서 수행 절차의 시작까지 액체 질소 채워진 컨테이너에서 모든 샘플을 수집 합니다.
- 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 지상 지방 조직 샘플을 선택 하 고 관 선반에 넣어. 튜브는 조직 분말의 약 100 밀리 그램에 해당 하는 분말의 ~ 1 mL를 포함 해야 합니다.
- 천천히 튜브를 엽니다.
참고: 실 온에서 닫힌된 튜브를 남기거 나 너무 빨리 튜브의 뚜껑을 열고 발생할 수 있습니다 샘플 손실 또는 부상으로 질소의 압력 튜브에서 탈출 하는 경향이 있다. - 샘플을 페 놀 솔루션의 500 µ L를 추가 (1:2 비율의 페 놀 솔루션: 조직 분말).
- 가까운 튜브와 약 5 최대 속도로 소용돌이의 뚜껑 천천히 s. 하 고 신중 하 게 질소 (공기 튜브에서 나오는 소리는 들릴 수 있다)에서 압력을 풀어 튜브를 엽니다.
- 3.5-3.6 단계 반복 합니다. 마지막 페 놀 솔루션 볼륨 샘플에 추가 1 mL 이다.
- 3.6 단계를 반복 하 여 샘플 완전히 해산.
참고: 그것은 튜브 파열 되지 않도록 더 진행 하기 전에 튜브에서 모든 압력을 해제 해야 합니다. - 다음 샘플 단계 3.4-3.8을 반복 하는 동안 실내 온도에 서 서 샘플을 보자.
- 일단 모든 샘플 및 모든 샘플 실 온에서 5 분을 품 어 처리, 짧게 최대 속도로 소용돌이.
- 4 ° c.에 12 000 x g에서 10 분 원심 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
참고: 원심, 후 3 단계는 그림 2와 같이 현재: 지방 (위), RNA (가운데)과 펠 릿 (아래). - 각 샘플에 대 한 전송 많은 RNA (중간 핑크 레이어) 가능한 해당 관의 첫 번째 집합에 필터링 된 팁을 사용 하 여 P1000 피 펫과. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
- 지질 (상위 계층)에 의해 RNA (중간 계층)의 최소한의 오염을 보장 하기 위해, 부근에 튜브의 팁 상위 단계 피어스. RNA는 걸 방지 하기 위해 새로운 튜브의 측면을 건드리지 않고도 새 원뿔 관으로 전송 지질 팁의 외부에 있을 수 있습니다.
- 각 샘플에 순수 클로 프롬의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 미 품 어 10 분 동안 반전에 의해 혼합.
- 4 ° C에서 12 000 x g 15 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
참고: 원심, 후 3 단계는: RNA (위), interphase DNA (중간)를 포함 하 고 붉은 페 놀-클로 프롬 포함 단백질 (아래). - 각 샘플에 대 한 전송 많은 수성 투명 RNA에 포함 된 단계 (최고 단계)로 가능한 해당 원뿔 관의 두 번째 세트 P1000 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 함께. 각 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
참고: Interphase는 깨지기 쉬운 이며 포부 너무 빨리 완료 되 면 상위 단계 오염 될 수 있습니다. 다른 방법으로는 interphase 교란의 기회를 줄이기 위해 P200 피 펫을 사용 합니다. - 각 샘플을 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L을 추가 하 고 15 초에 대 한 반전에 의해 혼합.
- 실 온에서 10 분을 품 어
- 4 ° C에서 12 000 x g에서 10 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고. 각 튜브를 거꾸로 하 여는 소 프로 파 놀을 삭제 합니다.
참고: 작은 흰색 RNA 펠 릿 일반적으로 볼 수 있다 그러나 때때로 하지 않을 수 있습니다. - 각 샘플 및 짧게 소용돌이의 75% 에탄올 (100% 에탄올과 RNase 무료 물에서 준비) 1 mL를 추가 최대 속도로 각 튜브.
- 4 ° C에서 7 500 x g 5 분 원심 하 고 실내 온도에 다시 튜브를가지고.
- 각 튜브를 거꾸로 하 여 75% 에탄올을 무시 하 고 가볍게 갈색 종이 어떤 나머지를 제거에 대 한 누릅니다.
참고: 필요한 경우 필터링-팁을 사용 하 여 RNA 펠 릿 근처 알코올을 제거. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다. - 뚜껑 열고 두고와 공기 약 15-20 분의 RNA 펠 렛 건조.
참고: 이 단계 동안 RNA 펠 릿을 반투명 될 수도 있습니다. - RNA로 펠 릿에서 가용 화는 크기에 따라 다릅니다, RNA를 solubilize 사용 RNase 무료 물 볼륨을 결정 하는 펠 릿의 크기를 평가. 각 샘플의 볼륨 (10 ~ 25 µ L)를 적어 둡니다.
참고: 이 단계는 단지 질적. RNA 펠 릿은 볼 수 없습니다, 시료에 RNA 무료 물 10 µ L를 추가 합니다. - 각 샘플 (미리 결정 된 볼륨 단계 3.24)에 RNase 무료 물 10-25 µ L를 추가 합니다.
- 60 ° c.에 설정 열 블록에 5 분 샘플을 품 어 짧게 소용돌이 튜브.
- 60 ° c.에 동일한 열 블록에 추가 5 분에 대 한 샘플을 품 어
- 빠른 스핀 모든 샘플 미니 원심 분리기 회전 및 즉시 얼음에 넣어.
- RNA 농도 순도 확인 합니다. 나중 사용을 위해-80 ° C 냉동 고에서 역방향 전송 (RT) cDNA를 가져오거나 샘플 저장을 수행 합니다.
참고: 이 RNA 샘플 저하로 여러 냉동/해 동 주기를 하지 마십시오.
4. 지방 조직 RNA 농도 및 순도의 결정
- 든 지방 조직 RNA 샘플 했다 갓 추출 및 solubilized 사전-80 ° C 냉동 고에 저장 된, 모든 샘플을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용. 이 다음 단계 또는 여러 냉동/해 동 주기를 피하기 위해 격리의 끝에서 시작의 바로 전에 끝나야 한다.
- 준비 및 두 집합이 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 식별 하 고 관 선반에 넣어.
- 때 모든 RNA 샘플은 완전히 해 동, 소용돌이 1 s와 얼음에 넣어에 대 한 샘플.
- 희석의 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여 첫 번째 집합에 RNA 100 1 x 테 솔루션 필터링 RNase 무료 팁 (튜브를 넣어 1 x 테 솔루션의 99 µ L 및 RNA의 1 µ L).
- 각 샘플에 대해 반복 합니다.
참고: 볼륨은 cuvette 사용에 따라 각 분 광 광도 계에 대 한 수 있습니다. - 일단 모든 샘플 처리는, 소용돌이 각 샘플을 희석.
- 희석된 RNA 샘플을 처리 하기 전에 빈 (1 x 테)를 사용 하 여 악기를 교정 하는 분 광 광도 계의 프로토콜을 따릅니다.
- 석 영 cuvette에 희석된 RNA 샘플을 전송 하 고 260에 각 샘플의 농도 결정 nm.
참고: 분 광 광도 계 팬 들은 마지막 RNA 농도 정보를 제공 하지 않습니다,이 수식을 사용 하 여이 계산: RNA (µ g / µ L) = OD260 x (40 µ g RNA/1 000 µ L) x 희석 요소. - OD260/OD280비율을 계산 하 여 각 샘플의 RNA 순도 확인 합니다.
참고: 비율 OD260/OD280 2.0 주위는 일반적으로 순수한 RNA12간주 됩니다. RNA 품질 확인 것이 좋습니다. 위해서는 그렇게, 1 x TBE 버퍼 (89 m m 트리 스 베이스, 89 m m 붕와 2 mM EDTA, pH 8.0)로 만든 1 %agarose 표 백제 젤에 RNA의 1 µ g 넣고 1% 표 백제 솔루션13 (그림 3). 아주 좋은 품질의 RNA 보여줍니다 28S와 18S rRNA 밴드 고 28S 밴드는 18 보다 더 긴장 해야 합니다. RNA 품질 허용 때 두 rRNA 밴드 비슷한 강도로 볼 수 있습니다. 18S 밴드는 더 강렬 28S 밴드 보다 고 얼룩은 표시, RNA 저하를 나타내는 순간 RNA 품질 결핍 된다. - 각 샘플에 대 한 0.5 µ g / µ L RNA의 RNase 무료 1.5 mL 원뿔 관을 필요에 따라 샘플을 희석 RNase 무료 물을 사용 하 여 두 번째 집합에 있는 주식에서의 10 µ L를 준비 합니다. 이러한 샘플 RT cDNA를 얻기 위해 사용 됩니다.
- 일단 모든 샘플 처리 됩니다 RT를 시작 하거나 나중에 사용-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
5입니다. 리버스-전사 (RT)
- 지방 조직 RNA 샘플 했다 갓 0.5 µ g / µ L 희석 또는 사전-80 ° C 냉동 고에 저장, 모든 예제 및 시 약을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용.
- 얼음에 PCR 튜브 스트립 랙 위에. 일단 감기 충분히 준비 하 고 식별 집합이 RNase 무료 PCR 튜브 제거 하 고 선반에 넣어. 빈 값을 포함 합니다.
- 준비 하는 RNA의 DNase 치료에 대 한 반응: 다음의 (샘플 + 1 샘플의 필요한 금액)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 반응 버퍼 MgCl2, DNase I (1 U / µ l)과 RNase 무료의 7.5 µ L를 사용 하 여 물의 0.5 µ L X 10의 1 µ L 필터링 팁입니다. 각 관에 9 µ L를 분배.
- 각 스트립에 빠른 스핀 미니 스핀에 모든 스트립 원심 튜브의 하단에 샘플을가지고 모자를 넣어 해당 튜브를 각 샘플에서 RNA의 µ 0.5 µ g/L의 1 µ L를 추가 합니다. 빈에 대 한 RNA 무료 물 1 µ L를 추가 합니다.
- 모든 튜브 스트립 열 cycler 또는 얼음에 선반에 다시 튜브 스트립을 넣어 30 분 동안 37 ° C에가 열 블록에 품 어.
- 각 튜브를 EDTA (50 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 모든 튜브 스트립 튜브 스트립 다시 얼음에 선반에 넣어 10 분 65 ° C에서 난방 블록이 나 열 cycler에 품 어.
- 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 임의의 hexamers (0.2 µ g / µ L)와 dNTP 믹스 (10 m m의 농도에서 4 개의 deoxynucleotides의 각 포함)의 1 µ L의 1 µ L. 필터링 팁을 사용 하 여 각 튜브에 마스터 믹스 2 µ L를 분배. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
- 모든 튜브 스트립 열 cycler 또는 얼음에 랙 튜브 스트립을 다시 넣어 5 분 65 ° C에서 난방 블록에서 품 어.
- 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): RT 버퍼, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 1 µ L, 역전사 (200 U / µ L)의 0.25 µ L과 nuclease 무료 물 1.75 µ L x 5의 4 µ L. 필터링된 팁을 사용 하 여 각 관에서 7 µ L를 분배. 샘플 사이의 팁을 변경 합니다.
- 다음 프로그램을 설정 하 여 열 cycler에서 RT 수행: 25 ° C, 50 ° C, 85 ° c.에 5 분에서 30 분에서 10 분 얼음에 선반에 다시 튜브 스트립 넣어.
- 준비 및 집합이 RNase 무료 PCR 튜브 스트립을 식별 하 고 선반에 넣어.
- 각 샘플에 대 한 원하는 양의 초순 수를 사용 하 여 새로운 튜브 스트립에 주식에서 1:5 희석된 cDNA 준비 합니다. 1:5 희석된 cDNA 샘플 실시간 PCR를 위해 사용 됩니다.
- 모든 샘플 처리 됩니다 일단 실시간 PCR 시작 하거나 나중에 사용-20 ° C 냉동 고에 (재고 및 희석된 샘플) 샘플을 저장.
6. 실시간 PCR 지방 조직에서 유전자 발현에 대 한
참고: 형광 염료가 빛에 노출 하지 마십시오. 프로토콜 아래 참조 유전자 s1614의 확대를 설명합니다. 뇌관 및 PCR 조건 관심사의 유전자에 따라 수정할 수 합니다.
- CDNA 샘플 갓 희석된 1: 5을 했다 또는-20 ° C 냉장고에 미리 저장 된, 모든 샘플 및 시 약을 수집 하 고 절차의 시작까지 얼음에 녹여 하도록 허용.
- 실시간 PCR 튜브 스트립 랙 얼음에 넣어. 일단 감기를 충분히 준비 하 고 실시간에의 한 집합을 식별 PCR 튜브 제거 하 고 선반에 넣어. 각 샘플 및 중복에서 빈 준비.
- 다음의 (샘플 플러스 1 샘플의 필요한 수)에 대 한 마스터 믹스 만들기 (1 샘플 수량): 초순, 형광 염료 (예: SYBR 녹색)의 5 µ L, 앞으로 뇌관의 0.3 µ L 및 역방향 뇌관의 0.3 µ L의 1.9 µ L. 각 관에서 7.5 µ L를 분배.
- 각 샘플에서 해당 튜브 1:5 희석된 cDNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 공백에 대 한 초순 수의 2.5 µ L를 추가 합니다. 각 스트립에 모자를 넣어.
- 실시간 PCR에 다음 프로그램을 설정 하려면 제조업체의 지침에 따라: 95 ° C 및 15의 40 주기에서 10 분에서 50 ° C, 30 s s 60 ° C, 30에서 70 ° c.에 s 실시간 PCR 기계의 회전자에 샘플 스트립을 넣어 하 고 프로그램을 시작 합니다.
참고: 열 cycler 조건 사용 기구 및 관심사의 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. 그림 3 보기 leptin mRNA 증폭 참조 유전자 S16 mRNA 증폭14,15정규화에 mRNA 식 결과.
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Representative Results
검 시 절차에 따라 3 개의 흰색 adipose 조직 수집 되었고 쥐 (N와 HF 다이어트 먹이 쥐)의 두 그룹에서가 중. 예상 했던 대로, 쥐 HF 다이어트 최종 몸 무게와 체중 증가 littermates N 다이어트 (표 1)에 비해 증가 했다. 이러한 관측 함께 했다 이상 2-fold 증가 비만 생쥐에서 PGF, PRF, SCF의 무게에 그에 비해 N 다이어트에.
격리 된 RNA와 어떤 실험을 수행 하기 전에 단계 4.9에에서 설명 된 대로 그것의 순수성 평가 되었습니다. 각 백색 지방 조직에 대 한 페 놀 솔루션 RNA 격리 RNA (표 2)에 대 한 순수한 것으로 간주 되는 비율 OD260/OD280은 약 2.0 샘플 적절 한 품질을 생산. 실시간 PCR 데이터 보여주었다 leptin mRNA 식 PGF, PRF, 및 N 규정식(그림 4)에 그에 비해 비만 생쥐의 SCF에 크게 증가 했다. 실제로, leptin mRNA 식에 관찰 차이 s16, 참조 유전자로 Ct 값이 변경 되지 않은 쥐의 두 그룹 사이의 결과 정규화 하는 데 사용 (그림 4B)의 변형으로 인해 되지 않았습니다. 따라서, s16 사용할 수 있습니다 안정적으로 참조 유전자로 PGF, PRF, SCF에 mRNA 식 때 HF 다이어트 연구 프로토콜에서 매개 변수.
그림 1 . 쥐의 백색 지방 조직 들의 해 부 지역화. N 다이어트에 남성 마우스 각 지방 조직 창 고와 아드레날린의 지역화를 표시 하는 해 부 되어 있다. SCF (A), PGF (B), PRF (C) 고 아드레날린 선 (D). PGF, peri gonadal 지방; PRF, peri 신장 지방; SCF, 복 부 피하 지방 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 페 놀 솔루션을 사용 하 여 RNA 격리 프로토콜 흐름 차트. 도식 표현 접지 백색 지방 조직에서 RNA를 분리 하는 데 필요한 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 표 백제 젤에 RNA 품질 평가입니다. 1 ug 피하 지방 (SCF) 페리 gonadal 지방 (PGF)에서 분리 하는 RNA의 1 %agarose 표 백제 젤에 전기 이동 법에 의해 구분 됩니다. 28s와 18s rRNA UV transillumination에 의해 시각화 됩니다. 젤에는 RNA SCF를 마우스의 PGF 절연 정상적인 식단을 먹이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 백색 지방 조직에 leptin s16 mRNA 표현에 HF 다이어트의 효과. Leptin (A) , s16 (B) mRNA 식입니다. S16에 대 한 데이터는 Ct 값으로 표시 되 고 둘 다 n 평균 ± SE로 표시 됩니다 동안 leptin에 대 한 데이터는 s16 mRNA 수준으로 정규화 = 그룹 당 12-13. * p < 0.05 N 다이어트에 비해입니다. N, 정상; HF, 높은 지방; PGF, peri gonadal 지방; PRF, peri 신장 지방; SCF, 복 부 피하 지방 이 그림에서 탄, 수정 되었습니다 P. 외, 비만 (2014) 22, 2201-2209. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| N 다이어트 | HF 다이어트 | |
| 최종 몸 무게 (g) | 37.5 ± 1.3 | 46.7 ± 1.7* |
| 체중 (g) | 6.6 ± 0.7 | 16.7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1.08 ± 0.17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0.79 ± 0.15 | 1.71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0.35 | 3.55 ± 0.20* |
표 1입니다. 신체와 백색 지방 조직 무게에 HF 다이어트의 효과. 값 의미 n ± SE로 표현 된다 = 그룹 당 14-15. * p < 0.05 N 다이어트에 비해입니다. N, 정상; HF, 높은 지방; PGF, peri gonadal 지방; PRF, peri 신장 지방; SCF, 복 부 피하 지방 이 그림에서 탄, 수정 되었습니다 P. 외, 비만 (2014) 22, 2201-2209.
| 샘플 | 비율 OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
표 2입니다. 백색 지방 조직에서 분리 후 RNA의 순도입니다. n = 지방 조직 당 3. PGF, peri gonadal 지방; PRF, peri 신장 지방; SCF, 복 부 피하 지방
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Discussion
다음 먹이 HF-다이어트, 비만 쥐 몸 및 백색 지방 조직 가중치 N 규정식 먹인 쥐에 비해 증가을 발견 했다. 페 놀 솔루션을 사용 하 여 추출 하는 RNA 좋은 순도와 샘플을 굴복. Leptin은 주로 지방 조직에 의해 생산 하는 adipokine 및 지방 대량16와 긍정적으로 상관 관계 알려져 있다. 예상 했던 대로, leptin mRNA 식 그들의 뚱뚱한 질량을 가진 concomitance에서 비만 생쥐에서 증가 했다.
이 메서드는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다른 지방 조직 창 고 다른 기능2,5는 알려진 대로 중요 한 다른 한 백색 지방 조직 창 고의 오염입니다. 오염 다운스트림 응용 프로그램에서 잘못 된 결과 가져올 수 있다. 또한, 지방 쥐 사이 일정 하 고 일관 된 속도로 백색 지방이 많은 직물 수집 공기와 접촉 한 번 건조 하는 경향이 있다는 것이 좋습니다 경우 무게 이동 해야. 그렇지 않으면, 지방 패드의 총 무게 수 있습니다 잘못 될. 최근에 출판 된 MIQE을 다음의 좋은 품질 및 수율, RNA를 얻기 위하여 지침17명확한 자산입니다. 특히, 연 삭 하는 동안 아주 좋은 샘플 가루를 만드는 수 수율을 극대화. 이 RNA 격리 하는 동안 조직 분말 및 페 놀 솔루션 사이의 접촉을 최대화합니다. 마지막 하지만 적어도 RNA 격리 (3.12 단계) 동안 RNA 포함 된 계층의 분리입니다. 지방이 물 보다 밀도가 덜으로, 관심의 단계 위에 배치 됩니다. 지방의 이어지기를 최소화 하는 것은 다운스트림 응용 프로그램 간섭을 줄일 필요가 있습니다.
이 방법의 한 가지 한계는 절차 RNA 격리 하는 동안 유해한 시 약을 사용 하는 필요에 있는 몇 가지 단계를 수행 하는 데 필요한 기술 이다. 또한, 전체 프로세스는 노동 집약 이다.
지방 조직 수집 및 일반적으로 각 사용자에 의해 조정 되는 작은 세부 사항 제외 하 고 RNA 격리 하기 전에 처리 하는 샘플의 방법에 많은 대안이 없습니다. RNA 격리의 경우 많은 옵션 페 놀/클로 프롬 적 출 또는 RNA 격리 키트 등 사용할 수 있습니다. 각 옵션의 장단점이 있으며 다운스트림 응용 프로그램에는 적합 한 방식을 선택 하는 사용자입니다. 페 놀/클로 프롬 추출 저렴 하지만 유해한 시 약의 사용을 요구 한다 고 힘 드는입니다. RNA 분리 장비는 일반적으로 더 비싼 하지만 절차는 빠르고 일반적으로 좋은 품질과 순도 수율. 그것은 소재 지방의 주로 구성 되는 백색 지방 조직에 제한 되기 때문에 수익률 및 RNA의 순도 고려 하는 것이 중요. 절연 (페 놀/클로 프롬 추출)에 대 한 페 놀 솔루션을 사용 하 여 주요 이점은 이다 RNA, DNA, 그리고 단일 샘플18에서 단백질 분리의 가능성. 이것은 비용 및 시간 효과적인 그것 충분 한 자료를 얻을 하는 데 필요한 마우스의 수를 감소입니다. 앞에서 설명 했 듯이, 지방 일부 마우스 모델에 제한 됩니다. 이 마우스에 대 한 지상 지방 조직 별도로 RNA, DNA와 단백질을 얻기 위해 세 부분으로 분할 권장 되지 않습니다이 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 부족 한 물자를 끌 수도 있습니다. 이 문제를 우회 하는 유사한 지방 조직 창 고 사용자 정의 기준에 따라 여러 마우스에서 필요로 하는 동물의 증가 수에 이르게 함께 풀 수 이기도 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 당뇨병 캐나다에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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