Summary
Alkohol brug lidelse (AUD) er et stort nationalt sundhedsproblem og udviklingen af mere effektive behandlinger er påkrævet for at udligne behovene hos denne patientgruppe. Herpå udnytter følgende protokol to simple gnaver drikke modeller for at vurdere de prækliniske effekten af anti-alkohol blyforbindelser.
Abstract
Alkohol brug lidelse (AUD) er et stort problem med mere end en anslået 76 millioner mennesker på verdensplan opfylder de diagnostiske kriterier. Nuværende behandlinger er begrænset til tre FDA-godkendt medicin, der er stort set ineffektive, selv når de kombineres med psykosociale intervention, som det fremgår af høje tilbagefald sats. Som sådan, repræsenterer at søge efter mere roman behandlinger et vigtigt folkesundhedsmæssige mål. Herpå følgende protokol udnytter to simple gnaver drikke modeller for at vurdere de prækliniske effekten af anti-alkohol blyforbindelser: to-flaske valg (skal Bekræftes) og drikke i mørke (DID). Den tidligere tillader mus til frivillig drink i moderation mens sidstnævnte inducerer mus til frivillig forbruge en stor mængde alkohol i en kort periode, der efterligner lejlighedsdrikkeri. Den enkle og høj overførselshastighed karakter af begge disse paradigmer giver mulighed for hurtig screening af farmakologiske stoffer eller til at identificere stammer af mus, der udviser visse frivillige drikkevaner.
Introduction
I sidste 25 plus år, betydelig indsats er blevet sat til at udvikle medicin til behandling af alkohol brug lidelse (AUD)1. Selv om mange fremskridt har gjort, AUD er stadig et stort folkesundhedsproblem, der berører mere end 18 millioner amerikanere, og koster over $220 milliarder årligt2,3. I øjeblikket er der kun tre FDA-godkendt medicin, disulfiram, Naltrexon og acamprosate, som alle har givet inkonsistente resultater i kliniske forsøg og begrænset succes selv når kombineret med psykosociale intervention i klinikken-indstillinger 4 , 5 , 6 , 7.
Den primære årsag til svigt af nuværende AUD terapi er knyttet til den heterogene karakter af AUD8. Mens både miljømæssige og genetiske faktorer bidrager til udviklingen af AUD, arveligheden tegner sig for en anslået 50-60% af risikoen for debut9. Svarende til behandling af depression, det er almindeligt accepteret at patienter lider af AUD vil har brug for en bred vifte af medicin, der er skræddersyet til at opfylde behovene hos hver enkelt patient10.
Klart, der er et presserende behov for mere effektive behandlinger, der ville blive fremmet, hvis den allerede vanskelige og tidskrævende proces for drug discovery blev strømlinet3. Med henblik herpå viser følgende protokol prækliniske anvendeligheden af to gnavere drikke modeller almindeligt anvendt til at undersøge det neurobiologiske grundlaget for AUD11. Mere specifikt metoden indført heri kan vurdere effekten af kandidat forbindelser ved at reducere alkohol forbrug i både "moderat" og "binge drinking" scenarier udnytter to-flaske valg (skal Bekræftes) og drikke i de mørke (DID) paradigmer, henholdsvis. Begge paradigmer undersøge ikke-operant ethanol selvforvaltning, hvorved mus indtage ethanol mundtligt og efter behag, og derfor illustrere høj ansigt og konstruere gyldighed som en model af menneskelige alkoholisme11.
I TBC drikke, også kendt som frit valg drikke, præference drikke, eller sociale drikke, er to flasker af løsning kontinuerligt tilgængelige i burene. En flaske indeholder vand, og det andet indeholder en fortyndet opløsning af ethanol, hvorved koncentrationen af ethanol kan varieres (fx., 5-30% v/v)11,12. Musene har konstant adgang til begge flasker, og derfor kan vælge hvor meget at drikke fra hver flaske.
Denne model vurderer ethanol forbruget af hver mus (g/kg), samt ethanol præference ratio (volumen af ethanol, der forbruges ÷ samlede volumen væske indtaget). Det bruges rutinemæssigt til at sammenligne drikke niveauer på tværs af forskellige stammer af mus, eller efter en bestemt genetisk manipulation (fx., gen knockout eller knockdown) og resultater i blod ethanol koncentrationer (BECs) svarer til hvad der er fundet i mennesker når drikke i moderation13,14.
I DID procedure, 3 timer efter starten på den mørke cyklus, udveksles hjem bur flaske vand med en flaske med 20% (v/v) ethanol opløsning for en begrænset adgang drikke session. De drikker sessioner forekomme som en fortløbende 4-dages cyklus, varig 2 h på dage 1-3 og 4 h på dag 4. Dage 1-3 tjene som en alkohol-tilvænning periode før testning på dag 4. Derfor mus pålideligt vil forbruge nok ethanol for at opnå BECs > 100 mg/dL og som følge heraf udviser adfærdsmæssige virkninger af forgiftning fundet i mennesker, der er lejlighedsdrikkeri13,14,15. Vand adgang er tilgængelig på alle tidspunkter end at drikke session.
Der er flere varianter af begrænset adgang til drikkevand. For eksempel i modellen intermitterende adgang modtage mus to flasker (én indeholdende vand og andre indeholdende 20% (v/v) ethanol) kun på mandag, onsdag og fredag 24 h og 48 h tilbageholdelsesperiode på hverdage og weekender, henholdsvis16. Efter flere ugers intermitterende adgang, musene vil gradvist og eskalere frivilligt drikke niveauer, i sidste ende at nå BECS lig hvad er observeret i DID model. DID, men synes at være den mest almindeligt anvendte model til at vurdere binge-lignende drikke adfærd. Findes andre modeller af intermitterende drikke, men de stole på begrænsning af adgang til mad eller dampe kammer induceret stigninger i frivillig selvforvaltning, hvilket gør dem mindre repræsentant for frivillig menneskelige alkohol forbrug16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg af University of Southern California Health Sciences Campus.
1. eksperimentel opsætning og montage
- Erhverve alle de følgende leverancer og kemikalier før starten af undersøgelsen: mus, bure/metal bur toppe, sengetøj, mad, vand, ethanol, pipets, sipper toppe, shrink wrap, hobbykniv, zip bånd, tape, bunsenbrænder, skala, forlygte.
- Hente C57BL/6J mus, enten fra en kommerciel kilde eller en in-house koloni, holde for øje, at mus kan være gruppe til huse indtil tidspunktet for testning.
Bemærk: Det samlede antal mus indkøbes afhænger af kompleksiteten af den eksperimentelle design. Planlæg at rumme ca 12-15 mus pr. gruppe, med pilotundersøgelserne ikke mindre end 5-7 mus pr. gruppe. I de repræsentative resultater vist nedenfor udnyttede vi en simpel to-gruppe set-up for at vurdere den årsag-virkning forhold ved hjælp af en enkelt dosis (5 mg/kg) af stof (MOX). - Følg trinene nedenfor for at samle flasker18.
- Opvarme en hobbykniv, ved hjælp af en bunsenbrænder.
- Brug denne kniv, skåret omkring en tomme fra top og bund ender af en plast 18 mL serologisk pipette.
- Bemærk, at mindre volumen pipets (dvs., 10 mL) også kan bruges til at øge præcisionen af målingen.
- Varm afpipetteres under en varmepistol.
- Indsæt kugleleje sipper tube i "bunden" Årets pipette (med andre ord åbning der er tættest på 18 mL dash-linjen).
- Forsegle sipper røret på plads med shrink wrap ved hjælp af en kommercielt tilgængelig shrink wrap pistol.
- Hætten andre åbningen med en silikone proppen.
2. animalske tilvænning
- Begynder mindst 1 uge før startdatoen for eksperimentet, overføre de mus til det rum, hvor de eksperimentelle procedurer der skal foretages, så de kan vænne til dyrehold betingelser (herunder den omgivende temperatur (21 ± 1 ° C) og 12-h vende lys/mørke cyklus, med lys fra kl. 12.00). Sørg for at følge institutionelle retningslinjer og meddele de relevante kanaler inden du flytter dyr fra én placering til en anden.
- Hvis mus bliver overført fra en standard lys/mørke cyklus tillade 2 uger ekstra tilvænning tid.
- Fyld de nylavede flasker til randen med vand. Kontroller, at fælles landbrugspolitik er lukket forsvarligt og blottet for enhver luftbobler eller utætheder fra tuden. Hvis løsningen er utæt, igen sikre fælles landbrugspolitik. Fjern eventuelle luftbobler ved blot at trykke på flasken så at luften kan undslippe røret.
- Ved ankomsten, enkelt hus hver mus i standard polykarbonat/polysulfone bure med sengetøj og en metal gitter bur top; fjerne bur låget, så det vil ikke længere blive brugt.
- Give adgang til mad og water bottle(s) ad libitum.
- Sikre hver flaske til bur toppen af indpakning en plastik zip slips omkring hver flaske til at holde det på plads. Trim eventuelle overskydende plast fra zip-slips til at sikre, at det ikke rager ind i buret.
Bemærk: Til at drikke i proceduren mørke (DID), kun en enkelt flaske vand er nødvendig. Tilvænning til to flaske valg (skal Bekræftes) paradigme, kræver imidlertid, at buret set-up omfatter to flasker af vand. Hvis metal gitter hopper der er designet til at holde kun en enkelt flaske løsning, forsigtigt bøje fra hinanden sine barer for at skabe plads til en ekstra plade til at rumme den anden flaske for skal Bekræftes.
- Konfigurer mindst 3 mus gratis kontrol bure. Dette vil give mulighed for overvågning af væske tab forårsaget af fordampning eller spild fra flasker, der er simpelthen en naturlig forekomst, der sker som bure er placeret og slukker bur rack (Se trin 2.6.3, 3.6.1 og 4.6.1 for ligninger).
- Begynder på dag 4 af 1-uges enkelt boliger akklimatisering, måle og registrere de daglige krop og mad vægte hver mus, ved hjælp af en skala, (i gram) og vandindtag, ved hjælp af kobberstik sammen med omvendt flasken til at optage det højeste punkt af den menisk (i mL).
- Det er almindelig videnskabelig praksis at læse det laveste punkt af den konkave menisk, da flaskerne forbliver i en inverteret holdning under målingen, optage det højeste punkt af menisken.
- Vurdere parametrene for 2,5 ved hjælp af ligninger nedenfor:
- Måle kroppen vægtændring (g): vægt af aktuelle dag (g) - vægten af foregående dag (g).
- Måle fødeindtagelse (g): vægt af mad på foregående dag (g) - vægt af mad på nuværende dag (g).
- Måle vandindtag (mL): [volumen af vand på nuværende dag (mL) - volumen af vand på foregående dag (mL)] - gennemsnitlige vandtab fra alle kontrol bure (mL).
- Gentag trin 2.5 fortløbende, på dag 5-7, at give mulighed for bestemmelse af en baseline for de tre dage umiddelbart forud for indførelsen af ethanol. Hvis en fortløbende optagelse ikke kan indsamles, forlænge perioden akklimatisering til at tillade evaluering af grundlæggende målinger.
- Når vandindtag har stabiliseret til ± 10% udsving fra gennemsnittet af de sidste 3 dage, Begynd ethanol adgang med enten TBC (ubegrænset adgang) eller DID (begrænset adgang).
Bemærk: I sjældne tilfælde, en til to ekstra dage kan være behov for emner til at nå denne stabilitet; ikke være bange hvis man yderligere tid til værdier at få vist ±10% udsving fra gennemsnittet af de sidste 3 dage.
3. 24-timers to flaske valg (skal Bekræftes)
Bemærk: En skematisk er forberedt i figur 1.
- Forberede en 10% (v/v) ethanol løsning på en 500 mL volumen ved at tilføje 52.65 mL 190 bevis korn ethanol (~ 95% ethanol) til 447.35 mL H2O; Sørg for at ryste grundigt. Eftersom ethanol fordamper hurtigt, skal du erstatte løsningen i hver 3-4 dages interval.
Bemærk: Andre koncentrationer ethanol kan bruges som godt, men forfatterne anbefale en 10% koncentration for denne model. - På den første dag i TBC, (dag 8 tidligst) Tom 1 af de 2 vandflasker i hvert bur, og fylde det til randen med frisk fremstillet ethanol løsning. Ethanol og vand er vanskeligt at skelne visuelt, klart mærke flasker med deres tilsvarende indhold. Simpelthen anvende et stykke masking tape til flasken og mærkning med en markør eller ved at skrive direkte på flasken.
- Tilføj flere løsning til vandflaske, efter behov.
- Placer flasker tilbage i buret, og sørg for, at alle caps er lukket forsvarligt og blottet for enhver luftbobler eller utætheder fra tuden. Hvis løsningen er utæt, igen sikre fælles landbrugspolitik. Fjern eventuelle luftbobler ved blot at trykke på flasken så at luften kan undslippe flasken.
- Suppleant placeringen af flasker hver anden dag som til korrekt for konditioneret sted præference relateret påvirkninger i drikke aktivitet (Se gennemgang for mere).
- Ud over de daglige målinger fra 2.5 og 2.6, som har været i gang, Begynd at læse og optage ethanol indtagelse niveauer så godt. Analysere 10% ethanol indtag og præference forholdet ved hjælp af følgende ligninger:
- Måler 10% Ethanol indtag (mL): [volumen af ethanol på nuværende dag (mL) - volumen af ethanol på foregående dag (mL))]-gennemsnitlige ethanol tab fra alle kontrol bure (mL).
- Måler 10% Ethanol indtag (g/kg): [10% ethanol indtag (mL) x 0.07893 g/mL] / body vægt (kg).
- Måle præference %: [10% Ethanol indtag (mL) / vand (mL)] x 100.
- Så snart ethanol indtag er blevet stabile, administrere en enkelt kontrol (saltvand) intraperitoneal (i.p.) injektion (0,01 mL/g kropsvægt) til hver mus under den daglige måling rutine. På denne måde blevet fag vant til injektion, selv.
- Stabilitet er defineret som ± 10% udsving fra gennemsnittet af de sidste 3 dage, (samme som i afsnit 2.8).
Bemærk: Det kan tage op til 1 uge for ethanol niveauer til at stabilisere. Dette gælder især, hvis mus bruges igen fra et tidligere eksperiment og har haft tidligere eksponering for ethanol. Kontrollen er simpelthen opløsningsmidlet anvendes til at opløse stoffet.
- Stabilitet er defineret som ± 10% udsving fra gennemsnittet af de sidste 3 dage, (samme som i afsnit 2.8).
- Når en ethanol baseline med lav variabilitet er genoprettet, opdele musene i dosering gennemsnitlige grupper ved hjælp af ethanol indtag værdier, således at alle grupper har nogenlunde samme ethanol indtag værdier.
- Udpege en gruppe som kontrolelementet (fortsætter med at modtage saltvand) og den anden som den eksperimentelle (i.p. injektion af det undersøgte lægemiddel på 0,01 mL/g kropsvægt). Begynde daglige medicin dosering, enten akut eller multi-dages varighed. Efterfølgende kan kontrol blive genindsat til at teste efter narkotika effekter (valgfrit).
Bemærk: Fordi drikke overvåges over en lang periode, 24-h, tidspunktet for dosering administration er ikke afhængig af den mørke cyklus.
- Udpege en gruppe som kontrolelementet (fortsætter med at modtage saltvand) og den anden som den eksperimentelle (i.p. injektion af det undersøgte lægemiddel på 0,01 mL/g kropsvægt). Begynde daglige medicin dosering, enten akut eller multi-dages varighed. Efterfølgende kan kontrol blive genindsat til at teste efter narkotika effekter (valgfrit).
4. drikke i mørke (gjorde)
Bemærk: En skematisk er forberedt i figur 3.
- Hver dag i planlagte ethanol adgang (dage 1-4) optage målinger for vandmængden og fødeindtagelse kropsvægt, og udføre stof dosering. Gøre dette under en forudvalgt tidspunkt under den lys cyklus, der er udvalgt i henhold til farmakokinetik af narkotika, så stoffet er på / eller nærmer sig den maksimale hjerne koncentration drikke i perioden.
Bemærk: Husk dage 1-3 er beregnet til blot acclimate mus at drikke rigelige niveauer af ethanol i en kort periode. Mens mus ikke når BEC niveauer svarende til den menneskelige 0,08; disse "uddannelsesdage" sikre, at dag 4, under den lidt længere drikke session, vil de faktisk drikke til dette niveau.- Give alle mus kontrol (saltvand) på dage 1-3, og hverken kontrol eller narkotika på dag 4. Denne DID procedure sker over span 3 uger til at omfatte en pre stof (uge 1), narkotika (uge 2), og efter narkotika (uge 4) drikke session.
- Bemærk: Bemærk, at i løbet af narkotika-dosering ugen, dag 3 ethanol indtagelse niveauer bruges til at tildele mus til enten gruppen kontrol eller stof på en måde, hvor ethanol indtagelse niveauer af begge grupper har den mindste variation. Dette er i modsætning til TBC, som tildeler grupper baseret på en 3 dages gennemsnit.
- Forbered en 20% (v/v) ethanol opløsning (20E) på en 500 mL volumen ved at tilføje 105.25 mL 190 bevis korn ethanol (~ 95% ethanol) til 394.75 mL H2O; Sørg for at ryste grundigt.
- Fyld ethanol flasker inden begyndelsen af den drikke session, så snart DID begynder vandflasker simpelthen kan erstattes med alkohol flasker.
- Under hele DID sessionen (trin 4,5-4,8), bruge en red-light forlygte, ikke forstyrre dyr.
- I starten af DID drikke session, planlagt til at begynde 3 timer i mørke cyklus, optage mængden vand for hver mus. Derefter erstatte hver vandflaske med en flaske af 20E løsningen og optage den starter ethanol volumen.
- Læse og optage den endelige ethanol bind 2 timer senere, i slutningen af drikke-session på dage 1-3 og 4 timer senere på dag 4. Analysere den 20% ethanol indtagelse ved hjælp af følgende ligninger.
- Måle 20% Ethanol indtag (mL): [bind af ethanol i slutningen af drikke session (mL) - volumen af ethanol i begyndelsen af drikke session (mL)] - gennemsnitlige ethanol tab fra alle kontrol bure (mL).
- Måle 20% Ethanol indtag (g/kg): [20% Ethanol indtag (mL) x 0.15786 g/mL] / body vægt (kg).
- På dag 4 kun, straks efter optagelse ethanol diskenheder, og før der igen indføres adgang til vand, indsamle blod for at vurdere blod ethanol koncentrationen af hver musen (valgfrit).
Bemærk: Enhver ikke-terminal blod samling metode kan anvendes, såsom retro-orbital sinus blod samling eller saphenous vene blod samling. Nyttige protokoller finder du henvisninger til Grethe et al. 21 og Yardley et al. 20.- Udføre analyse ved hjælp af forskellige metoder, herunder LCMS eller kommercielt tilgængelige maskiner (Se Tabel af materialer).
- Erstatte alle ethanol flasker med vand flasker og optage vandmængde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I de følgende repræsentative undersøgelser, var sociale drikke modelleret ved hjælp af to-flaske valg (skal Bekræftes) paradigme. Kort havde mus adgang til to flasker af løsning, hvoraf den ene indeholdt vand, og den anden en 10% (v/v) ethanol opløsning. Emner blev senere opdelt og jævnt tildelt drug behandlingsgrupper, moxidectin (MOX) vs saltvand kontrol, således at hver gruppe ville har i gennemsnit ethanol indtagelse niveauer med et minimum af variation.
Indledende baseline 10E indtag periode 24-h stabiliseret ved 14.46 ± 1.85 g/kg (n = 8) før injektioner begyndte, og efterfølgende re stabiliseret ved 14,14 g/kg post saltvand indsprøjtninger. For at vurdere virkningerne af en akut dosis (5 mg/kg) af MOX på ethanol indtag og præference, blev drikke aktivitet vurderet før MOX, MOX og post MOX. Vi fandt, at en enkelt dosis af MOX betydeligt reduceret indtagelse af alkohol over 45%, sammenlignet med pre MOX injektioner [F (2, 22) = 26.33, p < 0,0001] (fig. 2A), og præference [F (2, 14) = 17.35, p < 0,0001] (figur 2B ) over 30%. 10e indtag og præference forblev væsentligt lavere end saltvand dagen umiddelbart efter MOX behandling (med mere end 25%, og 15% henholdsvis) vist som post MOX injektioner i figur 2).
I et upubliceret pilotundersøgelse, var kraftigt lejlighedsdrikkeri modelleret ved hjælp af drikke i proceduren mørke (DID) hvorved mus havde dagligt begrænset adgang (2 h) til en flaske der indeholder 20E begyndelsen 3-Hansen ind i døgnrytmen mørke fase, i 3 dage i træk, med en længere adgang periode (4 h) på dag 4 (figur 4). Hunmus (n = 12, 6 mus/gruppe) blev administreret saltvand indsprøjtninger (i.p.) på dage 1-4 med baseline 20E etableret på dag 4 (pre stof). På dage 1-3 i de 2nd ugentligt cyklus, alle mus har modtaget endnu en daglig saltvand injektion. Ethanol indtag værdier fra dag 3 blev derefter brugt til at opdele musene i to grupper (n = 6 / gruppe), modtog efterfølgende enten én injektion (i.p.) af MOX (5 mg/kg) eller saltvand på dag 4 (stof). Den følgende uge alle mus modtaget daglige saltvand indsprøjtninger dage 1-4 og ethanol indtagelse blev målt endnu en gang på dag 4 (post stof). Akut administration af 5 mg/kg MOX blev analyseret og fundet at betydeligt reduceret alkoholindtag mere end 54%, sammenlignet med før Drug injektioner (t = 7.635, p < 0,0001)
Figur 1 . To-flaske valg skematiskvenligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . To flaske valg (skal Bekræftes). MOX (5 mg/kg) mindsker 10% v/v ethanol (10E) indtagelse (A) og præference (B) i C57BL/6J hunmus ved hjælp af en 24-h access to-flaske choice paradigme. Efter at nå stabilt drikke niveauer i 3 dage i træk, blev MOX administreret. Søjler repræsenterer gennemsnitlige 10E indtagelse niveauer fra dagen før MOX injektion (hvid; Pre MOX), dag i MOX injektion (sort; MOX) og dagen efter MOX injektion (grå; Post MOX). Værdierne repræsenterer de gennemsnit ± SEM til 12 mus. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, og *** P < 0,0001 versus Pre MOX (længst til venstre vandret streg) eller Post MOX (længst til højre vandret streg), Tukey's flere sammenligning post-hoc test. Ændret fra Huynh N. mfl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Drikke i den mørke skematiskvenligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Drikke i mørke (gjorde). MOX (5 mg/kg) mindsker 20% v/v ethanol (20E) indtagelse i C57BL/6J hunmus ved hjælp af en drikke i den mørke paradigme. Søjler repræsenterer gennemsnitlige 20E indtagelse niveauer på uge før MOX injektion (pre stof), uge af MOX injektion (lægemiddel) og uge efter MOX injektion (efter narkotika). Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM til 12 mus (6/gruppe) mellem saltvand og MOX grupper. P < 0,0001 versus pre stof (længst til venstre vandret streg) eller efter narkotika (længst til højre vandret streg), Tukey's flere sammenligning post-hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verdensomspændende estimater indikerer, at så mange som 76 millioner mennesker opfylder kriterierne for at berettige en diagnose for alkohol brug lidelse (AUD). Desværre, i øjeblikket farmaceutiske behandlinger er stort set ineffektive og videre udvikling er nødvendigt for at udligne denne kliniske befolkning20behov. Herpå følgende protokol har til formål at lette denne bestræbelse af et eksempel på to af de mest grundlæggende gnaver drikke paradigmer: to-flaske-valg (skal Bekræftes) og drikke i mørke (DID). Begge modeller måle ikke-operant selvforvaltning af ethanol, hvorved mus indtage ethanol mundtligt. I TBC paradigme, ethanol (10% v/v) og vand er begge tilgængelige kontinuerligt, hvilket resulterer i tilsvarende lav blodets ethanol indhold, der er en konsekvens af en episodisk og gradvis ethanol forbrugsmønster. Denne model er bedst til at vurdere lavere niveauer af ethanol indtag som en præference tastant og derfor siges at være ligner menneskelige "moderat" drikke. Figur 2 ovenfor viser repræsentative resultater for TBC paradigme.
På den anden side i DID er model ethanol (20% v/v) kun tilgængelig i et begrænset tidsrum. I modsætning til TBC vurderer denne model virkninger af et stof på behaviorally relevante koncentrationer ethanol, drage fordel af det faktum, at C57BL/6J mus vil indtager store mængder af ethanol meget hurtigt i den mest aktive fase af deres døgnrytmen cyklus. Disse drikke sessioner forekomme i 4 dage i træk, begynder på de 3rd h ind i den mørke cyklus med en varighed af 2 timer på dage 1-3 og 4 h på dag 4. Brug denne procedure, mus typisk forbruge nok ethanol for at opnå BECs > 100 mg/dL og udviser adfærdsmæssige tegn på forgiftning. Vores repræsentative resultater for DID paradigme er vist i figur 4. Selv om vi ikke måle BECs for disse mus, er deres drikke niveauer magen til dem, der indberettes i den litteratur, der opnåede BECs over 100 mg/dL13,14,15.
Begge paradigmer har begrænsninger. I tilfælde når mundtlige gavages er den foretrukne metode til administration af farmakologisk testning af blyforbindelser, kan esophogeal traumer som følge af proceduren, der hindre ethanol selvforvaltning i begge paradigmer. Dette gælder især for DID model, som bruger en højere koncentration af ethanol (20%) og der findes tilfælde hvor farmakokinetik af lægemidlet kræver de drikke session at begynde før dyrene måtte have tilstrækkelig tid til at inddrive fra den procedure. Dette vil fremgå i en kontrolgruppe, drikke på niveauer, der svarer til BECs godt under den forventede 0,08. I vores laboratorium, har vi oplevet problemer med kraft fodringer både med DID og skal Bekræftes. Vi var i stand til at løse disse problemer ved at formulere vores forbindelser, således at de kunne sendes ved hjælp af et mundtligt opløsende tynde strimler (ODS)19.
Desuden, i DID model specifikt, betragtning af, at ethanol Adgangsperioden er så korte varighed, drug dosering skal ske under en forudvalgt tidspunkt under den lys cyklus, der er valgt i henhold til farmakokinetik af stoffet så det sammensatte er på / eller nærmer sig den maksimale hjerne koncentration drikke i perioden. Hvis en farmakokinetiske analyse ikke kan udføres, ville en alternativ fremgangsmåde være at foretage en gang kursus vurdering af adfærdsmæssige virkninger af stoffet ved hjælp af TBC. Efter denne logik, ved overvågning af drikke aktivitet på timebasis, og fastlægge peak anti-alkohol effekter, man kunne med rimelighed strategize når narkotika bør være administreret19.
Mens inden for alkoholisme har forskellige dyremodeller for at undersøge de forskellige fysiologiske og adfærdsmæssige aspekter af AUD8, beskriver følgende protokol to almindeligt anvendte paradigmer, som muliggør sammenligninger af resultater på tværs af laboratorier. En anden fordel er, at disse metoder er ligetil, gør brugen praktisk under akut og kronisk undersøgelser svarende til eksemplerne ovenfor. Desuden, i modsætning til andre almindeligt anvendte alkohol paradigmer, som operant conditioning og vapor afdeling paradigmer, kan den metode, vi har beskrevet her udføres uden behov for specielle udstyr. Anekdotisk, er det sandsynligt, at næsten alle komponenter af drikke apparatet kan findes i en prototypiske institutionelle vivarium. Der er også forskellige måder at ændre de protokoller, der beskrives her, så de bedst passer målene for hvert forsøg. Eksempelvis er vores DID procedure bedst til at teste de akutte virkninger af et stof på en enkelt drikke session (i dag dag 4). Vi har dog vist, at multi-dages drug dosering kan vurderes ved at forstærke de drikker sessioner til 4 dage i træk af 2 timers adgang, i modsætning til de nuværende 2 timer af adgang på 1-3 og -4 timer på dag 419. Mus kan også overføres fra et paradigme til en anden, eller re-testet for supplerende doser / forskellige forbindelser, med en simpel 1-2 ugers udvaskning periode i mellem.
Det bør nævnes, at narkotika-induceret ændringer i drikke observeret gennem disse metoder skal undersøges grundigt for at afgøre, om virkningerne er selektiv for alkohol eller hvis de kunne være resultatet af toksicitet. Yderligere oplysninger om kontrolelementer henvises læseren til Yardley mfl. 20 ingen enkelt paradigme kan model alle aspekter af denne betingelse. I stedet undersøger hver paradigme typisk nogle af nøgle-attributter tilknyttet AUD. Skal Bekræftes og DID modeller beskrevet her, har været knyttet til stadiet binge/forgiftning af afhængighed cyklus. For en mere grundig forståelse af nytten af sammensat, bør flere prækliniske drikke modeller udnyttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DLD og LA er opfindere om et patent for nyorientering af ivermectin og relaterede avermectins til behandling af alkohol-lidelser. Forfatterne har ingen andre interessekonflikter og er fuldt ud ansvarlig for det videnskabelige indhold af papiret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet, en del af forskning tilskud SC CTSI NIH/NCRR/NCATS - UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) og USC School af apoteket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
