Summary
El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.
Abstract
En comparación con otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene un contenido considerablemente menos RNA y proteína para aplicaciones posteriores como PCR en tiempo real y Western Blot, ya que en su mayoría contiene lípidos. Aislamiento de RNA de las muestras de tejido adiposo también es un reto como pasos adicionales son necesarios para evitar estos lípidos. Aquí, presentamos un procedimiento para recoger tres anatómicamente diferentes blancos los tejidos adiposos de los ratones, para procesar las muestras y realizar aislamiento de RNA. Además describimos la síntesis del cDNA y del gene experimentos de expresión usando PCR en tiempo real. El protocolo aquí descrito permite la reducción de la contaminación de pelo y sangre en almohadillas de grasa, así como la contaminación cruzada entre diferentes cojines gordos durante la recogida de tejido del animal. También se ha optimizado para garantizar la adecuada cantidad y calidad del ARN extraído. Este protocolo puede ser ampliamente aplicada a cualquier modelo de ratón donde las muestras de tejido adiposo son requeridas para experimentos de la rutina como PCR en tiempo real pero no está diseñado para el aislamiento de cultivos celulares de adipocitos primarios.
Introduction
La obesidad es una epidemia en todo el mundo que puede conducir a complicaciones tales como tipo 2 diabetes1. Modelos animales obesos y modificados genéticamente inducida por la dieta se utilizan con frecuencia para la investigación en la obesidad y sus complicaciones asociadas. Tradicionalmente, el tejido adiposo blanco es conocido como un compartimiento de almacenamiento para el exceso de energía y sobre todo se compone de lípidos y tejido adiposo marrón convierte la energía en calor2,3. Tejido adiposo es dinámico y ampliará y encogen dependiendo de muchos factores como el consumo de alimentos y actividad física. Por lo tanto, para determinar los factores que contribuyen a estos cambios, manejo y colección adecuada de tejido adiposo son necesarios4.
Entre los blancos de los tejidos adiposos, está generalmente aceptado que los depósitos de grasa subcutáneos y viscerales tienen diferentes propiedades tales como la localización anatómica y función2,5. En consecuencia, para evitar resultados contradictorios o gran variabilidad, atención debe ser tomado para evitar la contaminación cruzada entre los diferentes depósitos de grasa al recoger cojines gordos.
Por otra parte, hay tres grandes retos cuando aislar RNA o proteína del tejido adiposo de ratones blancos. En primer lugar, recogiendo los cojines gordos en ratones obesos no es tarea fácil como la frontera que separa los diferentes depósitos de grasa blanco no siempre es clara, a diferencia de otros órganos como los riñones y el corazón6. En segundo lugar, debido al contenido alto de lípidos del tejido adiposo, durante el aislamiento de ARN o proteína, una capa de lípidos flota en la parte superior y evita el acceso directo a la muestra. En tercer lugar, a diferencia del tejido adiposo marrón u otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene mucho menor contenido de RNA y proteínas y esto es de gran preocupación al usar ratones jóvenes, ratones alimentaron con una dieta normal (N) y ratones que tienen masas de grasa bajo (es decir, KO modelos, tratamiento con fármacos, ejercen entrenamiento, etcetera.) 7 , 8.
Por lo tanto, es fundamental elegir el método adecuado para aislar el ARN del tejido adiposo. Métodos alternativos a la extracción de fenol/cloroformo son kits comerciales. Se basan típicamente en un paso de extracción de fenol inicial, seguido de purificación de RNA en una columna9. Sin embargo, los kits son típicamente más caros y dan muestras de menor rendimiento, mientras que la calidad del RNA puede ser variable pero mucho menos tiempo. Sin embargo, una de las mayores ventajas para la extracción del fenol/cloroformo solución descrita aquí es la posibilidad de aislar RNA, DNA y proteína de una sola muestra de10. Desde cojines gordos ratones son generalmente pequeñas y dan pequeñas cantidades de RNA y proteínas (especialmente en modelos de ratón magro), estos protocolos maximizan los datos que uno puede salir de una pequeña muestra.
El objetivo de este trabajo es describir detalladamente un método para garantizar la obtención adecuada de depósitos de tejido adiposo blanco tres ratones, así como cantidad y calidad de aislamiento de RNA. RNA obtenido siguiendo este protocolo se puede utilizar para realizar análisis PCR en tiempo real. Este protocolo no está diseñado para el aislamiento de RNA de adipocitos cultivados de primarias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cuidado de los ratones utilizados en los procedimientos de cumplimiento de normas para el cuidado y uso de animales de experimentación establecida por el Consejo Canadiense para la protección de los animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de cuidado Animal y uso en el centro de investigación CHUM.
1. autopsia y colección de tejido adiposo de los ratones macho
- Hacer grupos experimentales según objetivos del estudio. En este estudio, se recolectaron muestras de dos grupos de ratones machos en un fondo de C57Bl/6 (n = 12-14/grupo). Asegúrese de que ratones utilizados aquí son 12-15 semanas de edad y se mantienen en el ciclo de luz/oscuridad de 12-h con acceso normal (N) o dieta alta en grasa (HF) y agua ad libitum durante un periodo de 10 semanas11.
- Eutanasia a un ratón, colocando el ratón en una cámara sellada donde es expuesto a 6% CO2 durante 10 minutos.
- Realizar punción cardiaca lentamente insertando una jeringa de 1 mL con una aguja de 26G 1/2po justo a la izquierda del esternón del animal y tirar lentamente el émbolo para eliminar la mayor parte de la sangre del animal. Asegúrese de que la jeringa esté paralela al cuerpo del animal. Gire lentamente la jeringa tirando el émbolo si no entra sangre en la jeringa.
Nota: Exitosa punción cardiaca (entre 0.8 y 1 mL de volumen de sangre) reducirá la contaminación del tejido adiposo con sangre. - Colocar los ratones en su espalda y pin cada pata en el teclado utilizando una aguja de 22G como se muestra en la figura 1.
- Con una gasa, frotar la piel del ratón con alcohol varias veces desde el cuello hasta los órganos genitales siguiendo un movimiento unidireccional, esto asegura que el pelo sigue siendo plano y reduce la contaminación del pelo de las muestras de tejido adiposo sin depilación.
- Con limpias pero no estériles fórceps y tijeras quirúrgicas, elevar la piel central cerca de los órganos genitales y hacer una incisión de 0,3 mm pequeño.
- Meter las tijeras horizontalmente en el agujero abierto y separar la piel abdominal de la pared abdominal.
Nota: Esto se realiza por disección Roma en el espacio entre la piel y la pared abdominal y no mediante la reducción de las membranas que se encuentran en este espacio. - Usando las pinzas, elevar la piel central cerca del agujero abierto y cortar la piel sobre el linea alba hasta que esté cerca de la caja torácica (~ 4 cm dependiendo del tamaño del ratón).
Nota: Evitar cortar el músculo abdominal, ya que esto podría exponer el tejido adiposo visceral al aire y llevar a sequedad de las almohadillas de grasa que pueden alterar la integridad del tejido y su contenido. - Desde el centro de la caja torácica, cortar la piel hacia el brazo derecho de ~ 2 cm. De cerca de los órganos genitales, cortar la piel por encima de las extremidades derecha de ~ 2 cm.
- Estirar una de las esquinas de la piel abierta y precisar en la almohadilla con una aguja de 22G. Repita con la otra esquina.
Nota: El tejido adiposo en la piel es la grasa subcutánea abdominal (SCF) (figura 1A). - Recoger el SCF por disección y corte de la piel con tijeras quirúrgicas colocados tan plana como sea posible contra la piel. Una vez recogido, poner el SCS en el papel de aluminio previamente identificados.
Nota: Recoger o contaminar el tejido adiposo con la piel o cabello que alterará la muestra calidad y rendimiento de RNA por RNasas. Si se gasta demasiado tiempo recoger el tejido adiposo, la muestra también puede secar el que también pueden alterar la calidad de la muestra. - Repita los pasos 1.9 a 1.11 en el lado izquierdo del animal. Piscina teclas izquierdas y derecha de grasa en el papel de aluminio y congelar la muestra en nitrógeno líquido.
- Para acceder a los tejidos adiposos viscerales, cortar el músculo abdominal usando tijeras quirúrgicas limpias pero no estériles y pinza a lo largo de la linea alba, en ~ 4 cm, dependiendo del tamaño del ratón, de los genitales a la caja torácica. Luego realizar una incisión en los músculos abdominales desde los genitales hacia la parte posterior del ratón ~2.5 cm para tener acceso a la parte de los órganos abdominales.
- La grasa alrededor de los órganos reproductivos es la grasa peri-gonadal (PGF) (figura 1B). Como PGF se une al epidídimo, testículo y el conducto deferente, separar cuidadosamente el cojín gordo izquierdo de esas estructuras y poner en el papel de aluminio previamente identificados. Repita para el lado derecho. Una vez que se recogen dos PGFs, congelar la muestra en nitrógeno líquido.
- A partir de la izquierda, exponer los riñones moviendo el intestino a la cavidad abdominal en el lado derecho. El tejido adiposo que rodea el riñón es la grasa perirrenal (PRF) (figura 1C). PRF también rodea las glándulas suprarrenales (figura 1D).
- Aislar y eliminar las glándulas adrenales antes de recoger la PRF. Esto puede ser tedioso ya que son un poco más rosadas que el tejido adiposo.
Nota: Riñones no deben quitarse durante este paso como sangre puede contaminar el tejido adiposo y hacerlo más difícil de identificar las glándulas suprarrenales en esta almohadilla de grasa. - Aislar la PRF de la pared muscular detrás, terminando cortando el uréter, la arteria renal y vena que separa el PRF y el riñón, el resto del cuerpo. Aislar el PRF del riñón por el corte y eliminación de la cápsula renal. La PRF se mantiene unido a la cápsula.
- Repita los pasos 1.15 y 1.17 de la derecha. Poner ambos PRF en el papel de aluminio y congelar la muestra en nitrógeno líquido.
- Repita el procedimiento de pasos 1.2 a 1.18 para todos los ratones a recogerse.
- En este punto, continuar con el tejido adiposo de esmeril o almacenar las muestras en un congelador de-80 ° C para posterior extracción. Las muestras pueden almacenarse estable a-80 ° C durante varios años4.
2. preparación de suelo blanco tejido adiposo para el aislamiento de ARN
Nota: Guantes para cada paso como piel contiene RNasas que pueden promover la degradación de RNA y como tal, alteran la calidad de la muestra y la producción de RNA después de aislamiento.
- Preparar e identificar tres libres de RNasa 1,5 mL cónico roscado tubos por ratón, uno para cada tipo de tejido adiposo blanco y colocar sobre una rejilla.
Nota: Animales obesos pueden requerir tubos adicionales como han aumentado las masas grasas. Esto es particularmente verdadero para SCF que hasta 7 tubos para un ratón se obtuvo. - Limpie el Banco con etanol al 70% y poner un papel de banco limpio y nuevo en la superficie.
- O tejido adiposo recién se recolectaron de ratones previamente almacenados en un congelador de-80 ° C, se reúnen todas las muestras en un envase lleno de nitrógeno líquido hasta el inicio del procedimiento.
- Congelar el mortero, mortero y espátula colocándolos en el contenedor de nitrógeno líquido. Cuando el nitrógeno líquido se detiene para hervir el '''', pulido del tejido adiposo se puede iniciar.
Nota: De este paso, el mortero, espátula, tubo cónico y tejido adiposo necesitan permanecer refrigerada durante todo el proceso. Cualquier calor derretirá el tejido adiposo y hacer más difícil extraer el RNA. También, si se utiliza un mortero de cerámica y una maja, uno puede utilizar hielo seco o nitrógeno líquido para mantenerlo frío. - Coloque todos libre de RNasa 1,5 mL cónico roscado los tubos preparados en el paso 2.2 de hielo seco para refrescarse abajo.
- Para evitar congelaciones en las manos, usar unas capas de papel de estraza para levantar el mortero de nitrógeno líquido y ponerlo en un banco de trabajo.
- Utilice las pinzas para recoger una muestra de tejido adiposo de nitrógeno líquido y ponerlo en el mortero. Desenvuelva el papel de aluminio y colocar la muestra en el centro del mortero rápidamente.
Nota: Si la muestra de tejido adiposo es demasiado grande, como es el caso de ratones obesos, romper las muestras en partes más pequeñas en el papel de aluminio utilizando los pulgares y pulverizar cada parte por separado. - Utilizar unas pocas capas de papel de estraza para levantar la mano del mortero de nitrógeno líquido y coloque en el mortero. Mientras sostiene la mano del mortero con papel marrón, usar el martillo para golpear la parte superior de la mano del mortero una vez o dos veces. Presione la mano contra el mortero con rotación de movimientos para moler la muestra hasta obtener un polvo fino.
Nota: Este paso es fundamental para obtener el adecuado aislamiento de RNA. De hecho, la presencia de fragmentos más grandes se impedir el aislamiento de RNA y reducir el rendimiento. - Una vez se obtiene un polvo fino, quitar la mano del mortero y recoger la espátula desde el nitrógeno líquido y usarlo para transferir la muestra en el tubo cónico correspondiente de 1.5ml previamente enfriada.
Nota: La espátula de la inmersión en nitrógeno líquido de vez en cuando para evitar que la muestra de la fusión. También, mantenga el tubo cónico en hielo seco siempre para evitar que la muestra de descongelación. Un tubo cónico que se llena con la muestra de suelo a capacidad de 2/3 (~ 1 mL) es necesario para la adecuada producción de RNA y la cantidad. - Una vez llena hasta 1 mL, cierre el tubo y colóquelo en el otro recipiente lleno de nitrógeno líquido.
Nota: Muestras de exceso pueden poner en pre enfriado libre de RNasa 1,5 mL cónicos tubos separados y almacenadas en un congelador de-80 ° C para su uso posterior. - Limpiar la espátula con papel marrón para evitar el arrastre en la siguiente muestra de tejido adiposo, mortero y Maja. Coloque mortero y espátula en nitrógeno líquido para enfriar. Aunque el papel es no libre de Rnasa, utilizamos un paquete recién abierto de papel marrón para cada día de aislamiento de RNA.
- Repita los pasos 2.4 a 2.11 con la siguiente muestra.
- Una vez que se procesan todas las muestras, iniciar el aislamiento de RNA o almacenar las muestras en un congelador de-80 ° C para su uso posterior.
Nota: Para evitar que los tubos estallen, congelar una caja de muestra sumergiendo totalmente en el contenedor de nitrógeno líquido. Cuando se haya enfriado suficiente eliminar el exceso de nitrógeno de la caja y dejó flotar encima del nitrógeno líquido. Clasificar las muestras en la caja y ponerlo en un congelador de-80 ° C.
3. ARN aislamiento del tejido adiposo de tierra
PRECAUCIÓN: Solución de fenol es perjudicial para la piel. Usar una bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad y ejecutar el procedimiento bajo una campana química. Un diagrama de flujo paso a paso se muestra en la figura 2.
- Preparar e identificar dos conjuntos de tubos cónicos de 1,5 mL libre de RNasa y ponerlos en un estante.
- O tejidos adiposos fueron recién molidos previamente almacenados en un congelador de-80 ° C, se reúnen todas las muestras en un recipiente lleno de nitrógeno líquido hasta el inicio del procedimiento que se realiza sobre todo a temperatura ambiente.
- Utilice pinzas para seleccionar una muestra de tejido adiposo de la planta de nitrógeno líquido y ponerlo en un bastidor de tubo. Los tubos deben contener ~ 1 mL de polvo, que corresponde a alrededor de 100 mg de polvo de tejido.
- Abra lentamente el tubo.
Nota: Dejando un tubo cerrado a temperatura ambiente o abrir la tapa del tubo demasiado rápido puede llevar a lesiones o pérdida de la muestra como la presión de nitrógeno tiende a escapar por el tubo. - Añadir 500 μl de solución de fenol a la muestra (proporción 1:2 de solución de fenol: polvo de tejido).
- Cierre la tapa del tubo y de vortex a máxima velocidad durante unos 5 s. lentamente y abra con cuidado el tubo para liberar la presión de nitrógeno (se oye un sonido del aire que sale del tubo).
- Repita los pasos del 3.5 y 3.6. El volumen de solución de fenol final añadido a la muestra es de 1 mL.
- Repita el paso 3.6 hasta que la muestra esté completamente disuelta.
Nota: Es importante liberar toda la presión del tubo antes de continuar para evitar que el tubo reviente. - Déjela la muestra a temperatura ambiente mientras que repite pasos 3.4 a 3.8 para las próximas muestras.
- Una vez que todas las muestras son procesadas, brevemente vortex a máxima velocidad e incubar 5 min a temperatura ambiente de todas las muestras.
- Centrifugar 10 min a de 12 000 x g a 4 ° C. Llevar los tubos a temperatura ambiente.
Nota: Después de la centrifugación, las 3 fases están presentes como se muestra en la figura 2: grasa (parte superior), ARN (medio) y pellets (abajo). - Para cada muestra, transferir tanto RNA (capa media de color de rosa) como sea posible en la primera serie de tubos correspondientes con una pipeta de P1000 usando una punta de filtrado. Cambio de puntas entre las muestras.
- Para asegurar la mínima contaminación del ARN (capa media), lípidos (capa superior), perforar la fase superior con la punta cerca del lado del tubo. Dispensar el ARN en los tubos cónicos nuevos sin tocar los lados del tubo nuevo para evitar la transferencia de lípidos que pueden ser en el exterior de la punta.
- Añadir 200 μL de cloroformo puro a cada muestra y mezclar por inversión durante 15 s. Incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar 15 min a de 12 000 x g a 4 ° C y llevar los tubos a temperatura ambiente.
Nota: Después de la centrifugación, las 3 fases están presentes: RNA (superior), interfase que contiene ADN (medio) y rojo fenol-cloroformo que contiene proteínas (parte inferior). - Para cada muestra, transferir mucho transparente que contiene RNA fase acuosa (fase superior) como sea posible a la segunda serie de tubos cónicos correspondientes con una pipeta de P1000 usando consejos de filtrado. Cambiar consejos entre cada muestra.
Nota: La interfase es frágil y puede contaminar la fase superior si la aspiración se realiza demasiado rápidamente. Como alternativa, utilice una pipeta P200 para reducir las posibilidades de alterar la interfase. - Añadir 500 μl de isopropanol 100% a cada muestra y mezclar por inversión durante 15 seg.
- Incubar 10 min a temperatura ambiente
- Centrifugar 10 min a de 12 000 x g a 4 ° C y llevar los tubos a temperatura ambiente. Deseche el isopropanol invirtiendo cada tubo.
Nota: Una pequeña pelotilla blanca de RNA generalmente pueden verse pero en ocasiones puede que no. - Añadir 1 mL de etanol al 75% (preparado a partir de 100% de etanol y agua libre de ARNasa) a cada muestra y brevemente vortex cada tubo a máxima velocidad.
- Centrifugar 5 min a 7 500 x g a 4 ° C y llevar los tubos a temperatura ambiente.
- Descartar el etanol del 75% por inversión cada tubo y golpee ligeramente contra un papel de estraza para quitar cualquier resto.
Nota: Si es necesario, utilice una punta filtrado para eliminar alcohol cerca el pellet de RNA. Cambio de punta entre las muestras. - Deje la tapa abierta y el aire seco el pellet de RNA para unos 15-20 minutos.
Nota: Pellets de RNA podrían ser translúcidos durante este paso. - Como RNA solubilización pellets depende del tamaño, evaluar el tamaño de la pelotilla para determinar el volumen de agua libre de ARNasa a utilizarse para solubilizar el ARN. Anote el volumen (10 a 25 μl) de cada muestra.
Nota: Este paso es simplemente cualitativa. Si no puede verse el pellet de RNA, añadir 10 μl de agua libre de RNA a la muestra. - Añadir 10-25 μl de agua libre de ARNasa a cada muestra (volumen determinado en el paso 3.24).
- Incubar la muestra 5 minutos en un bloque de calor a 60 ° C. Brevemente vórtex los tubos.
- Incubar la muestra durante un adicional 5 min en el mismo bloque de calor a 60 ° C.
- Rápido-hacer girar todas las muestras en una mini gira centrífuga y ponen inmediatamente en hielo.
- Determinar la concentración de RNA y la pureza. Realizar la transcripción reversa (RT) para obtener cDNA o almacenar las muestras en un congelador de-80 ° C para su uso posterior.
Nota: Evitar congelaciones y descongelaciones múltiples como esto degrada las muestras de RNA.
4. determinación de la concentración de ARN del tejido adiposo y pureza
- Si las muestras de tejido adiposo RNA recién extraídas y solubilizadas o previamente almacenadas en un congelador de-80 ° C, se reúnen todas las muestras y déjelos descongelar el hielo hasta el inicio del procedimiento. Esto debe hacerse justo antes del inicio del próximo paso o al final del aislamiento para evitar congelaciones y descongelaciones múltiples.
- Preparar e identificar dos conjuntos de tubos cónicos de 1,5 mL libre de RNasa y poner en una gradilla para tubos.
- Cuando las muestras de RNA son completamente descongelado, vortex una muestra de 1 s y puesto en el hielo.
- Diluir la solución de TE RNA 100-fold en x 1 en el primer conjunto de libre de RNasa 1,5 mL tubos cónicos con filtrado consejos libres de Rnasa (puestos 99 μl de solución de TE 1 x y 1 μl de ARN al tubo).
- Repetir para cada muestra.
Nota: Los volúmenes pueden ser diferentes para cada espectrofotómetro dependiendo la cubeta utilizada. - Una vez que se procesan todas las muestras, vortex cada muestra diluida.
- Seguir el protocolo del espectrofotómetro para calibrar el instrumento usando un espacio en blanco (1 x TE) antes de procesar las muestras diluidas de RNA.
- Las muestras diluidas de RNA de transferencia a la cubeta de cuarzo y determinar la concentración de cada muestra a 260 nm.
Nota: Si el espectrofotómetro proporciona la concentración de RNA final, utilice esta fórmula para calcular: RNA (μg/μl) = OD260 x factor de dilución x (40 μg RNA/1 000 μl). - Para determinar la pureza del RNA de cada muestra, calcular la relación OD260/do280.
Nota: Generalmente se considera como pura para RNA12una relación OD260/do280 alrededor de 2.0. Se recomienda que se verifique la calidad del RNA. Para ello, poner 1 μg de RNA en agarosa 1% blanqueador gel con 1 buffer x TBE (89 mM Tris base, el ácido bórico 89 mM y 2 mM EDTA, pH 8.0) y 1% lejía solución13 (figura 3). RNA de muy buena calidad muestra bandas de 28S y 18S rRNA y la banda de 28S debe ser más intensa que el de 18 años. Calidad de RNA es aceptable cuando ambas bandas rRNA son visibles con una intensidad similar. Calidad de RNA se convierte en deficiente el momento que la banda de 18 años es más intensa que la banda de 28S, y cuando un frotis es visible, indicativo de la degradación del RNA. - Para cada muestra, preparar 10 μl de 0,5 μg/μl de ARN de la acción en el segundo conjunto de libre de RNasa 1,5 mL tubos cónicos con agua libre de ARNasa para diluir las muestras cuando sea necesario. Estas muestras se utilizan para RT para obtener cDNA.
- Una vez que se procesan todas las muestras, iniciar RT o almacenar las muestras en un congelador de-80 ° C para su uso posterior.
5. reverso-transcripción (RT)
- Si las muestras de tejido adiposo RNA recién diluidas a 0.5 μg/μl o previamente almacenadas en un congelador de-80 ° C, recoger todas las muestras y los reactivos y déjelos descongelar el hielo hasta el inicio del procedimiento.
- Ponga el estante de tira de tubo PCR en hielo. Una vez frío suficiente preparar e identificar un conjunto de tubo PCR libre de Rnasa tiras y ponerlas en la parrilla. Incluir un espacio en blanco.
- Preparar la reacción para el tratamiento de DNasa del ARN: hacer una mezcla maestra (para la cantidad requerida de muestra + 1 muestra) de los siguientes (cantidades para 1 muestra): 1 μl de 10 X buffer de reacción con MgCl2, 0,5 μl de DNasa I (1 U/μL) y 7.5 μl de ARNasa-libre del agua utilizando Consejos de filtrado. Añada 9 μL en cada tubo.
- Añadir 1 μl de 0,5 μg/μl de ARN de cada muestra al tubo correspondiente, poner las tapas en cada tira y todas las tiras en una mini vuelta de centrífuga para llevar la muestra a la parte inferior del tubo de giro rápido. Añadir 1 μl de agua libre de RNA para el espacio en blanco.
- Incubar todas las tiras de tubos en un termociclador o un bloque de calentamiento a 37 ° C durante 30 minutos, vuelva a colocar la tira de tubo en la parrilla, sobre hielo.
- Añadir 1 μl de EDTA (50 mM) a cada tubo e incube todas las tiras de tubos en un termociclador o un bloque de calentamiento a 65 ° C durante 10 minutos, vuelva a colocar la tira de tubo en la parrilla, sobre hielo.
- Hacer una mezcla maestra (para el número requerido de muestras más 1 muestra) de los siguientes (cantidades para 1 muestra): 1 μl de random hexamers (0,2 μg/μl) y 1 μl de dNTP mix (contiene cada uno de los cuatro Deoxynucleótidos por en una concentración de 10 mM). Distribuir 2 μl de la mezcla principal en cada tubo, utilizando puntas de filtrado. Cambio de punta entre las muestras.
- Incubar todas las tiras de tubos en un termociclador o un bloque de calentamiento a 65 ° C por 5 minutos, vuelva a colocar la tira del tubo en el bastidor en el hielo.
- Hacer una mezcla maestra (para el número requerido de muestras más 1 muestra) de los siguientes (cantidades para 1 muestra): 4 μL de 5 x RT tampón, 1 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL), 0.25 μl de transcriptasa reversa (200 U/μL) y 1.75 μl de agua libre de nucleasa. Dispensar 7 μL en cada tubo utilizando puntas filtradas. Cambio de punta entre las muestras.
- Realizar RT en un termociclador estableciendo el siguiente programa: 10 min a 25 ° C, 30 min a 50 ° C, 5 minutos a 85 ° C. Colocar las tiras de tubo en el bastidor en el hielo.
- Preparar, identificar un conjunto de tiras de tubo PCR libre de RNasa y ponerlos sobre la parrilla.
- Para cada muestra, preparar el volumen deseado del cDNA diluidos 1:5 de los valores en las nuevas tiras de tubo con agua ultrapura. Las muestras de cDNA diluidos 1:5 se utilizará para PCR en tiempo real.
- Una vez que se procesan todas las muestras, empezar a PCR en tiempo real o almacenar muestras (stock y muestras) en un congelador de-20 ° C para su uso posterior.
6. en tiempo real PCR para expresión génica en tejido adiposo
Nota: Evite exponer el colorante fluorescente a la luz. El protocolo a continuación describe la amplificación del gen de referencia s1614. Los cebadores y las condiciones PCR deben ser modificadas según el gen de interés.
- Si las muestras de cDNA recién diluyeron 1:5 o previamente almacenados en un congelador de-20 ° C, se reúnen todas las muestras y los reactivos y déjelos descongelar el hielo hasta el inicio del procedimiento.
- Ponga la rejilla para tiras de tubo PCR en tiempo real en el hielo. Una vez frío lo suficientemente preparar e identificar un sistema de tiempo real PCR tubo tiras y coloque en la rejilla. Preparar cada muestra y el blanco por duplicado.
- Hacer una mezcla maestra (para el número requerido de muestras más 1 muestra) de los siguientes (cantidades para 1 muestra): 1,9 μl de agua ultrapura, 5 μl de colorante fluorescente (p. ej. verde de SYBR) y 0,3 μl de un primer avance y 0,3 μl de cebador reverso. Añada 7,5 μL en cada tubo.
- Añadir 2,5 μl de cDNA diluidos 1:5 de cada muestra en el tubo correspondiente. Añadir 2,5 μl de agua ultrapura para los espacios en blanco. Ponga las tapas en cada tira.
- Siga las instrucciones del fabricante para instalar el siguiente programa de PCR en tiempo real: 10 min a 95 ° C y 40 ciclos de 15 s a 50 ° C, 30 s a 60 ° C, 30 s a 70 ° C. Poner las tiras de la muestra en el rotor de la máquina PCR en tiempo real e inicia el programa.
Nota: Condiciones del termociclador pueden variar dependiendo del aparato utilizado y el gen de interés. resultados de expresión de mRNA en amplificación de mRNA de leptina figura 3 ver normalizada por el gen de referencia S16 mRNA amplificación14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siguiendo el procedimiento de necropsia, tres tejidos adiposo blanco fueron recogidos y ponderados de los dos grupos de ratones (N y HF alimentados con dieta). Como era de esperar, ratones en la dieta HF habían aumentado peso final y ganancia de peso en comparación con hermanos de camada en dieta de N (tabla 1). Estas observaciones fueron acompañadas por más de un aumento de 2 dobleces en el peso de la PGF, el PRF y el SCS en ratones obesos en comparación con aquellos en dieta de N.
Antes de realizar cualquier experimentos con el RNA aislado, su pureza fue evaluada como se describe en el paso 4.9. Para cada tejido adiposo blanco, aislamiento de RNA por la solución de fenol produjo muestras con calidad adecuada como el ratio OD260/OD280 era alrededor de 2.0 que se considera como puro para RNA (tabla 2). Datos en tiempo real de la polimerización en cadena demostraron que la expresión de mRNA de leptina fue significativamente aumentada de PGF, PRF y SCF de ratones obesos en comparación con aquellos en dieta de N (figura 4A). De hecho, las diferencias observadas en la expresión de mRNA de leptina no fueron debido a una variación de s16, utilizado para normalizar los resultados, entre los dos grupos de ratones que no fueron alterados los valores de Ct del gen de referencia (figura 4B). Así, s16 puede ser confiablemente utilizado como un gen de referencia para la expresión del mRNA de PGF, PRF y SCF cuando dieta HF es un parámetro en un protocolo de estudio.
Figura 1 . Localización anatómica del tejido adiposo blanco en los ratones. Un ratón macho en dieta N ha sido diseccionado para mostrar la localización de cada depósito de tejido adiposo y glándulas suprarrenales. SCF (A), PGF (B), PRF (C) y (D)de la glándula suprarrenal. PGF, grasa peri-gonadal; PRF, grasa peri renal; SCF, grasa subcutánea abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Aislamiento de RNA protocolo diagrama de flujo usando fenol solución. Representación esquemática de los pasos necesarios para aislar RNA del tejido adiposo blanco conexión a tierra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Evaluación de la calidad del RNA en el gel blanqueador. 1 ug de RNA aislado de grasa subcutánea (SCF) y grasa peri-gonadal (PGF) se separa en gel blanqueador 1% agarosa por electroforesis. 28S y 18s rRNA son visualizados por transiluminación UV. En gel de RNA aislado de SCF y PGF de un ratón es alimentado con una dieta normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Efecto de la dieta HF sobre la expresión de mRNA de leptina y s16 en tejido adiposo blanco. Leptina (A) y s16 (B) la expresión del mRNA. Datos de leptina se normalizan a los niveles de mRNA de s16 mientras se muestran datos de s16 como valor de Ct y ambos se presentan como media ± SE con n = 12-13 por grupo. * en comparación con dieta de N p < 0.05. N, normal; HF, alto contenido de grasa; PGF, grasa peri-gonadal; PRF, grasa peri renal; SCF, grasa subcutánea abdominal. Esta figura ha sido modificada desde Tan, p. et al., obesidad (2014) 22, 2201-2209. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Dieta N | Dieta HF | |
| Peso final (g) | 37.5 ± 1.3 | 46,7 ± 1.7* |
| Aumento de peso (g) | ± 6,6 0,7 | 16.7 ± 1.0 |
| PGF (g) | 1.08 ± 0,17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0.15 | ± 1.71 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0.35 | 3.55 ± 0.20* |
Tabla 1. Efecto de la dieta HF peso tejido adiposo blanco y el cuerpo. Los valores se expresan como medios ± SE n = 14-15 por grupo. * en comparación con dieta de N p < 0.05. N, normal; HF, alto contenido de grasa; PGF, grasa peri-gonadal; PRF, grasa peri renal; SCF, grasa subcutánea abdominal. Esta figura ha sido modificada desde Tan, p. et al., obesidad (2014) 22, 2201-2209.
| Muestras | Ratio OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
Tabla 2. Pureza del RNA después de aislamiento del tejido adiposo blanco. n = 3 por tejido adiposo. PGF, grasa peri-gonadal; PRF, grasa peri renal; SCF, grasa subcutánea abdominal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siguiente HF-dieta alimentación, encontraron a ratones obesos tengan más cuerpo y peso del tejido adiposo blanco en comparación con ratones alimentados con una dieta de N. RNA extraído con fenol solución rindió muestras de buena pureza. La leptina es un adipoquinas producidas principalmente por el tejido adiposo y se sabe que correlacionan positivamente con la masa grasa16. Como se esperaba, la expresión de mRNA de leptina aumentó en ratones obesos en concomitancia con su masa grasa.
Este método tiene varios pasos críticos. El principal es contaminación del depósito de tejido adiposo blanco uno con el otro como se sabe que los depósitos de tejido adiposo diferentes tienen diferentes funciones2,5. La contaminación puede llevar a resultados engañosos en aplicaciones posteriores. Además, como la grasa tiende a secar una vez en contacto con el aire, recogiendo el tejido adiposo blanco a un ritmo regular y constante entre ratones se recomienda si el peso debe ser tomado. De lo contrario, el peso total de una almohadilla grasa puede ser incorrecta. Para obtener RNA de buena calidad y rendimiento, tras el recientemente publicado MIQE directrices es un activo definitivo17. En particular, haciendo polvo muy fino de la muestra durante el pulido puede ayudar a maximizar el rendimiento. Esto maximiza el contacto entre la solución de fenol y polvo de tejido durante el aislamiento de RNA. Último pero no menos importante es el aislamiento de la capa que contiene el RNA durante el aislamiento de RNA (paso 3.12). Como la grasa es menos densa que el agua, se coloca encima de la fase de interés. Minimizar el arrastre de la grasa es necesaria para reducir la interferencia con las aplicaciones de bajada.
Una limitación de este método es la habilidad necesaria para llevar a cabo varios pasos en el procedimiento, así como la necesidad de trabajar con reactivos nocivos durante el aislamiento de RNA. Además, todo el proceso es laborioso.
No hay muchas alternativas al método de colección de tejido adiposo y la muestra antes de aislamiento de RNA aparte de pequeños detalles que generalmente se ajustan por cada usuario. En el caso de aislamiento de RNA, muchas opciones están disponibles como la extracción con fenol/cloroformo o kits de aislamiento de RNA. Hay ventajas y desventajas de cada opción y corresponde al usuario que seleccione el mejor método basado en aplicaciones posteriores. Extracción de fenol/cloroformo es menos costosa pero requiere el uso de reactivos nocivos y es laboriosa. Kits de aislamiento de RNA son generalmente más costosos, pero el procedimiento es más rápido y por lo general da muestras de buena calidad y pureza. Es importante considerar el rendimiento y la pureza del RNA porque el material es limitado en tejido adiposo blanco que se compone principalmente de grasa. El mayor beneficio en el uso de solución de fenol para el aislamiento (extracción de fenol/cloroformo) es la posibilidad de aislar RNA, DNA y proteína de una sola muestra de18. Esto es rentable y tiempo ya que reduce el número de ratones que obtener suficiente material. Como se mencionó anteriormente, la masa de grasa es limitada en algunos modelos de ratón. De estos ratones, División de tejido adiposo de tierra en tres partes por separado obtener RNA, DNA y proteínas no se recomienda ya que podrían producirse suficiente material para aplicaciones posteriores. Para evitar este problema, también es posible combinar juntos similares depósito de tejido adiposo de varios ratones en base a criterios definidos por el usuario, que conduce a un mayor número de animales necesitada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Canadá de Diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
