Summary
اضطرابات استخدام الكحول (AUD) مشكلة صحية وطنية كبرى ومطلوب تطوير علاجات أكثر فعالية لمواجهة احتياجات السكان هذا المريض. وتحقيقا لهذه الغاية، تستخدم البروتوكول التالي نموذجين الشرب القوارض بسيطة لتقييم فعالية الإكلينيكية لمركبات الكحول المضادة الرصاص.
Abstract
اضطرابات استخدام الكحول (AUD) مشكلة رئيسية مع أكثر من ما يقدر ب 76 مليون شخص في جميع أنحاء العالم الوفاء بمعايير التشخيص. العلاجات الحالية تقتصر على الأدوية وافقت إدارة الأغذية والعقاقير الثلاثة التي غير فعالة إلى حد كبير حتى عندما جنبا إلى جنب مع النفسية الانتكاس التدخل، كما يتضح من الارتفاع معدل. على هذا النحو، والبحث عن علاجات أكثر رواية تمثل هدفا هاما في مجال صحة العامة. وتحقيقا لهذه الغاية، تستخدم البروتوكول التالي نموذجين الشرب القوارض بسيطة لتقييم فعالية الإكلينيكية لمركبات الكحول المضادة الرصاص: اختيار اثنين--زجاجة (الدرن)، وشرب في الظلام (DID). السابق يسمح للفئران للشرب الطوعية في الاعتدال بينما يدفع الأخير الفئران للتبرعات تستهلك كمية كبيرة من الكحول في فترة قصيرة أن يحاكي السمر. تسمح طبيعة بسيطة وعالية الإنتاجية لكل من هذه النماذج للفحص السريع لوكلاء الدوائية أو لتحديد سلالات فئران الذي يحمل بعض السلوك الطوعية مياه الشرب.
Introduction
للماضي 25 بالإضافة إلى سنوات، وضعت جهدا كبيرا نحو تطوير أدوية لعلاج اضطرابات استخدام الكحول (AUD)1. على الرغم من أن العديد من تقدم، أسترالي لا يزال مشكلة رئيسية لصحة العامة، التي تؤثر على الأميركيين ما يزيد على 18 مليون، وتكلف ما يزيد على مبلغ 220 بیلیون سنوياً2،3. يوجد حاليا ثلاثة فقط الأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، ديسولفيرام، نالتريكسون، واكامبروسيت، كل هذه قد أسفرت عن نتائج غير متناسقة في التجارب السريرية ونجاحاً محدودا حتى عندما جنبا إلى جنب مع التدخل النفسي الاجتماعي في إعدادات عيادة 4 , 5 , 6 , 7.
سبب الرئيسي لفشل العلاج أسترالي الحالي يرتبط بطبيعة ايربان أسترالي8. بينما تسهم العوامل البيئية والوراثية على حد سواء لتنمية أسترالي، حسابات التوريث لما يقدر 50-60 ٪ من خطر ظهور9. مشابهة لعلاج الاكتئاب، فإنه مقبول على نطاق واسع أن المرضى الذين يعانون من أسترالي سوف تحتاج إلى مجموعة متنوعة من الأدوية التي صممت خصيصا لتلبية احتياجات كل مريض10.
ومن الواضح أن هناك حاجة ملحة لعلاجات أكثر فعالية سيتيسر إذا كانت عملية شاقة بالفعل وتستغرق وقتاً طويلاً لاكتشاف المخدرات مبسطة3. وتحقيقا لهذه الغاية، يوضح البروتوكول التالي انطباق هذين النموذجين الشرب القوارض المستخدمة على نطاق واسع لدراسة أساس العصبية الحيوية AUD11الإكلينيكية. وبشكل أكثر تحديداً، طريقة عرض هذه الوثيقة يمكن تقييم كفاءة المركبات المرشحة في الحد من الكحول الاستهلاك في كل من "المعتدلين" وسيناريوهات "حفلة شرب" استخدام الخيار الثاني--زجاجة (TBC) وشرب في النماذج (DID) الظلام، على التوالي. دراسة كلا نماذج الإدارة الذاتية الإيثانول هواء غير فعال، حيث الفئران يبتلع الإيثانول شفويا وفي الإرادة، وذلك توضيح الوجه عالية وبناء صحة كنموذج لإدمان الكحول البشرية11.
في TBC الشرب، ويعرف أيضا باسم حرية اختيار الشرب، وتفضيل شرب، أو الشرب الاجتماعي، زجاجتين من الحل متوفرة بشكل مستمر في قفص المنزل. زجاجة واحدة على المياه، وأخرى تحتوي على حل مخفف من الإيثانول، حيث يمكن أن تختلف تركيز الإيثانول (على سبيل المثال-، 5-30% v/v)11،12. الفئران من الوصول المستمر إلى كلا زجاجات، وذلك، يمكن اختيار كم تشرب من كل زجاجة.
ويقيم هذا النموذج استهلاك الإيثانول كل الماوس (غرام/كغ)، فضلا عن نسبة تفضيل الإيثانول (حجم الإيثانول المستهلكة ÷ إجمالي حجم السائل المستهلكة). يتم استخدامه بشكل روتيني لمقارنة مستويات مياه الشرب عبر سلالات مختلفة من الفئران، أو بعد تلاعب بالجينات محددة (على سبيل المثال.، خروج المغلوب الجينات أو ضربة قاضية) والنتائج في تركيزات الإيثانول الدم (بكس) مماثلة لما هو موجود في البشر عندما الشرب في الاعتدال13،14.
في الإجراء فعلت، ح 3 بعد بدء دورة الظلام، يتم تبادل زجاجة قفص المنزلية للمياه مع زجاجة من 20% (v/v) الإيثانول الحل لوصول محدود شرب الدورة. تحدث دورات مياه الشرب كدورة 4 أيام متتالية ودائم ح 2 في 1-3 أيام وح 4 يوم 4. 1-3 أيام بمثابة فترة تعود الكحول قبل إجراء الاختبار في يوم 4. ونتيجة لذلك، الفئران موثوق سوف تستهلك الإيثانول ما يكفي لبلوغ بكس > 100 ملغ/دل، ونتيجة لذلك تظهر الآثار السلوكية للتسمم التي وجدت في البشر التي حفلة الشرب13،،من1415. الحصول على الماء متاح في جميع الأوقات عدا دورة مياه الشرب.
وهناك العديد من الاختلافات للشرب الوصول المحدود. على سبيل المثال، في نموذج access متقطعة، الفئران تلقي اثنان زجاجات (المياه التي تحتوي على واحد والايثانول الأخرى التي تحتوي على 20% (v/v)) إلا في يوم الاثنين والأربعاء والجمعة مع فترة انسحاب ح 24 و 48 ساعة خلال أيام الأسبوع وعطلات نهاية الأسبوع، على التوالي16. بعد عدة أسابيع من الوصول المتقطع، الفئران تدريجيا وتصعيد طوعا شرب مستويات، في نهاية المطاف تحقيق بيكس مشابهة لما يلاحظ في طراز فعلت. ومع ذلك، فعلت، يبدو أن النموذج الأكثر شيوعاً لتقييم سلوك نهم مثل مياه الشرب. توجد نماذج أخرى للشرب متقطعة، لكنها تعتمد على تقييد إمكانية الوصول إلى الغذاء أو بخار الدائرة الناجمة عن الزيادات في الإدارة الذاتية الطوعية، مما يجعلها أقل تمثيلاً ل استهلاك الكحول البشرية الطوعية16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الإجراءات الموضحة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدام الحرم الجامعي العلوم الصحية جامعة جنوب كاليفورنيا.
1-الإعداد التجريبية والجمعية
- الحصول على جميع المواد الكيميائية قبل بدء الدراسة واللوازم التالية: الفئران، قمم القفص أقفاص/المعادن، الفراش، الغذاء، المياه، الإيثانول، بيبيتس، وقمم سيبر، يتقلص التفاف، فائدة سكين، العلاقات الرمز البريدي، الشريط، موقد بنسن، والحجم، وكشافات.
- الحصول على فئران C57BL/6J، أما من مصدر تجاري أو مستعمرة داخل المنظمة، مع الأخذ في الاعتبار أن الفئران يمكن أن الفريق يضم حتى وقت الاختبار.
ملاحظة: العدد الكلي للفئران التي تم شراؤها يعتمد على تعقيد التصميم التجريبي. خطة لاستيعاب ما يقرب من 12-15 الفئران كل مجموعة، مع دراسات رائدة لا أصغر من 5-7 الفئران كل مجموعة. أننا استخدمت في النتائج الممثل هو موضح أدناه إنشاء مجموعة اثنين بسيطة لتقييم العلاقة السببية باستخدام جرعة واحدة (5 مغ/كغ) من المخدرات (MOX). - اتبع الخطوات التالية لتجميع الزجاجات18.
- الحرارة بسكين فائدة استخدام موقد بنسن.
- باستخدام هذا السكين، قطع تقريبا شبر قبالة نهايات بيبيت المصلية البلاستيك 18 مل أعلى وأسفل.
- لاحظ أن بيبيتس حجم أصغر (أي، 10 مل) يمكن أن يستخدم أيضا لزيادة دقة القياس.
- الحارة بيبيت تحت بندقية حرارة.
- إدراج أنبوب سيبر واضعا الكرة في نهاية "أسفل" بيبيت (وبعبارة أخرى، فتح الأقرب إلى السطر داش مل 18).
- ختم الأنبوب سيبر في المكان مع تقليص التفاف استخدام بندقية التفاف انكمش متاحة تجارياً.
- فتح غطاء قبالة الأخرى مع سداده سيليكون.
2-الحيوان التعود
- ابتداء من 1 أسبوع على الأقل قبل تاريخ بدء التجربة، نقل الفئران إلى الغرفة التي توجد فيها إجراءات تجريبية تنفذ حتى أن كانوا قد تأقلم على ظروف تربية (بما في ذلك درجة الحرارة المحيطة (21 ± 1 درجة مئوية) و 12-ح عكس اتجاه دورة الضوء/الظلام، مع أضواء إيقاف الساعة 12:00 م). تأكد من اتباع مبادئ توجيهية مؤسسية وإخطار القنوات المناسبة قبل نقل الحيوانات من مكان إلى آخر.
- إذا كان يجري نقل الفئران من دائرة الضوء/الظلام قياسية تسمح 2 أسابيع وقت الإضافي التعود.
- ملء الزجاجات حديثا أدلى مملوءة بالمياه. تأكد من أن يتم إغلاق الغطاء بطريقة آمنة وخالية من أي فقاعات الهواء أو تسرب من صنبور. إذا كان الحل هو تسرب، إعادة تأمين الحد الأقصى. قم بإزالة أي فقاعات الهواء ببساطة التنصت على الزجاجة حتى يفلت الهواء في الأنبوب.
- ولدى وصوله، بيت واحد كل الماوس في أقفاص القياسية البولي/بوليسولفوني مع الأسرة وأعلى قفص شبكة معدنية؛ قم بإزالة غطاء القفص كما لم يعد يتم استخدامه.
- توفير إمكانية الوصول إلى الغذاء و water bottle(s) libitum الإعلانية.
- تأمين كل زجاجة إلى أعلى القفص بالتفاف تعادل الرمز بريدي بلاستيك حول كل زجاجة أنه عقد في مكان. تقليم أي البلاستيكية الزائدة من التعادل الرمز البريدي التأكد من أن أنها لا تبرز في القفص.
ملاحظة: للشرب في الإجراء (DID) الظلام، مطلوب زجاجة واحدة فقط من المياه. ومع ذلك، يتطلب التعود على نموذج الاختيار (TBC) زجاجة اثنين، أن تشمل إنشاء قفص زجاجتين من المياه. إذا تم تصميم هوبر الشبكة المعدنية التي قدمت لعقد زجاجة واحدة فقط من الحل، ينحني بلطف وبصرف النظر عن أشرطة لإنشاء مساحة لصفيحة إضافية لاستيعاب الزجاجة الثانية للدرن.
- إعداد على الأقل 3 أقفاص الحرة التحكم الماوس. وهذا سيسمح لرصد أي خسارة السوائل بسبب التبخر أو انسكاب من الزجاجات، الذي هو مجرد تواجد طبيعي الذي يحدث كما توضع الأقفاص وإيقاف حامل قفص (راجع الخطوة رقم 2.6.3 و 3.6.1 و 4.6.1 للمعادلات).
- اعتبارا من يوم 4 التأقلم الإسكان مدتها أسبوع واحد، قياس وتسجيل أوزان كل الماوس، استخدام مقياس، (بالغرام) فضلا عن كمية المياه، استخدام محفورة جنبا إلى جنب مع زجاجة المقلوب لتسجيل أعلى نقطة في الجسم والغذاء اليومي غضروف (في مل).
- في حين أنها معيار الممارسة العلمية لقراءة أدنى نقطة من غضروف مقعرة، لأن الزجاجات البقاء في وضع مقلوب أثناء أخذ القياس، سجل أعلى نقطة غضروف.
- تقييم معلمات 2.5 استخدام المعادلات التالية:
- قياس "تغير وزن الجسم" (ز): الوزن لليوم الحالي (ز)-وزن (ز) في اليوم السابق.
- قياس "المدخول الغذائي" (ز): وزن الغذاء في اليوم السابق (ز)-وزن الغذاء في اليوم الحالي (ز).
- قياس "كمية المياه" (مل): فقدان الماء متوسط [حجم المياه في اليوم الحالي (mL)-حجم المياه في اليوم السابق (mL)]-من كل عنصر تحكم أقفاص (mL).
- كرر الخطوة 2.5 تباعا، في أيام 5-7، للسماح لتحديد خط الأساس لمدة الثلاثة أيام مباشرة قبل إدخال الإيثانول. إذا كان لا يمكن تجميع تسجيل على التوالي، تمديد فترة التأقلم للسماح بتقييم قياسات أساسية.
- مرة واحدة قد استقرت كمية المياه إلى تقلب ± 10% من متوسط آخر 3 أيام، تبدأ الوصول الإيثانول بالدرن (وصول غير محدود) أو فعلت (وصول محدود).
ملاحظة: في مناسبة نادرة، واحد إلى اثنين أيام إضافية قد يلزم للمواضيع تحقيق هذا الاستقرار؛ لا تندهش إذا كان يلزم وقت إضافي للقيم المراد عرضها تقلب ± 10% من متوسط آخر 3 أيام.
3-24 ساعة اثنين زجاجة خيار (الدرن)
ملاحظة: أعد 1 الشكلتخطيطي.
- تعد حلاً إيثانول 10% (v/v) في حجم 500 مل بإضافة مل 52.65 190 الحبوب دليل على الإيثانول (الإيثانول ~ 95 ٪) إلى 447.35 مل ح2س؛ يجب التأكد من أن يهز جيدا. ونظرا لأن الإيثانول تتبخر بسرعة، يحل محل الحل في الفاصل الزمني لكل يوم 3-4.
ملاحظة: يمكن استخدام تجمعات أخرى من الإيثانول، وكذلك، ولكن يوصي المؤلفون بتركيز 10% لهذا النموذج. - اليوم الأول من الدرن، (يوم 8 في أقرب وقت ممكن) فارغة 1 من 2 زجاجات المياه، في كل قفص، وملء حتى أسنانها مع الحل الإيثانول الطازجة. نظراً لأن الإيثانول والمياه صعبة ينبغي تمييز بصريا، وضوح تسمية الزجاجات مع محتوياتها المقابلة. ببساطة تطبيق قطعة من إخفاء الشريط إلى الزجاجة وواصفا إياه بأنه علامة أو بالكتابة مباشرة على الزجاجة.
- إضافة أكثر من حل لزجاجة الماء، حسب الحاجة.
- ضع الزجاجات مرة أخرى في القفص، التأكد من أن يتم إغلاق كافة caps بشكل أمن وخال من أي فقاعات الهواء أو تسرب من صنبور. إذا كان الحل هو تسرب، إعادة تأمين الحد الأقصى. قم بإزالة أي فقاعات الهواء ببساطة التنصت على الزجاجة حتى يفلت الهواء الزجاجة.
- البديل موقف زجاجات يوميا للصحيح لتفضيل المكان مكيفة ذات الصلة التأثيرات في الشرب النشاط (انظر مناقشة لمزيد من المعلومات).
- بالإضافة إلى القياسات اليومية من 2.5 و 2.6، والتي ظلت مستمرة، تبدأ في قراءة وتسجيل مستويات استهلاك الإيثانول كذلك. تحليل نسبة 10% إيثانول المدخول وتفضيل استخدام المعادلات التالية:
- قياس 10% "استهلاك الإيثانول" (مل): [وحدة التخزين من الإيثانول في اليوم الحالي (mL)--وحدة التخزين من الإيثانول في اليوم السابق (mL))]-متوسط الخسارة الإيثانول من كل عنصر تحكم أقفاص (mL).
- قياس 10% "استهلاك الإيثانول" (غرام/كغ): [10% إيثانول المدخول (mL) × 0.07893 غ/مل]/الجسم الوزن (كجم).
- قياس % التفضيل: [10% استهلاك الإيثانول (mL) المياه (mL)] x 100.
- بمجرد استهلاك الإيثانول أصبح مستقرا، إدارة حقنه (مالحة) داخل (القائمة) تحكم واحد (0.01 مل/غرام وزن الجسم) لكل الماوس أثناء القياس الروتين اليومي. وبهذه الطريقة، مواضيع أصبحت معتادة لحقن نفسه.
- يتم تعريف الاستقرار كتقلب ± 10% من متوسط آخر 3 أيام (نفس القسم 2.8).
ملاحظة: يمكن أن يستغرق يصل إلى 1 الأسبوع لمستويات الإيثانول لتحقيق الاستقرار. وهذا ينطبق بشكل خاص إذا الفئران تستخدم إعادة من تجربة سابقة، وكان التعرض السابق إلى الإيثانول. عنصر التحكم هو ببساطة المذيبات المستخدمة لحل المخدرات.
- يتم تعريف الاستقرار كتقلب ± 10% من متوسط آخر 3 أيام (نفس القسم 2.8).
- مرة واحدة بخط أساس إيثانول مع تقلب منخفض إعادة تأسيس، تقسيم الفئران إلى الجرعات مجموعات باستخدام قيم كمية الإيثانول حيث يكون جميع فئات مماثلة تقريبا متوسط قيم كمية الإيثانول.
- تعيين مجموعة واحدة كعنصر التحكم (الاستمرار في تلقي المالحة) والآخر التجريبية (القائمة حقن المخدرات التحقيق في 0.01 مل/غرام وزن الجسم). تبدأ المخدرات يوميا الجرعات، أما لمدة الحادة أو عدة أيام. في وقت لاحق، يمكن أن يكون عنصر التحكم إعادة عرض لاختبار آثار المخدرات بعد (اختياري).
ملاحظة: نظراً للشرب ويتم رصد عبر فترة طويلة 24-ح، وقت الإدارة الجرعة لا تعتمد على دورة الظلام.
- تعيين مجموعة واحدة كعنصر التحكم (الاستمرار في تلقي المالحة) والآخر التجريبية (القائمة حقن المخدرات التحقيق في 0.01 مل/غرام وزن الجسم). تبدأ المخدرات يوميا الجرعات، أما لمدة الحادة أو عدة أيام. في وقت لاحق، يمكن أن يكون عنصر التحكم إعادة عرض لاختبار آثار المخدرات بعد (اختياري).
4-الشرب في الظلام (فعلت)
ملاحظة: أعد 3 الشكلتخطيطي.
- في كل يوم للوصول إلى الإيثانول المجدولة (الأيام 1-4) تسجيل القياسات، لتخزين المياه، وتناول الطعام، ووزن الجسم، وتؤدي الجرعات المخدرات. القيام بذلك خلال وقت المختارة خلال دورة الخفيفة التي يتم اختيارها وفقا الدوائية للمخدرات حيث يكون المجمع في/أو تقترب من تركيز المخ كحد أقصى خلال فترة مياه الشرب.
ملاحظة: تذكر الأيام 1-3 تهدف إلى مجرد تأقلم الفئران للشرب مستويات وفيرة من الإيثانول في فترة قصيرة من الزمن. في حين أن الفئران لا تصل إلى مستويات تيرو مماثلة إلى 0.08 البشرية؛ في هذه الأيام "التدريب" ضمان أن يوم 4، خلال الدورة فترة أطول قليلاً من مياه الشرب، وسيكون في الواقع شرب إلى هذا المستوى.- إعطاء عنصر التحكم (المالحة) في الأيام 1-3، وأما من عنصر التحكم أو المخدرات جميع الفئران في يوم 4. يحدث هذا الإجراء فعلت على مدى فترة ثلاثة أسابيع مخدرات قبل (الأسبوع الأول)، وتشمل المخدرات (الأسبوع الثاني) ودورة مياه الشرب بعد المخدرات (الأسبوع 4).
- ملاحظة: لاحظ أنه خلال الأسبوع الذي يجرب المخدرات، وتستخدم مستويات استهلاك الإيثانول يوم 3 تعيين الفئران أما مجموعة عنصر التحكم أو المخدرات بطريقة يكون فيها مستويات استهلاك الإيثانول من كلا الفريقين لتباين أقل. وهذا خلافا للدرن، الذي يقوم بتعيين مجموعات على أساس متوسط 3 أيام على.
- تعد حلاً إيثانول 20% (v/v) (20E) في حجم 500 مل بإضافة مل 105.25 من 190 الحبوب دليل على الإيثانول (الإيثانول ~ 95 ٪) إلى 394.75 مل ح2س؛ يجب التأكد من أن يهز جيدا.
- تعبئة الزجاجات الإيثانول قبل بدء دورة مياه الشرب حيث أنه بمجرد أن يبدأ فعلت زجاجات المياه يمكن ببساطة الاستعاضة عن زجاجات الكحول.
- أثناء الدورة فعلت أسرة (الخطوات 4، 4، 5-8)، استخدام كشافات الضوء الأحمر حيث لا تزعج الحيوانات.
- في بداية فعلت شرب الدورة، ومن المقرر أن تبدأ 3 ساعات في دوامة الظلام، سجل حجم المياه لكل الماوس. ثم، استبدال كل زجاجة مياه بزجاجة من الحل 20E وسجل حجم الإيثانول ابتداء.
- قراءة وتسجيل حجم الإيثانول النهائية 2 ساعة في وقت لاحق، في نهاية دورة مياه الشرب في أيام 1-3 و 4 ساعات في وقت لاحق في اليوم 4. تحليل استهلاك الإيثانول 20 ٪ باستخدام المعادلات التالية.
- قياس 20% "استهلاك الإيثانول" (مل): [وحدة التخزين من الإيثانول في نهاية الدورة (mL)--وحدة التخزين من الإيثانول في بداية الدورة (mL) شرب شرب]-الإيثانول متوسط الخسارة من كل عنصر تحكم أقفاص (mL).
- قياس 20% "استهلاك الإيثانول" (غرام/كغ): [20% "استهلاك الإيثانول" (mL) × 0.15786 غ/مل]/الجسم الوزن (كجم).
- في يوم 4 فقط، مباشرة بعد تسجيل كميات الإيثانول، وقبل إعادة إدخال الوصول إلى المياه، جمع الدم لتقييم تركيز الإيثانول الدم من كل الماوس (اختياري).
ملاحظة: أي أسلوب جمع الدم غير الطرفية يمكن استخدام، مثل التهاب الجيوب الرجعية-المداري جمع الدم، أو جمع الدم الوريد الصافن. لبروتوكولات مفيدة راجع مراجع ل Parasuraman et al. 21 وياردلي et al. 20.- إجراء تحليل باستخدام أساليب مختلفة بما في ذلك لكمس، أو الآلية المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
- استبدال جميع الإيثانول الزجاجات بزجاجات المياه وكمية المياه سجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في التحقيقات التالية الممثل، شرب الاجتماعية كان على غرار استخدام نموذج اختيار اثنين--زجاجة (الدرن). باختصار، كان الفئران الوصول إلى زجاجتين من الحل، الواردة منها المياه، والآخر حل إيثانول 10% (v/v). تم بعد ذلك تقسيم المواضيع والمعينة بالتساوي إلى جماعات المخدرات العلاج، موكسيدكتين (MOX) مقابل السيطرة المالحة، حيث أن كل مجموعة ستكون قد بلغ مستويات استهلاك الإيثانول مع أقل قدر من الاختلاف.
كمية خط الأساس الأولى 10E خلال الفترة 24-ح استقرت عند 14.46 ± 1.85 غ/كغ (n = 8) قبل الحقن بدأت، وبعد ذلك إعادة استقرار 14.14 غ/كغ بعد الحقن الملحية. لتقييم آثار جرعة حادة (5 مغ/كغ) من الأكاسيد على استهلاك الإيثانول وتفضيل، كان شرب النشاط المقررة قبل موكس والاكسيد المختلط ووظيفة موكس. لقد وجدنا أن جرعة وحيدة من موكس انخفاضا ملحوظا تناول الكحول التي تتجاوز 45 في المائة، بالمقارنة مع ما قبل الحقن موكس [و (2، 22) = 26.33، ف < 0.0001] (الشكل 2ألف)، وتفضيل [و (2، 14) = 17.35، ف < 0.0001] (الشكل 2ب ) ما يزيد على 30 في المائة. تناول 10E وتفضيل ظلت أقل بكثير من المياه المالحة في اليوم التالي مباشرة لمعالجة موكس (بأكثر من 25%، و 15% على التوالي) وتظهر بشكل آخر حقن موكس في الشكل 2).
وفي دراسة تجريبية غير منشورة، السمر كان على غرار استخدام الشرب في الظلام الإجراء (DID) حيث الفئران يوميا محدودة الوصول (ح 2) لواحد زجاجة تحتوي على 20E بداية 3-ح إلى مرحلة الظلام الإيقاعية، لمدة 3 أيام متتالية، مع الحصول أطول الفترة (ح 4) في يوم 4 (الشكل 4). الفئران الإناث (n = 12, 6 الفئران/المجموعة) تدار حقن المالحة (القائمة) في الأيام 1-4 مع خط الأساس 20E أنشئت في يوم 4 (قبل المخدرات). في الأيام 1-3 من 2nd أسبوعيا دورة، تلقي جميع الفئران حقن المالحة يومية أخرى. ثم استخدمت قيم كمية الإيثانول من يوم 3 لتقسيم الفئران إلى مجموعتين (n = 6/المجموعة) التي وردت بعد ذلك أما حقنه واحدة (القائمة) من الأكاسيد (5 مغ/كغ) أو المالحة في يوم 4 (المخدرات). وتم قياس جميع الفئران وتلقى حقن المالحة يوميا على تناول الإيثانول و 1-4 أيام في الأسبوع التالي مرة أخرى في يوم 4 (وظيفة المخدرات). الإدارة الحاد 5 ملغ/كغ موكس كان تحليلها وتبين أن تناول الكحول انخفاضا كبيرا ما يزيد على 54 في المائة، بالمقارنة مع حقن المخدرات قبل (t = 7.635، ف < 0.0001)
الشكل 1 . اثنين--زجاجة "خيار التخطيطي"الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . اثنين زجاجة خيار (TBC). موكس (5 مغ/كغ) يقلل من 10% v/v الإيثانول (10E) كمية (ألف) ، وتفضيل (ب) في الإناث C57BL/6J الفئران باستخدام نموذج اختيار اثنين--زجاجة وصول 24-ح. وبعد تحقيق استقرار مستويات مياه الشرب لمدة 3 أيام متتالية، كانت تدار موكس. تمثل أشرطة 10E متوسط مستويات المدخول من اليوم قبل الحقن موكس (أبيض؛ قبل موكس)، وهو يوم حقن موكس (الأسود؛ موكس) واليوم بعد حقن موكس (الرمادي؛ وظيفة موكس). وتمثل القيم يعني ± ووزارة شؤون المرأة للفئران 12. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، و * * * ف < 0.0001 مقابل قبل موكس (الخط الأفقي الموجود في أقصى اليمين) أو وظيفة موكس (الخط الأفقي الموجود في أقصى اليمين)، توكي في اختبار الوظيفة المخصصة مقارنة متعددة. تعديل من هيونه أ. وآخرون. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . الشرب في "التخطيطي الظلام"الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الشرب في الظلام (فعلت)- موكس (5 مغ/كغ) يقلل كمية الإيثانول (20E) v/v 20% في الإناث من الفئران C57BL/6J تستخدم الشرب في نموذج الظلام. تمثل أشرطة 20E متوسط مستويات مدخول في الأسبوع السابق لحقن موكس (قبل المخدرات)، في أسبوع حقن موكس (المخدرات) وهذا الأسبوع بعد حقن موكس (بعد انتهاء المخدرات). وتمثل القيم يعني ± SEM للفئران 12 (6/المجموعة) بين المياه المالحة ومجموعات موكس. ف < 0.0001 مقابل المخدرات قبل (الخط الأفقي الموجود في أقصى اليمين) أو بعد انتهاء المخدرات (الخط الأفقي الموجود في أقصى اليمين)، توكي في اختبار الوظيفة المخصصة مقارنة متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في جميع أنحاء العالم تشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى 76 مليون شخص تفي بمعايير تبرر إجراء تشخيص لاضطرابات استخدام الكحول (أسترالي). ولسوء الحظ، العلاجات الدوائية المتوفرة حاليا غير فعالة إلى حد كبير وزيادة تطوير ضروري لمقابلة احتياجات هذا السكان السريرية20. وتحقيقا لهذه الغاية، البروتوكول التالي يهدف إلى تيسير هذا المسعى بتجسد اثنين من القوارض أبسط شرب نماذج: اثنان-زجاجة-خيار (الدرن) وشرب في الظلام (DID). كلا النموذجين قياس هواء غير فعال من الإيثانول، حيث يبتلع الفئران الإيثانول شفويا الإدارة الذاتية. في الدرن النموذج، الإيثانول (10% v/v)، والمياه، وكلاهما متاح بشكل مستمر، أسفر عن مستويات الإيثانول في الدم منخفضة نسبيا التي نتيجة لنمط استهلاك الإيثانول العرضية وتدريجي. هذا النموذج هو أفضل لتقييم مستويات أقل من كمية الإيثانول كتفضيل تاستانت، وعليه، هو أن تكون مماثلة للشرب "معتدلة" البشرية. يبين الشكل 2 أعلاه نتائج تمثيلية لنموذج TBC.
من ناحية أخرى، في فعلت نموذج الإيثانول (20% v/v) متوفر فقط لفترة محدودة من الزمن. وخلافا للدرن، يقيم هذا النموذج آثار مجمع على التركيزات ذات الصلة سلوكيا من الإيثانول، مع استفادة حقيقة أن الفئران C57BL/6J سوف تستهلك كميات كبيرة من الإيثانول بسرعة كبيرة خلال المرحلة الأكثر نشاطا من دورة الإيقاعية. تحدث هذه دورات مياه الشرب لمدة 4 أيام متتالية، ابتداء من 3rd ح في دوامة مظلمة، مع مدة ح 2 في 1-3 أيام وح 4 يوم 4. باستخدام هذا الإجراء، الفئران عادة تستهلك الإيثانول ما يكفي لتحقيق بكس > 100 مغ/دل ويحمل الأدلة السلوكية للتسمم. وترد نتائج تمثيلية لنموذج فعلت في الشكل 4. على الرغم من أننا لا يقيس بكس لهذه الفئران، مستويات مياه الشرب مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدبيات التي تحققت بكس على مدى 100 مغ/دل13،،من1415.
كلا نماذج لها حدود. أثناء حالات عندما جافاجيس عن طريق الفم هي الطريقة المفضلة للإدارة لإجراء التجارب الدوائية لمركبات الرصاص، اسوفوجيل الصدمة الناجمة عن هذا الإجراء قد تعوق الإيثانول من الإدارة الذاتية في كلا النماذج. وهذا ينطبق بشكل خاص لنموذج فعلت، الذي يستخدم تركيز أعلى من الإيثانول (20 في المائة) والذي هذا الحالات حيث تتطلب الدوائية للمخدرات دورة مياه الشرب تبدأ قبل الحيوانات قد يكون الوقت الكافي للتعافي من الإجراء. وهذا سيكون واضحا في مجموعة مراقبة الشرب على المستويات التي تتوافق مع إلى بكس أقل من 0.08 المتوقعة. شهدنا في المختبر، ولدينا صعوبة مع اﻹطعام القوة مع كل من فعلت والدرن. كنا قادرين على التغلب على هذه القضايا عن طريق صياغة لدينا المركبات حيث أنه يمكن تسليمها قطاع رقيقة (ODS) شفويا حل19باستخدام.
وعلاوة على ذلك، في نموذج فعلت على وجه التحديد، نظراً لأن فترة وصول الإيثانول قصيرة جداً في المدة، يجرب المخدرات يجب أن يتم خلال وقت المختارة خلال دورة الخفيفة التي يتم اختيارها وفقا الدوائية للمخدرات حيث مجمع في/أو تقترب من تركيز المخ كحد أقصى خلال فترة مياه الشرب. إذا كان لا يمكن إجراء تحليل الحرائك الدوائية، سيكون نهج بديل لإجراء تقييم دورة وقت الآثار السلوكية للمخدرات استخدام TBC. بعد هذا المنطق، برصد نشاط مياه الشرب على مدار ساعة، وتحديد آثار الكحول المضادة الذروة، أحد يمكن منطقياً وضع استراتيجية عندما المخدرات ينبغي أن تدار19.
بينما يحتوي حقل للادمان على الكحول مختلف نماذج حيوانية للتحقيق في مختلف الجوانب الفسيولوجية والسلوكية AUD8، البروتوكول التالي يصف اثنان نماذج شائعة الاستخدام، مما يسمح بإجراء مقارنات للنتائج عبر المختبرات. وهناك فائدة ثانية أن هذه الأساليب واضحة، مما يجعل استعمالها مريحة أثناء الدراسات الحادة والمزمنة مشابهة للأمثلة الواردة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، خلافا لغيرها نماذج الكحول شائعة الاستخدام، مثل تكييف هواء فعال وبخار نماذج الدائرة، المنهجية التي وصفناها هنا يمكن أن تتم دون الحاجة إلى معدات متخصصة. الروايات المتناقلة، فمن المحتمل أن يمكن الاطلاع على ما يقرب من جميع مكونات جهاز مياه الشرب في فيفاريوم مؤسسية تنميط. وهناك أيضا عدة طرق لتغيير البروتوكولات الموصوفة هنا، ذلك أنها يمكن أن تناسب أهداف كل تجربة. على سبيل المثال، لدينا إجراءات فعلت الأفضل لاختبار الآثار الحادة للمخدرات في دورة مياه شرب واحدة (خلال اليوم 4 اليوم). بيد أننا قد أظهرت أنه يمكن تقييم الجرعات المخدرات عدة أيام بزيادة دورات مياه الشرب إلى 4 أيام متتالية للوصول إلى 2 ساعة، بدلاً من الحالية 2 ساعة من الوصول في أيام 1-3 و 4 ساعات في اليوم الرابع19. يمكن أيضا نقل الفئران من إحدى المركبات نموذج إلى آخر، أو إعادة اختبارها لجرعات إضافية/مختلفة، مع فترة تبييض بسيط 1-2 أسبوع في ما بين.
تجدر الإشارة إلى أن أي تغيير الناجمة عن المخدرات في الشرب ولاحظ من خلال هذه الأساليب ويجب التحقيق بدقة لتحديد ما إذا كانت الآثار الانتقائي للكحول أو إذا أنها قد تكون نتيجة للسمية. لمزيد من المعلومات حول عناصر التحكم يجب الرجوع للقارئ إلى ياردلي وآخرون. 20 نموذج لا يوجد نموذج واحد لجميع جوانب هذا الشرط. بدلاً من ذلك، يدرس كل نموذج عادة عدد قليل من السمات الرئيسية المرتبطة أسترالي وربطت TBC وفعلت النماذج الموصوفة هنا، إلى مرحلة التسمم بنهم/دورة الإدمان. لفهم أكثر شمولاً لفائدة المجمع، ينبغي أن تستخدم نماذج مياه الشرب الإكلينيكية متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
إدارة التشريع والتوثيق ولوس أنجليس هي المخترعين على براءة اختراع ل repurposing ايفرمكتين وأفيرميكتينس ذات الصلة لمعالجة اضطرابات تعاطي الكحول. الكتاب ليس لها أي مصلحة أخرى من الصراعات، وهي مسؤولة بالكامل عن مضمون الورقة العلمية.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل، جزئيا، بأبحاث المنح كتسي SC المعاهد الوطنية للصحة/نكر/نكتس-UL1TR000130 (تفوق)، AA022448 (تفوق)، و "مدرسة الصيدلة المؤتمر الصومالي الموحد".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
