Summary
Bu kağıt amacı farklı beyaz yağ dokuları fareler toplamak, yağ örnekleri işlemek ve RNA ayıklamak için bir adım adım yordam sunmaktır.
Abstract
Çoğunlukla lipidler içerdiğinden diğer dokulara karşılaştırıldığında, beyaz yağ dokusu gibi gerçek zamanlı PCR ve Western Blot, karşıdan akış uygulamaları için bir önemli ölçüde daha az RNA ve protein içeriği vardır. Ek adımlar bu lipitlerin önlemek için gerektiğinde RNA izolasyon yağ dokusu örneklerinden de meydan okuyor. Burada, bu örnekler işlemek ve RNA izolasyon gerçekleştirmek için fare üç anatomik olarak farklı beyaz yağ dokuları toplamak için bir yordam mevcut. Biz daha fazla gerçek zamanlı PCR kullanarak cDNA ve gen ifade deneyleri sentezi tarif. Burada açıklanan protokol hayvanın saç ve kan yağ yastıkları yanı sıra doku toplama sırasında farklı yağ yastıkları arasında çapraz bulaşma kirlenme azalma sağlar. Bu da yeterli miktar ve çıkarılan RNA kalitesini sağlamak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı nerede yağ doku örnekleri gerçek zamanlı PCR gibi rutin deneyler için gerekli olan herhangi bir fare modeli için yaygın olarak uygulanabilir ama birincil adiposit hücre kültürü izolasyonu için uygun değildir.
Introduction
Obezite tip 2 diyabet1gibi komplikasyonlara yol açabilir bir dünya çapında salgın var. Obezite ve onun ilişkili komplikasyonlar diyet kaynaklı obez ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri araştırma için sık kullanılır. Geleneksel olarak, beyaz yağ dokuları aşırı enerji için bir saklama bölmesi olarak bilinir ve kahverengi yağ dokusu enerji ısı2,3içine dönüştürünceye çoğunlukla lipidler oluşur. Yağ dokusu dinamiktir ve genişletilir ve gıda alımı ve fiziksel aktivite gibi birçok faktöre bağlı olarak küçültme. Bu nedenle, bu değişiklikler için katkıda bulunan etkenleri belirlemek için yeterli yağ dokusu toplama ve işleme gerekli4vardır.
Beyaz yağ dokular arasında subkutan ve viseral yağ depoları anatomik Lokalizasyon gibi farklı özelliklere sahip ve2,5işlev genel olarak kabul. Bu nedenle, çelişkili sonuçlar veya büyük değişkenlik önlemek için dikkat yağ yastıkları toplarken farklı bu yağ depoları arasında çapraz bulaşma önlemek için alınması gerekir.
Dahası, RNA veya protein fareler beyaz Yağ dokusundan izole zaman üç önemli sorunlar vardır. Farklı beyaz yağ depoları birbirinden ayıran sınır her zaman açık, diğer organlar böbrekler ve kalp6gibi aksine değildir gibi ilk olarak, obez farelerde yağ yastıkları toplama kolay bir iş değil. İkinci olarak, protein veya RNA izolasyon sırasında yağ dokusu yüksek lipid içeriği nedeniyle lipidler tabakası üst yüzen ve örnek için doğrudan erişimi engeller. Üçüncü olarak, kahverengi yağ dokusu veya diğer dokularda aksine, beyaz yağ dokusu önemli ölçüde daha düşük RNA ve protein içeriğe sahip ve bu genç fare kullanırken büyük endişe kaynağıdır, fareler bir normal (N) diyet beslenen ve için beklenen fareler var düşük yağ kütlesi (Yani KO modelleri, ilaçlar, tedavi egzersiz eğitim, vb.) 7 , 8.
Bu nedenle, RNA Yağ dokusundan izole etmek için uygun olan yöntemi seçimi önemlidir. Fenol/kloroform ayıklama için alternatif yöntemler ticari kitleri vardır. Onlar genellikle RNA arıtma tarafından takip sütun9tarihinde bir ilk fenol ayıklama adım temel alır. Ancak, bu kitleri normalde daha pahalı olduğunu ve RNA kalitesi değişken olabilir ise daha düşük verim, örnekleri vermek ama daha az zaman alıcı. Ancak, burada açıklanan fenol çözüm/kloroform çıkarma için en büyük avantajlarından biri RNA, DNA ve protein bir tek örnek10izole imkanı vardır. Çünkü fareler yağ yastıkları genellikle küçük ve RNA ve proteinler küçük miktar (özellikle yalın fare modellerinde) vermek, bu protokoller bir küçük bir örnek dışarı alabilirsiniz veri en üst düzeye çıkarmak.
Bu kağıt amacı üç fare beyaz yağ dokusu depoları hem de miktar ve RNA izolasyon kalitesi yeterli örnek koleksiyonundan emin olmak için bir yöntem ayrıntılı olarak tarif etmektir. Bu iletişim kuralı takip ederek elde RNA gerçek zamanlı PCR deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil adiposit RNA izolasyonu için tasarlanmamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yordamlarda kullanılan farelerin bakım bakım ve deneysel hayvan hayvanlar koruma için Kanada Konseyi tarafından küme kullanımı için standartlara uyulması. Tüm yordamları Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi Oda arkadaşı Araştırma Merkezi tarafından kabul edildi.
1. nekropsi ve erkek fareler koleksiyonundan yağ dokusu
- Deneysel grupları çalışma hedefleri göre yapmak. Bu çalışmada, örnek bir C57Bl/6 arka plan üzerinde erkek farelerin iki grupları toplanmıştır (n = 12-14/grup). Burada kullanılan fare 12-15 hafta-in yaş ve 12-h ışık/karanlık döngüsüne erişimi olan normal (N) veya yüksek yağlı (HF) diyet üzerinde tutulur ve 10 hafta11bir süre için ad libitum su emin olun.
- Bir fare fare nerede sırasında 10 dk % 6 CO2 ' ye maruz kalmaktadır mühürlü odası yerleştirerek ötenazi.
- Kardiyak delik yavaş yavaş hayvanın göğüs kemiğinin sol 26 G 1/2po iğneyle monte 1 mL şırınga ekleme ve yavaş yavaş çoğu hayvanın kan kaldırmak için piston çekerek gerçekleştirin. Şırınga hayvanın vücuduna paralel olduğundan emin olun. Şırıngayı yavaşça şırınga kan gelmezse piston kablolarıylaberaber döndürün.
Not: (0,8-1 mL kan hacmi arası) başarılı kalp ponksiyon yağ dokusu kan ile kirlenme azaltır. - Fareler sırtında yattı ve 22 G iğneler şekil 1' de gösterildiği gibi kullanarak panelindeki her pençe pin.
- Bir gazlı bez ile birkaç kez bu saç düz kalır ve yağ doku örnekleri saç kirlenme azaltır sağlar gibi tek yönlü bir hareket takip ederek boyun cinsel organlar kadar başlayarak fare alkol ile deri ovmak Epilasyon.
- Temiz ama değil steril forseps ve Cerrahi makas kullanarak, cinsel organlar yakınındaki Merkezi Cilt yüceltmek ve küçük 0,3 mm ufakbir ameliyat yaparım.
- Makas yatay olarak açılan deliğe sokmak ve karın duvarı karın derisini ayırın.
Not: Bu deri ve karın duvarı arasındaki boşluğa künt diseksiyon ve bu alanda bulundu membranlar kesme değil tarafından yapılır. - Forseps kullanarak, açılan delik yakınındaki Merkezi Cilt yüceltmek ve üzerine deriyi kesme linea alba göğüs kafesi (~ 4 cm fare boyutuna bağlı olarak) yakın olana.
Not: Bu hava visseral yağ dokusu açığa ve doku ve içerik bütünlüğünü değiştirebilir yağ yastıkları kurutma için neden olarak karın kas kesme önlemek. - Göğüs kafesi ortasından ~ 2 cm sağ koluna karşı deriyi kesme. Cinsel organlar deri sağ arka bacak üzerinde ~ 2 cm yukarıda kesilmiş.
- Bir köşesinde açılan deri streç ve pin 22 G iğne yastığı. Diğer köşe ile yineleyin.
Not: Cilt üzerinde maruz yağ dokusu karın subcutaneous yağlı (SCF) (Resim 1A) olduğunu. - SCF künt diseksiyon ve cilt karşı olabildiğince düz konumlandırılmış Cerrahi makas kullanarak deri kesme toplamak. Bir kez toplanan, SCF önceden tanımlanmış alüminyum folyoyu koymak.
Not: Toplama veya deri ya da saç ile adipoz doku alter kirletici örnek kalite ve RNA verim nedeniyle RNases. Çok fazla zaman yağ dokusu toplama ayırsan örnek ayrıca hangi Ayrıca örnek kalitesini değiştirebilirsiniz kuru. - Adımları 1.9-1,11 hayvanın sol tarafında yineleyin. Sol ve sağ yağ yastıkları alüminyum folyo havuz ve örnek sıvı azot içinde dondurma.
- Visseral yağ dokuları erişim elde etmek için temiz ama değil steril Cerrahi makas ve forseps boyunca kullanarak karın kas kesmek linea alba, genital için göğüs kafesi üzerinden fare boyutuna bağlı olarak ~ 4 cm üzerinde. O zaman bir kesi karın kasları karın organları tarafına erişebilmek için ~2.5 cm fareyi arkasına doğru genital üzerinden yapmak.
- Üreme organları çevresinde yağ peri Gonad yağ (PGF) (Resim 1B) olduğunu. PGF epididim, testis ve duktus deferensbağlı olarak, dikkatle Bu yapılardan sol yağ yastığı bağlantısını kesin ve önceden tanımlanmış alüminyum folyoyu koymak. Sağ taraf için tekrarlayın. Bir kez her iki PGFs toplanır, örnek sıvı azot dondur.
- Sol tarafı ile başlayarak, böbrekler bağırsak karın boşluğu uzak sağ tarafına hareket ettirerek ortaya çıkarmak. Böbrek çevreleyen yağ dokusu peri-böbrek yağ (PRF) (Resim 1C) olduğunu. PRF Ayrıca böbreküstü bezleri (Resim 1D) çevreleyen.
- İzole ve böbreküstü bezleri PRF toplama önce kaldırın. Sadece biraz yağ dokusu pembe oldukları gibi bu sıkıcı olabilir.
Not: Kan yağ dokusu kontamine ve böbreküstü bezleri içinde bu yağ yastığı tanımlamak daha zor hale böbrekler bu adımı sırasında tamamen kaldırılmaması gerekir. - Üreter, renal arter ve ven PRF ve böbrek vücudun geri kalanından ayıran keserek biten PRF geri kaslı duvar izole et. Böbrek kesme ve renal kapsül kaldırarak gelen PRF yalıtmak. PRF kapsül için ekli kalır.
- Adım 1,15 ve 1.17 sağ taraf için tekrarlayın. Her iki PRF alüminyum folyo içinde koymak ve örnek sıvı azot içinde dondurma.
- Adımlardan 1.2-1,18 tahsil edilecek tüm fareler için yordamı yineleyin.
- Bu noktada, yağ dokuları taşlama ile devam etmek ya da örnekleri-80 ° C dondurucu daha sonra çıkarılması için saklayın. Örnekler stabil birkaç yıl4için-80 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. zemin hazırlanması için RNA izolasyonu beyaz yağ dokusu
Not: Deri RNA bozulma teşvik ve bu nedenle, yalıtım sonra örnek kalite ve RNA verim değiştirir RNases içerdiği her adımı için eldiven.
- Hazırlamak ve üç RNase free 1,5 mL konik vidalı kapak tüpler fare, beyaz yağ dokusu, her tür için bir ücret tanımlamak ve bir rafa koyun.
Not: Onlar yağ kütlesi artmış gibi obez hayvan ek tüpler gerektirebilir. Bu özellikle kendisi için true SCF için 7 tüpler için bir fare kadar elde edildi. - Kürsüye % 70 etanol ile temiz ve temiz ve yeni tezgah kağıt yüzeyi koymak.
- Yağ dokuları fareler taze toplanan veya önceden bir-80 ° C dondurucu içinde depolanan olup olmadığını bir sıvı nitrojen dolu kap içinde tüm örneklerini yordamı başlangıcına kadar toplamak.
- Harç, havaneli ve spatula sıvı nitrojen kapsayıcısında yerleştirerek dondur. '' Kaynamaya '' sıvı nitrojeni sona erdiğinde, yağ dokusunun taşlama başlatılabilir.
Not: Bu adım, harç, spatula konik tüp ve yağ dokusu tüm süreci sırasında soğutulmuş kalmak gerekir. Herhangi bir ısı yağ dokusu eritin ve yapmak RNA ayıklamak. Ayrıca, bir seramik harç ve havaneli ile kullanıyorsanız, bir kuru buz ve/veya sıvı azot soğuk tutmak için kullanabilir. - Onları soğumasını adım 2.2 kuru buz üzerinde hazırlanmış tüm RNase free 1,5 mL konik vidalı kapak tüpler yerleştirin.
- Ellerinde frostbites önlemek için sıvı nitrojen harçtan kaldırıp bir çalışma bankta koyabilir için kahverengi kağıt birkaç katmanları kullanın.
- Forseps sıvı azot adipose doku örneği toplamak ve harç içinde koymak için kullanın. Hızlı bir şekilde alüminyum folyo paketini açmak ve örnek harç merkezi üzerinde bırakın.
Not: Yağ dokusu örnek obez farelerin modelinde olduğu gibi çok büyük ise, daha küçük parçalar parmaklarını kullanarak alüminyum folyo içinde örnekleri break ve her bölümü ayrı ayrı ezmek. - Sıvı azot dan havaneli Asansör ve harç sığdırmak için kahverengi kağıt birkaç katmanları kullanın. Havaneli ile kahverengi kağıtları tutarken, havaneli tepesine bir veya iki kez vurmak için çekiç kullanın. Havaneli harç hareketleri kadar ince bir toz elde edilen örnek eziyet dönen karşı bastırın.
Not: Yeterli RNA izolasyon elde etmek için kritik bir adımdır. Gerçekten de, daha büyük parçaları varlığı RNA izolasyon engel ve verim azaltmak. - İnce bir toz alındıktan sonra havaneli kaldırmak ve sıvı azot dan spatula almak ve örnek karşılık gelen önceden soğutulmuş 1,5 mL konik tüp içine aktarmak için kullanabilirsiniz.
Not: Spatula zaman zaman erime gelen örnek önlemek için geri sıvı azot içine daldırma. Ayrıca, konik tüp kuru buz çözdürme üzerinden örnek her zaman önlemek için tutmak. Zemin örnek yaklaşık 2/3 kapasitesi (~ 1 mL) ile dolu bir konik tüp yeterli RNA verim ve miktar için gereklidir. - Bir kez yaklaşık 1 mL için dolu, tüp kapatın ve diğer sıvı nitrojen dolu konteyner içine bırakın.
Not: Aşırı örnekleri ayrı önceden soğutulmuş RNase free 1,5 mL konik tüplere sokun ve daha sonra kullanmak için bir-80 ° C dondurucu saklanır. - Harç, havaneli ve spatula ile sonraki yağ doku örneği etkilenmişimdir önlemek için kahverengi kağıt temiz. Havaneli ve spatula chill için sıvı azot koy. Kahverengi kağıt olsa bile değil RNase free, RNA izolasyon her gün için kahverengi kağıt taze açılan bir paket kullanın.
- Sonraki örnek ile 2.4-2,11 adımları yineleyin.
- Bir kez tüm örneklerini işlenir, RNA izolasyon başlatmak veya örnekleri-80 ° C dondurucu daha sonra kullanmak üzere saklayın.
Not: Tüpler patlama gelen önlemek için tamamen sıvı azot konteyner içine batış tarafından bir örnek kutusu dondur. Soğuyunca yeterince fazla azot kaldırmak belgili tanımlık kutu ve izin o üstünde tepe-in sıvı azot float. İçine belgili tanımlık kutu örnekleri sıralama ve-80 ° C dondurucuya koydu.
3. yere yağ dokusu RNA izolasyonu
Uyarı: Fenol çözüm cilde zararlıdır. Aşınma önlük, eldiven, koruyucu gözlük ve kimyasal bir başlık altında yordamını yürütün. Adım adım bir akış çizelgesi Şekil 2' de gösterilmiştir.
- Hazırlamak ve 1,5 mL konik tüpler RNase free iki kümesi tanımlamak ve bir rafa koydu.
- Yağ dokuları taze zemin veya-80 ° C dondurucuya önceden depolanan olsun, tüm örneklerini bir sıvı nitrojen dolu kap içinde oda sıcaklığında ekseriya bitmiş prosedürün başlangıcı kadar toplamak.
- Forseps sıvı azot yere yağ doku örneği seçin ve bir tüp rafa koymak için kullanın. Tüpler doku toz yaklaşık 100 mg için karşılık gelen toz, ~ 1 mL içermelidir.
- Tüpü yavaşça aç.
Not: Olarak azot basıncı tüpünden kaçış eğilimi kapalı tüp oda sıcaklığında bırakarak ya da çok hızlı tüp'ın kapağını açarak örnek kaybı ya da yaralanma neden olabilir. - Fenol çözeltinin 500 µL örneğe ekle (1:2 oranında fenol çözüm: doku tozu).
- Yakın metro ve girdap yaklaşık 5 için maksimum hızda kapağını yavaş yavaş s. ve dikkatle (Hava tüp dışında gelen ses duyulabilir) azot basıncı serbest bırakmak için tüp açın.
- 3.5 ve 3.6 adımları yineleyin. Örnek için eklendi son fenol çözüm 1 mL birimdir.
- Örnek tamamen eriyene kadar 3,6 adımı yineleyin.
Not: Patlama gelen tüp önlemek için devam etmeden önce tüp basıncı serbest bırakmak önemlidir. - Sonraki örnekleri için adımları 3.4-3,8 tekrar ederken oda sıcaklığında stand örnek ver.
- Tüm örneklerini bir kez işlenir, kısaca girdap maksimum hızda ve tüm örnekleri, oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya.
- 12 000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Tüpler geri oda sıcaklığına getirmek.
Not: Santrifüjü sonra 3 aşama Şekil 2' de gösterildiği gibi bulunur: yağ (üst), RNA (orta) ve Pelet (altta). - Her örnek için kadar RNA (orta pembe tabaka) mümkün olduğunca filtre uygulanmış bir ipucu kullanarak bir P1000 pipet ile ilgili tüpler ilk kümesi aktarın. İpuçları örnekleri arasında değiştirin.
- RNA (orta katman) en az kirlenme lipid (üst katman) sağlamak için üst aşama tüp kenarına yakın bir yerde ucu pierce. RNA dağıtmak önlemek için yeni tüp kenarlarında dokunmadan yeni konik tüpler içine belgili tanımlık uç dışarıdan olabilir lipidler aktarma.
- Saf kloroform 200 µL her örnek için ve inversiyon 15 s. kuluçkaya 10 dakika oda sıcaklığında tarafından karıştırın.
- 12 000 x g 4 ° c de 15 dk santrifüj kapasitesi ve tüpler geri oda sıcaklığına getirmek.
Not: Santrifüjü sonra 3 aşama bulunur: RNA (üst), DNA (orta) içeren interfaz ve proteinler (alt) içeren kırmızı fenol-kloroform. - Her örnek için çok sulu şeffaf RNA içeren faz (en iyi fazı) mümkün olduğunca ilgili konik tüpler ikinci kümesine filtre-ipuçlarını kullanarak bir P1000 pipet ile aktarın. İpuçları her örnek arasında değiştirin.
Not: Interphase kırılgandır ve aspirasyon çok hızlı bir şekilde yapılırsa üst aşama kontamine. Alternatif olarak, bir P200 pipet Interphase rahatsız edici olasılığını azaltmak için kullanın. - 500 µL % 100 isopropanol, her örnek için ve inversiyon 15 saniye ile karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dk kuluçkaya
- 12 000 x g 4 ° c de 10 dk santrifüj kapasitesi ve tüpler geri oda sıcaklığına getirmek. İsopropanol her tüpün ters çevirme tarafından atmak.
Not: Küçük bir beyaz RNA Pelet genellikle görülebilir ancak zaman zaman olmayabilir. - Her örnek ve kısaca girdap 1 mL (% 100 etanol ve sudan RNase free hazır) % 75 etanol eklemek her tüpün maksimum hızda.
- 7 500 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve tüpler geri oda sıcaklığına getirmek.
- Her tüpün ters çevirme tarafından % 75 etanol atın ve hafifçe kahverengi bir kağıt karşı herhangi bir artık kaldırmak için dokunun.
Not: Gerekirse, filtre bahşiş alkol RNA Pelet yakınındaki kaldırmak için kullanın. İpucu örnek arasında değiştirin. - Yaklaşık 15-20 dk için RNA Pelet kapağı açık bırakın ve hava kuru.
Not: RNA topakları bu adımı sırasında yarı saydam hale gelebilir. - RNA solubilization Pelet gelen boyut bağımlı olduğu gibi RNA solubilize için kullanılacak RNase free su hacmi belirlemek için Pelet boyutunu değerlendirmek. Her örnek için birim (10-25 µL) yazın.
Not: Bu adım sadece niteliksel olduğunu. RNA Pelet görülemez, RNA-Alerjik su 10 µL örnek için ekleyin. - 10-25 µL RNase free su örnekleri (önceden belirlenmiş miktar adımda 3.24) ekleyin.
- Örnek 5 min 60 ° C'de ayarla bir ısı bloğundaki kuluçkaya Kısaca girdap tüpler.
- Örnek bir ek 5 min 60 ° C'de aynı ısı bloğundaki için kuluçkaya
- Hızlı-spin tüm örnekleri bir mini santrifüj spin ve hemen buza koy.
- RNA konsantrasyon ve saflık belirler. Daha sonra kullanmak için bir-80 ° C dondurucuda ters transkripsiyon (cDNA elde etmek veya örnekleri depolamak için RT) gerçekleştirin.
Not: Bu RNA örnekleri alçaltır birden çok donma/çözülme döngüsü önlemek.
4. yağ dokusu RNA konsantrasyon ve saflık tespiti
- Yağ dokusu RNA örnekleri ayıklanmış taze ve çözündürüldükten veya-80 ° C dondurucuya önceden depolanan olup olmadığını, tüm örnekleri toplamak ve onları buza yordamı başlayana çözülme izin. Sadece önce bir sonraki adımının veya birden çok donma/çözülme döngüsü önlemek için yalıtım sonunda yapılması gerekir.
- Hazırlamak ve 1,5 mL konik tüpler RNase free iki kümesi tanımlamak ve bir tüp rafa koydu.
- Ne zaman tüm RNA örnekleri tam çözdürülen, girdap 1 s ve buz üzerinde geri koymak için bir örnek.
- Seyreltik, RNA 100-fold içinde 1 x TE çözüm kullanarak RNase free 1,5 mL konik tüpler ilk kümesi filtre RNase ücretsiz ipuçları (1 x TE çözüm 99 µL ve RNA'ın 1 µL tüp koymak).
- Her örnek için yineleyin.
Not: Birimleri her Spektrofotometre bağlı olarak kullanılan küvet için farklı olabilir. - Bir kez tüm örneklerini işlenir, girdap her örnek seyreltilmiş.
- Protokolü (1 x TE) boş bir parola kullanarak tarafından araç ayarlamak için Spektrofotometre ile seyreltilmiş RNA örnekleri işleme önce izleyin.
- Kuvars küvet seyreltilmiş RNA örnekleri aktarmak ve her örnek 260 konsantrasyonu belirlemek nm.
Not: Spektrofotometre son RNA konsantrasyon sağlamıyorsa, hesaplamak için bu formülü kullanın: RNA (µg/µL) OD260 x seyreltme faktörü (40 µg RNA/1 000 µL) x =. - Her örnek RNA saflık oranı OD260/OD280hesaplayarak belirlemek.
Not: Bir oranı OD260/OD280 2.0 çevresinde genellikle RNA12için saf kabul edilir. RNA kalite doğrulanıp doğrulanmadığını önerilir. Bunu yapmak için üzerinde 1 x TBE arabellek (89 mM Tris Bankası, 89 mM Borik asit ve 2 mM EDTA, pH 8.0) yapılan bir % 1 özel Beyazlatıcı jel RNA'ın 1 µg koymak ve % 1 çamaşır suyu çözüm13 (şekil 3). RNA çok kaliteli 28S ve 18S rRNA bantları gösterir ve 28S grup 18S daha yoğun olması gerekir. Her iki rRNA grup benzer bir yoğunlukta görünür olduğunda RNA kalitesi kabul edilebilir. RNA kalite 18S grubudur daha yoğun 28S grup daha, ve ne zaman bir smear görünür, RNA bozulması göstergesidir andan eksik oluyor. - Her örnek için 0,5 µg/µL RNA'ın RNase free su gerektiği gibi örnekleri sulandırmak için kullanmayı RNase free 1,5 mL konik tüpler ikinci kümedeki stoktan 10 µL hazırlayın. Bu örnekler için RT cDNA elde etmek için kullanılır.
- Bir kez tüm örneklerini işlenir, RT başlatmak veya örnekleri-80 ° C dondurucu daha sonra kullanmak üzere saklayın.
5. ters-transkripsiyon (RT)
- Yağ dokusu RNA örnekleri taze 0,5 µg/µL seyreltilmiş veya-80 ° C dondurucuya önceden depolanan olsun, tüm örnekleri ve Kimyasalları toplamak ve onları buza yordamı başlayana çözülme izin.
- PCR tüp şerit raf buza koy. Bir kez yeterince soğuk hazırlamak ve tanımlamak RNase free PCR tüp kümesi şeritler ve rafa koydu. Boş bir yer.
- Reaksiyon RNA Dnaz tedavisi için hazırlamak: aşağıdaki ana karışımı (için örnek + 1 örnek gerekli miktarda) yapmak (miktarlar 1 örnek için): 10 MgCl2, ben (1 U/µl) ve 7,5 µL RNase free, su kullanarak Dnaz 0.5 µL ile reaksiyon tampon X 1 µL Filtre-ipuçları. Her tüp 9 µL dağıtmak.
- 0,5 µg/µL RNA'ın 1 µL caps koy her şerit ve hızlı-spin örnek tüpü dibine getirmek için bir mini tur tüm şeritler santrifüj kapasitesi karşılık gelen tüp her örnek ekleyin. RNA ücretsiz su boş 1 µL ekleyin.
- Tüm tüp şeritler termal cycler veya Isıtma blok 30 dk. tüp şerit buz rafa geri koymak için 37 ° C'de kuluçkaya.
- EDTA (50 mM) 1 µL her tüpün ekleyin ve tüm tüp şeritler termal cycler veya Isıtma blok 10 dk. tüp şerit buz rafa geri koymak için 65 ° C'de kuluçkaya.
- Aşağıdaki ana karışımı (için gerekli sayıda örnekleri artı 1 örnek) yapmak (miktarlar 1 örnek için): 1 µL rasgele hexamers (0.2 µg/µL) ve 1 µL dNTP mix (her biri 10 mM bir konsantrasyon, dört deoxynucleotides içerir). Filtre-ipuçlarını kullanarak her tüpün içinde ana Mix 2 µL dağıtmak. İpucu örnek arasında değiştirin.
- Tüm tüp şeritler termal cycler veya 65 ° C 5 dk. tüp şerit geri buz rafa koymak için Isıtma bloğunda kuluçkaya.
- Aşağıdaki ana karışımı (için gerekli sayıda örnekleri artı 1 örnek) yapmak (miktarlar 1 örnek için): 5 x RT arabellek, 1 µL RNase inhibitörü (20 U/µL), ters transkriptaz (200 U/µL) 0,25 µL ve su nükleaz Ücretsiz 1,75 µL 4 µL. Filtre uygulanmış ipuçlarını kullanarak her tüpün içinde 7 µL dağıtmak. İpucu örnek arasında değiştirin.
- Aşağıdaki programı ayarlayarak bir termal cycler RT gerçekleştirmek: 25 ° c, 50 ° C, 85 ° C'de 5 dk, 30 dk 10 dk Tüp şeritler buz rafa geri koymak.
- Hazırlamak ve PCR RNase free tube şeritler bir kümesini tanımlayan ve rafa koydu.
- Her örnek için 1:5 seyreltilmiş cDNA ultrasaf su kullanarak yeni tüp şeritler stoktan istenen hacmi hazırlayın. 1:5 seyreltilmiş cDNA örnekleri için gerçek zamanlı PCR kullanılacaktır.
- Bir kez tüm örneklerini işlenir, gerçek zamanlı PCR başlatmak veya örnekleri (hisse senedi ve seyreltilmiş numune)-20 ° C-dondurucu daha sonra kullanmak üzere saklayın.
6. gerçek zamanlı PCR için yağ dokuları gen ekspresyonu
Not: Floresan boya ışığa karşı kullanılmasını önlemek. İletişim kuralı aşağıdaki başvuru gen s1614amplifikasyon açıklar. Astar ve PCR koşulları faiz gen göre değiştirilmesi gerekir.
- CDNA örnekleri taze seyreltilmiş 1:5-20 ° C dondurucuya önceden depolanan, ister tüm örnekleri ve Kimyasalları toplamak ve onları buza yordamı başlayana çözülme izin.
- Gerçek zamanlı PCR tüp şeritler için raf buza koy. Bir kez yeterince soğuk hazırlamak ve gerçek zamanlı bir kümesini tanımlayan PCR tüp şeritler ve rafa koydu. Her örnek ve yinelenen boş hazırlamak.
- Aşağıdaki ana karışımı (için gerekli sayıda örnekleri artı 1 örnek) yapmak (miktarlar 1 örnek için): 1.9 µL ultrasaf su, floresan boya (örneğin SYBR yeşil), 5 µL ve 0.3 µL ileri bir astar ve ters astar 0.3 µL. Her tüpün içinde 7,5 µL dağıtmak.
- 1:5 seyreltilmiş cDNA 2.5 µL her örnek için karşılık gelen tüp ekleyin. 2.5 µL boşlukları ultrasaf su ekleyin. Kapaklar her şerit üzerinde koymak.
- Gerçek zamanlı PCR aşağıdaki programı kurmak için üreticinin yönergelerini izleyin: 95 ° C ve 40 döngüleri 15 10 min 50 ° c, 30 s s 60 ° c, 30 s 70 ° C'de Örnek şeritler gerçek zamanlı PCR makinesi rotor koymak ve programı başlatın.
Not: Termal cycler şartlarına kullanılan cihazları ve gen ilgi bağlı olarak değişmektedir. mRNA ifade sonucu şekil 3 gösteri leptin mRNA amplifikasyon tarafından referans gen S16 mRNA amplifikasyon14,15normalleştirilmiş sundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekropsi yordamı izleyerek üç beyaz yağ dokuları toplanmış ve fareler (N ve HF diyet beslenen farelerin) iki grup ağırlıklı. Beklendiği gibi fareler HF diyet son vücut ağırlığı ve kilo alımı littermates N diyet (Tablo 1) göre artmıştı. Logosuna 2 kat artış PGF, PRF ve SCF ağırlığını obez farelerde N diyet'e kıyasla daha fazla bu gözlemler eşlik edildi.
İzole RNA ile herhangi bir deneyler gerçekleştirmeden önce saflığı 4,9 adımda anlatıldığı gibi değerlendirilmiştir. Her beyaz yağ dokusu için saf RNA (Tablo 2) olarak kabul edilir civarında 2.0 OD260/OD280 olduğunu oranı olarak örnekleri yeterli kalitede RNA izolasyon fenol çözüm tarafından üretilen. Gerçek zamanlı PCR veri leptin mRNA ifade PGF, PRF ve SCF obez farelerin N diyet (şekil 4A)'e göre önemli ölçüde arttı gösterdi. Nitekim, leptin mRNA ifadede gözlenen farklılıklar s16, Ct değerleri değil değiştirilmiş olarak fareler iki grup arasındaki sonuçlar normalleştirmek için kullanılan referans gen (şekil 4B) bir değişim nedeniyle değildi. HF diyet bir çalışma protokolü bir parametre belirtilir böylece, s16 güvenilir bir referans gen PGF, PRF ve SCF mRNA ifade için kullanılabilir.
Resim 1 . Farelerde beyaz yağ dokusunun anatomik Lokalizasyon. N diyet erkek fare her yağ dokusu depo ve böbrek üstü bezleri lokalizasyonu göstermek için davranışlarını kesip. SCF (A), (B)PGF, PRF (C) ve böbrek üstü bezi (D). PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . RNA izolasyon protokolü akış şeması kullanarak fenol çözüm. RNA topraklı beyaz Yağ dokusundan izole etmek için gereken adımları şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Çamaşır suyu jel üzerinde RNA kalite değerlendirme. 1 ug subcutaneous yağlı (SCF) ve peri Gonad yağ (PGF) izole RNA'ın üzerinde % 1'özel beyazlatıcı Jel Elektroforez tarafından ayrılmış. 28s ve 18s rRNA UV-transillumination tarafından görüntülenmiştir. Jel SCF ve bir fare PGF izole RNA normal bir diyet beslenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . HF diyetin etkisi beyaz yağ dokusu leptin ve s16 mRNA ifadede. Leptin (A) ve s16 (B) mRNA ifade. Veri s16 için Ct değer olarak gösterilir ve her ikisi de ortalama ± SE n olarak sunulmaktadır leptin için veri s16 mRNA düzeyleri için normalleştirilmiş 12-13 grup başına =. * p < 0.05 N diyet için karşılaştırıldığında. N, normal; HF, yüksek yağ; PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. Bu rakam Tan, değiştirilmiş olan P. ve ark, obezite (2014) 22, 2201-2209. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| N diyet | HF diyet | |
| Son vücut ağırlığı (g) | 37,5 ± 1.3 | 46,7 ± 1.7* |
| Kilo alımı (g) | 6.6 ± 0.7 | 16,7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1,08 ± 0.17 | 2,19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 1,71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0,35 | 3,55 ± 0.20* |
Tablo 1. Vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlıkları HF diyet etkisi. Değerleri ifade aracı olarak ± SE n = 14-15 grup başına. * p < 0.05 N diyet için karşılaştırıldığında. N, normal; HF, yüksek yağ; PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. Bu rakam Tan, değiştirilmiş olan P. ve ark, obezite (2014) 22, 2201-2209.
| Örnekleri | Oranı OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2,02 |
| DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 1 | 1,95 |
| DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 2 | 2.08 |
| DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2,02 |
| SCF 3 | 2.06 |
Tablo 2. RNA saflık beyaz yağ dokuları izolasyonu sonra. n = 3 yağ dokusu başına. PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aşağıdaki HF-diyet, beslenme obez fareler vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlık N diyet beslenen fareler için karşılaştırıldığında artmıştır bulunmuştur. Fenol çözüm kullanarak çıkarılan RNA iyi saflığı ile örnekleri vermiştir. Leptin öncelikle yağ dokusu tarafından üretilen bir adipokine ve olumlu fat kitle16ile ilişkilendirmek için bilinir. Beklendiği gibi leptin mRNA ifade obez farelerde concomitance onların yağ kitlesi ile artmıştır.
Bu yöntem birkaç önemli adımlar vardır. Farklı yağ dokusu depoları farklı işlevleri2,5var bilinen büyük kirlenme bir beyaz yağ dokusu depo başka bir ile olanıdır. Kirlenme downstream uygulamalarında yanıltıcı sonuçlar getirebilir. Şişman fareler arasında düzenli ve tutarlı bir hızda beyaz yağ dokusu toplama hava ile temas halinde bir kez kuru eğilimi gibi Ayrıca, kilo alınması gerekip gerekmediğini önerilir. Aksi takdirde, bir yağ yastığı toplam ağırlığı yanlış olabilir. Kısa bir süre önce MIQE takip RNA iyi kalite ve verim, almak için kurallar olduğunu kesin kıymet17. Özellikle, taşlama sırasında çok iyi örnek toz verme verimi en üst düzeye çıkarmak yardımcı olabilir. Bu RNA izolasyon sırasında doku toz ve fenol çözüm arasında temas en üst düzeye çıkarır. Son ama en az değil RNA içeren katman yalıtım sırasında RNA izolasyon (Adım 3.12) olduğunu. Yağ daha az su daha yoğun olduğu için faiz faz üzerine yerleştirilir. Yağ etkilenmişimdir en aza indirme aşağı akım uygulamaları ile girişim azaltmak gereklidir.
Bu yöntemin bir sınırlama yordamı hem de RNA izolasyon sırasında zararlı Kimyasalları ile çalışmak için gereken birkaç adımları gerçekleştirmek için gerekli beceri olduğunu. Ayrıca, tüm emek yoğun bir süreçtir.
Yağ dokusu toplama ve RNA izolasyon genellikle her kullanıcı tarafından ayarlanır küçük ayrıntılar dışında önce işleme örnek yöntemine çok alternatif değildir. RNA izolasyon söz konusu olduğunda, fenol/kloroform ayıklama veya RNA izolasyon kitleri gibi birçok seçenek mevcuttur. Orada avantajları ve dezavantajları her seçenek ve aşağı akım uygulamaları esaslı en iyi yöntemi seçmesini kalmıştır. Fenol/kloroform ayıklama daha ucuz ama zararlı Kimyasalları kullanımı gerektirir ve zahmetli. RNA izolasyon kitleri genellikle daha pahalıdır ama prosedür daha hızlıdır ve genellikle iyi bir kalite ve saflık örnekler verir. Malzeme beyaz yağ çoğunlukla oluşan dokusunda yağ sınırlı olması nedeniyle verim ve RNA saflığı dikkate almak önemlidir. Fenol çözüm için yalıtım (fenol/kloroform çıkarma) kullanarak önemli yararı RNA, DNA ve protein bir tek örnek18ayırma imkanı vardır. Bu maliyet ve zaman etkili gibidir yeterli malzeme almak için gerekli fare sayısını azaltır. Daha önce de belirtildiği gibi yağ kitlesi bazı fare modellerinde sınırlıdır. Bu aşağı akım uygulamalar için yetersiz malzeme neden gibi yere yağ dokusu ayrı ayrı RNA, DNA ve protein elde etmek için üç parçaya bölerek bu fareler için önerilmez. Bu sorunu aşmak için birlikte gerekli hayvan sayısının bir artmasına yol benzer yağ dokusu perondan kullanıcı tanımlı kriterlere göre birkaç fare havuzu mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser diyabet Kanada tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
