Summary
הפרעה לשימוש באלכוהול (AUD) היא בעיה בריאותית לאומית גדולה ונדרש ההתפתחות של טיפולים יעילים יותר כדי לקזז את הצרכים של האוכלוסייה המטופלת הזו. לשם כך, הפרוטוקול הבא מנצל שני דגמים שתייה פשוטה מכרסמים כדי להעריך את היעילות פרה של תרכובות נגד אלכוהול עופרת.
Abstract
הפרעה לשימוש באלכוהול (AUD) היא בעיה רצינית עם יותר מאשר מיליון 76 המשוערת אנשים ברחבי העולם להכיר את הקריטריונים לאבחון. טיפולים שוטפים מוגבלות שלוש תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA כי הם במידה רבה יעיל גם כאשר בשילוב עם פסיכו-סוציאלי התערבות, כפי שניתן לראות בתרשים על-ידי הגבוה נסיגה קצב. ככזה, החיפוש אחר טיפולים חדשניים יותר מייצג יעד חשוב לבריאות הציבור. לשם כך, הפרוטוקול הבא מנצל שני דגמים שתייה פשוטה מכרסמים כדי להעריך את היעילות פרה של עופרת נגד אלכוהול תרכובות: בקבוק שני הבחירה (TBC) ושותים בחושך (DID). לשעבר מאפשר עכברים מרצון לשתות במתינות בזמן האחרון גורם עכברים מרצון לצרוך כמות גדולה של אלכוהול תוך תקופה קצרה המחקה שתייה מופרזת. מהות תפוקה גבוהה ופשוט שתי פרדיגמות אלה מאפשרות להקרנה מהירה של סוכנים תרופתי או לזיהוי זני עכברים שהפגינו התנהגות מסוימים שתייה מרצון.
Introduction
האחרונות 25 פלוס שנים, כבר הכניסו מאמץ משמעותי בפיתוח תרופות לטיפול של הפרעה לשימוש באלכוהול (AUD)1. למרות ההתקדמות הרבה נעשו, AUD עדיין נשאר בעיה מרכזית בבריאות הציבור, משפיע על יותר מ-18 מיליון אמריקאים, עולה מעל 220 מיליארד דולר מדי שנה2,3. כיום ישנם רק שלושה תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA disulfiram, נלוקסן, acamprosate, אשר הניבו תוצאות לא עקביות ניסויים קליניים, הצלחה מוגבלת גם כאשר בשילוב עם התערבות פסיכו-סוציאלי בהגדרות של המרפאה 4 , 5 , 6 , 7.
הסיבות העיקריות על הכישלונות של הטיפול AUD הנוכחי הוא מקושר אל הטבע heterogenous של AUD8. בעוד גורמים סביבתיים והן גנטיים תורמים להתפתחות של AUD, תורשתיות חשבונות עבור % 50-60 המשוערת של הסיכון של תחילת9. בדומה לטיפול בדיכאון, מקובל כי חולים הסובלים AUD צריך מגוון רחב של תרופות המותאמים לצרכים של כל מטופל10.
ברור, יש צורך דחוף טיפולים יעילים יותר פוריה אם התהליך כבר זמן רב מפרכות של גילוי תרופות היו יעילים3. למטרה זו, הפרוטוקול הבא מדגים את הישימות פרה של שני דגמים שתייה מכרסמים בשימוש נרחב לבחינת בסיס הנוירוביולוגי של AUD11. ליתר דיוק, השיטה הציג בזאת יכול להעריך את היעילות של המועמד תרכובות אלכוהול להפחתת צריכת "מתון" והן "אוכלת שותה" תרחישים ניצול הבחירה בקבוק שני (TBC) ושותים בתוך הפארדיגמות (DID) כהה, בהתאמה. שתי פרדיגמות לבחון ניהול עצמי שאינו operant אתנול, לפיה עכברים להבלע אתנול והן בעל-פה, בשעה, לכן להמחיש את הפנים גבוה ולבנות תוקפו כמודל של אלכוהוליזם האנושי11.
TBC לשתות, הידוע גם בשם הבחירה החופשית לשתות, העדפה לשתייה, או שתיה, שני בקבוקים של פתרון זמינים ללא הרף בכלוב בבית. בקבוק אחד מכילה מים, השני מכיל בתמיסה מדוללת של אתנול, לפיה יכולים להיות מגוונים את הריכוז של אתנול (למשל., 5-30% v/v)11,12. העכברים יש גישה מתמדת כדי שני הבקבוקים, לכן, באפשרותך לבחור כמה שותים מבקבוק בכל.
מודל זה מעריך בצריכת האתנול בכל עכבר (g/kg), כמו גם יחס העדפה של אתנול (נפח של האתנול צורכים ÷ הנפח הכולל הנוזלים הנצרכת). הוא משמש באופן שגרתי כדי להשוות בין רמות שתייה על פני זנים שונים של עכברים, או לאחר מניפולציה גנטית ספציפית (למשל., נוקאאוט גנטי או נוקאאוט) ותוצאות בריכוזים בדם אתנול (בקס) הדומה מה נמצא אצל בני אדם כאשר לשתות במתינות13,14.
בהליך DID, 3 שעות לאחר תחילת מחזור כהה, הביתה כלוב בקבוק מים מוחלף עם בקבוק של 20% (v/v) אתנול פתרון עבור גישה מוגבלת שותה הפעלה. ההפעלות שתייה להתרחש מחזור 4 ימים רצופים, שנמשך 2 h ב- 1-3 ימים, 4 שעות ביום 4. ימים 1-3 משמשים תקופה אלכוהול-habituation לפני הבדיקה ביום 4. כתוצאה מכך, עכברים יצרוך באופן אמין אתנול מספיק כדי להשיג בקס > 100 מ"ג/ד"ל, כתוצאה מכך, שהפגינו את השפעות התנהגותיות שיכרון נמצאו שבני אדם הם מוגזמת שתייה13,14,15. גישה מים זמינה בכל עת מלבד המפגש שתייה.
ישנם מספר וריאציות של גישה מוגבלת שתייה. לדוגמה, במודל הגישה לסירוגין, עכברים מקבלים שני בקבוקים (מים המכילים אחד, המכיל האתנול 20% (v/v) אחרים) רק בשני, רביעי, שישי עם תקופה של 24 שעות ביממה ו- 48 h נסיגה בימי חול, בסופי שבוע, בהתאמה16. לאחר מספר שבועות של access לסירוגין, העכברים בהדרגה, בהתנדבות להסלים שותה רמות, בסופו של דבר להגיע בקס הדומה תצפית במודל DID. DID, עם זאת, נראה כי המודל הנפוץ ביותר להערכת התנהגות שתייה מוגזמת.. קיימים דגמים אחרים של שתייה לסירוגין, אבל הם מסתמכים על הגבלת גישה למזון או אדים קאמרית המושרה העלאות ניהול עצמי מרצון, מה שהופך אותם פחות נציג של צריכת אלכוהול האנושי מרצון16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות של הקמפוס למדעי הבריאות באוניברסיטת דרום קליפורניה.
1. ניסיוני התקנה והרכבה
- לרכוש את כל הכימיקלים לפני תחילת המחקר והציוד הבאים: עכברים, צמרות כלוב כלובים/מתכת, כלי מיטה, מזון, מים, אתנול, pipets, sipper צמרות, לכווץ גלישת, השירות הסכין, zip קשרים, קלטת, מבער בונזן, קנה מידה, קדמי.
- להשיג C57BL/6J עכברים, מקור מסחרי או של המושבה ללא צורך במיקור חוץ, נזכור כי עכברים יכול להיות קבוצה שוכן עד הזמן של בדיקות.
הערה: המספר הכולל של עכברים רכש תלוי במורכבות של הנבחנים. תכנית כדי להכיל בערך 12-15 עכברים לכל קבוצה, עם לימודי טייס לא קטן מ- 5-7 עכברים לכל קבוצה. בתוצאות נציג המוצג להלן אנחנו מנוצל מלכודת שתי קבוצות פשוטה כדי להעריך את יחסי סיבה-תוצאה באמצעות מנה אחת (5 מ"ג/ק"ג) של התרופה (MOX). - בצע את השלבים שלהלן כדי להרכיב את הבקבוקים18.
- לחמם סכין יפנית באמצעות מבער בונזן.
- בעזרת הסכין, חותכים בערך סנטימטר את קצוות עליונים ותחתונים pipet סרולוגית mL 18 פלסטיק.
- שימו לב pipets נפח קטן יותר (קרי, 10 מ ל) יכול לשמש גם כדי להגביר את הדיוק של המדידה.
- לחמם את pipet תחת אקדח חום.
- הכנס את הצינור sipper מיסב כדורי בסוף "התחתון" pipet (במילים אחרות, הפתח הקרוב לקו מפריד מ ל 18).
- חותם את הצינור sipper במקום עם עטיפות באמצעות אקדח גלישת הפסיכיאטר זמין מסחרית.
- מכסה את הפתח השני עם פקק סיליקון.
2. Habituation בעלי חיים
- החל לפחות שבוע אחד לפני תאריך ההתחלה של הניסוי, להעביר החדר איפה ההליכים ניסיוני יבוצע כך הם עשויים להתאקלם לתנאי גידול (כולל טמפרטורת הסביבה (21 ± 1 ° C) ו 12-h העכברים הפוך מחזור/כהה, עם האורות בשעה 12:00 בצהריים). הקפד ההנחיות מוסדיים והודע הערוצים המקובלים לפני העברת בעלי חיים ממיקום אחד למשנהו.
- אם עכברים הנך מועבר מתוך מחזור/כהה סטנדרטיים לאפשר 2 שבועות של זמן habituation נוספים.
- ממלאים את הבקבוקים תוצרת לאחרונה עד הקצה, לזכותו מים. ודא כי הכיפה סגורה היטב, ללא כל בועות האוויר או דליפות פיית. אם הפתרון דולף, מחדש לאבטח את הכובע. הסר כל בועות אוויר על-ידי הקשה על הבקבוק פשוט כך שהאוויר יצא הצינור.
- עם ההגעה, בית בודד בכל עכבר בכלובים פוליקרבונט רגיל/פוליסולפון עם מצעים וחזייה כלוב רשת מתכת; הסר את המכסה את הכלוב היא כבר לא תהיה בשימוש.
- לספק גישה water bottle(s) ואוכל ad libitum.
- לאבטח כל בקבוק לראש הכלוב על ידי ליפוף עניבה zip פלסטיק מסביב כל בקבוק כדי להחזיקו במקום. חתוך כל פלסטיק עודף של העניבה zip כדי להבטיח כי זה לא לבלוט לתוך הכלוב.
הערה: עבור השתייה במסגרת ההליך (DID) כהה, רק בקבוק אחד של מים נדרש. Habituation על הדוגמא הבחירה (TBC) בקבוק שני, עם זאת, דורשת כי הסידור כלוב כוללים שני בקבוקי מים. אם תעשי את רשת מתכת הניתנים מיועד להחזיק רק בקבוק אחד של פתרון, כופפו בעדינות לגזרים ברים שלה כדי ליצור שטח על צלחת נוספת על מנת לתאם את הבקבוק השני TBC.
- להגדיר לפחות 3 כלובים חינם שליטה בעכבר. זה יאפשר בקרה של אובדן נוזלים נגרמת על ידי אידוי או זליגת מן הבקבוקים, וזה פשוט תופעה טבעית זה קורה כמו הכלובים מוצבים המדף כלוב לסירוגין (ראה שלב 2.6.3 3.6.1, 4.6.1 עבור משוואות).
- החל ביום 4 של בעזיבה דיור אחת שבוע אחד, למדוד ולהקליט המשקולות הגוף ומזון היומי של כל עכבר, באמצעות סרגל, (בגרמים) כמו גם צריכת המים, באמצעות שפותח לצד הבקבוק הפוך כדי להקליט את הנקודה הגבוהה ביותר מניסקוס (ב מ ל).
- אמנם זה מדעי מנהג לקרוא את הנקודה הנמוכה ביותר מניסקוס קעורה, מכיוון הבקבוקים נשארים במצב הפוך במהלך המדידה, לתעד את הנקודה הגבוהה ביותר מניסקוס.
- להעריך את הפרמטרים של 2.5 באמצעות המשוואות הבאות:
- למדוד את השינוי במשקל הגוף (g): משקל של היום הנוכחי (g) - משקל של היום הקודם (g).
- למדוד את צריכת המזון (g): המשקל של מזון ביום הקודם (g) - משקל של מזון ביום הנוכחי (g).
- למדוד את צריכת המים (מ"ל): [נפח המים ביום הנוכחי (mL) - נפח המים ביום הקודם (mL)] - אובדן מים ממוצעת של שליטה כל הכלובים (מ"ל).
- חזור על שלב 2.5 ברציפות, על ימים 5-7, כדי לאפשר את קביעת תוכנית בסיסית בשלושת הימים מייד לפני כניסתה של אתנול. אם אין אפשרות לאסוף הקלטה רצופים, להאריך את תקופת להתאקלמות כדי לאפשר הערכת למדידות בסיסית.
- לאחר צריכת המים התייצב על השתנות ± 10% מן הממוצע של בשלושת הימים האחרונים, להתחיל אתנול גישה עם TBC (גישה ללא הגבלה) או DID (גישה מוגבלת).
הערה: בהזדמנות נדירה, 1-2 ימים נוספים עשוי להיות נחוץ עבור נושאים להשיג יציבות זו; אל תבהל אם זמן נוסף נדרש עבור הערכים להציג ±10 השתנות % מן הממוצע של בשלושת הימים האחרונים.
3. הפועל 24 שעות ביממה שני בקבוקים הבחירה (TBC)
הערה: שרטוט מוכן באיור1.
- הכינו 10% (v/v) אתנול הפתרון בווליום 500 מ"ל על-ידי הוספת 52.65 מ של תבואה הוכחה 190 אתנול (~ 95% אתנול) מ 447.35 ל H2O; הקפד ללחוץ ביסודיות. בהתחשב בכך אתנול מתאדה במהירות, החלף את הפתרון במרווח של כל יום 3-4.
הערה: אחרים ריכוזי אתנול יכול לשמש גם כן, אך המחברים ממליצים בריכוז 10% עבור דגם זה. - ביום הראשון של TBC, (יום 8 לכל המוקדם) לרוקן 1 מתוך 2 בקבוקי מים, בכלוב כל, ולמלא אותו עד הקצה, לזכותו הפתרון אתנול המוכנים באופן טרי. בהתחשב בכך אתנול וביו -מים שקשה להיות מכובד באופן חזותי, בבירור תווית הבקבוקים עם התוכן המתאימים שלהם. פשוט להחיל חתיכה של מיסוך קלטת של הבקבוק ולקרוא לה עם סמן או על-ידי כתיבה ישירות על הבקבוק.
- להוסיף עוד פתרון של הבקבוק מים, לפי הצורך.
- למקם בקבוקים על הכלוב, לוודא כי כל בקבוקים סגורים בצורה מאובטחת ונטול כל בועות האוויר או דליפות פיית. אם הפתרון דולף, מחדש לאבטח את הכובע. הסר כל בועות אוויר על-ידי הקשה על הבקבוק פשוט כך שהאוויר יכול לברוח את הבקבוק.
- חלופי המיקום של הבקבוקים בכל יום נוספים כמו ל נכונות עבור המקום ממוזגים העדפה הקשורים השפעות בשתייה פעילות (למידע נוסף, ראו דיון ).
- בנוסף המדידות היומי של 2.5 ו- 2.6, אשר כבר מתמשך, להתחיל לקרוא ולהקליט אתנול צריכת רמות גם כן. לנתח של 10% אתנול צריכת והעדפה יחס באמצעות המשוואות הבאות:
- למדוד את 10% אתנול צריכת (מ"ל): [נפח של אתנול ביום הנוכחי (mL) - נפח של אתנול ביום הקודם (mL))]-ממוצע של אתנול אובדן מן שליטה כל הכלובים (מ"ל).
- למדוד את 10% אתנול צריכת (g/ק ג): [10% אתנול צריכת (mL) x 0.07893 g/mL] לגוף משקל (ק ג).
- למדוד את % העדפה: [10% אתנול צריכת (mL) / מים (mL)] x 100.
- ברגע אתנול צריכת הפך יציב, לנהל זריקה (saline) בקרום הבטן (i.p.) שליטה יחיד (0.01 מ ל/g של משקל הגוף) כל העכבר במהלך השגרה היומית מדידה. בדרך זו, נושאים התרגלו הזריקה עצמה.
- יציבות מוגדר השתנות ± 10% מן הממוצע של בשלושת הימים האחרונים (כמו בסעיף 2.8).
הערה: זה יכול לקחת עד שבוע 1 עבור אתנול רמות לייצב. זה נכון במיוחד אם עכברים נעשה שימוש מחדש של ניסוי הקודם, וגם היה לי חשיפה קודמת אתנול. הפקד הוא פשוט הממס להשתמש כדי להמיס את התרופה.
- יציבות מוגדר השתנות ± 10% מן הממוצע של בשלושת הימים האחרונים (כמו בסעיף 2.8).
- ברגע אתנול בסיסית עם השתנות נמוך נוצרת מחדש, לפצל את העכברים מינון קבוצות באמצעות ערכי צריכת אתנול כך כל הקבוצות יהיה בערך דומה ממוצע ערכי צריכת אתנול.
- קבוצה אחת תייעד הפקד (שתמשיך לקבל תמיסת מלח) ואת הצד השני כ ניסיוני (i.p. הזרקה של הסם ובדוקים ב 0.01 מ ל/g של משקל הגוף). מתחילים יומי סמים מינון, גם עבור משך חריפה או הנמשך מספר ימים. לאחר מכן, הפקד יכול להיות יוצג מחדש כדי לבחון את ההשפעה שלאחר סמים (אופציונלי).
הערה: בגלל שתייה מתבצע פיקוח על פני תקופה ארוכה 24 שעות ביממה, הזמן המינון המינהל אינו תלוי מחזור כהה.
- קבוצה אחת תייעד הפקד (שתמשיך לקבל תמיסת מלח) ואת הצד השני כ ניסיוני (i.p. הזרקה של הסם ובדוקים ב 0.01 מ ל/g של משקל הגוף). מתחילים יומי סמים מינון, גם עבור משך חריפה או הנמשך מספר ימים. לאחר מכן, הפקד יכול להיות יוצג מחדש כדי לבחון את ההשפעה שלאחר סמים (אופציונלי).
4. לשתות בחושך (עשו)
הערה: שרטוט מוכן באיור3.
- בכל יום של אתנול מתוזמנת גישה (ימים 1-4) להקליט את המידות, עוצמת המים, צריכת המזון של משקל הגוף, ולבצע מינון התרופה. לעשות את זה בזמן שנבחרו מראש במהלך מחזור אור זה נבחר בהתאם פרמקוקינטיקה של הסם כך המתחם הוא ב / או מתקרב הריכוז המרבי המוח במהלך תקופת שתייה.
הערה: זוכר ימים 1-3 נועדו להסתגלות פשוט העכברים שתייה רמות שופע של אתנול בתקופה קצרה של זמן. בעוד עכברים ואינם מגיעים BEC רמות דומות 0.08 האנושי; בימים אלה "הדרכה" להבטיח כי ביום 4, במהלך הפגישה מעט יותר שתייה, הם למעשה אשתה לרמה הזאת.- לתת כל העכברים הפקד (saline) על ימים 1-3, ועל שליטה או סמים ביום 4. הליך זה עשה מתרחשת על פני טווח של 3 שבועות כדי לכלול תרופה מראש (שבוע 1), סמים (לשבוע שבין 2), והבחורים. שתינו שלאחר סמים (שבוע 4).
- הערה: שימו לב כי במהלך השבוע מינון התרופה, יום 3 אתנול צריכת רמות משמשים כדי להקצות גם עכברים הקבוצה פקד או סמים באופן שבו רמות צריכת אתנול בשתי הקבוצות יש ההשתנות לפחות. . זה לא דומה לשום TBC, המקצה קבוצות בהתבסס על ממוצע 3 יום.
- להכין פתרון אתנול 20% (v/v) (20E) נפח 500 מ"ל על-ידי הוספת 105.25 מ של תבואה הוכחה 190 אתנול (~ 95% אתנול) מ 394.75 ל H2O; הקפד ללחוץ ביסודיות.
- ממלאים את הבקבוקים אתנול לפני תחילת ההפעלה שתייה כך ברגע DID מתחילה בקבוקי מים פשוט ניתן להחליף עם הבקבוקים אלכוהול.
- במהלך כל DID ההפעלה (שלבים 4.5-4.8), להשתמש מפנס קדמי האורות האדומים כדי לא להפריע את החיות.
- בתחילתו של DID שותה הפעלה, יערך 3 שעות לתוך מחזור כהה, לתעד את נפח המים עבור כל עכבר. לאחר מכן, להחליף כל בקבוק מים עם בקבוק של הפתרון 20E ולהקליט האחסון אתנול ההתחלתי.
- לקרוא, להקליט את אמצעי האחסון אתנול הסופי 2 שעות מאוחר יותר, בסוף הפגישה שתייה בימים 1-3 ו- 4 שעות מאוחר יותר באותו יום 4. לנתח את צריכת 20% אתנול באמצעות המשוואות הבאות.
- למדוד את 20% אתנול צריכת (מ"ל): [נפח של אתנול בסוף שותה הפעלה (mL) - נפח של אתנול בהתחלה של שתייה הפעלה (mL)] - אובדן אתנול הממוצע של שליטה כל הכלובים (מ"ל).
- למדוד את 20% אתנול צריכת (g/ק ג): [20% אתנול צריכת (mL) x 0.15786 g/mL] לגוף משקל (ק ג).
- ביום 4 בלבד, מיד לאחר הקלטת אתנול כרכים, ולפני מחדש מציגה גישה למים, לאסוף דם כדי להעריך את ריכוז האתנול בדם כל עכבר (אופציונלי).
הערה: כל שיטת איסוף הדם הלא-מסוף עשוי לשמש, כגון איסוף דם רטרו-מסלולית בסינוסים או וריד saphenous איסוף דם. עבור פרוטוקולים שימושי לראות אסמכתאות עבור. Parasuraman et al. 21 ויארדלי. et al. 20.- ביצוע ניתוח בשיטות שונות כולל איכות המזון או מכונות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
- החלף את כל הבקבוקים אתנול עם בקבוקי מים ואת עוצמת המים הרשומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחקירות הנציגה הבאה, שתיה היה המודל באמצעות את פרדיגמת הבחירה בקבוק שני (TBC). בקצרה, עכברים הייתה גישה שני בקבוקים של פתרון, אחד מהם הכיל מים, ואילו האחר פתרון אתנול 10% (v/v). הנבדקים היו לאחר מכן לפצל ומוקצה באופן שווה לקבוצות טיפול סמים, moxidectin (MOX) לעומת שליטה מלוחים, כך כל קבוצה הממוצע אתנול צריכת רמות עם הסכום של וריאציה לפחות.
התוכנית הבסיסית הראשונית 10E צריכת במהלך תקופת 24 שעות התייצב על 14.46 ± 1.85 g/kg (n = 8) לפני זריקות החל ולאחר מכן מחדש התייצב על 14.14 g/kg פוסט זריקות מלוחים. כדי להעריך את ההשפעות של חריפה מנה (5 מ"ג/ק"ג) של MOX על צריכת אתנול, העדפה, שותה פעילות היה המוערך טרום MOX MOX, פוסט MOX. מצאנו כי מנה אחת של MOX הקטינה באופן משמעותי את צריכת אלכוהול העולה על 45%, לעומת זריקות MOX קדם [F (2, 22) = 26.33, p < 0.0001] (איור 2א), והעדפה [F (2, 14) = 17.35, p < 0.0001] (איור 2B ) העולה על 30%. צריכת 10E והעדפה נותר נמוך באופן משמעותי תמיסת מלח ביום מיד לאחר הטיפול MOX (על ידי יותר מ- 25%, 15% בהתאמה) מראה כפי פוסט MOX זריקות באיור2).
במחקר פיילוט שלא פורסמו, שתייה מופרזת היה המודל אותם בעזרת השתייה במסגרת ההליך (DID) כהה לפיה עכברים היו מדי יום גישה מוגבלת (2h) אחד בקבוק המכיל 20E בהתחלה 3-h לשלב כהה היממה, במשך 3 ימים רצופים, עם גישה יותר תקופת (4 שעות) ביום 4 (איור 4). עכברים הנשי (n = 12, עכברים 6/קבוצה) מנוהל מלוחים זריקות (i.p.) בימים 1-4 עם בסיסית 20E הוקמו ביום 4 (סם מראש). על ימי 1-3 2nd שבועי מחזור, עכברים כל קיבל עוד הזרקה מלוחים מדי יום. ערכי צריכת אתנול מיום 3 ואז שימשו כדי לפצל לשתי קבוצות העכברים (n = 6 / קבוצה) לאחר מכן שקיבל זריקה אחת (i.p.) של MOX (5 מ"ג/ק"ג) או תמיסת מלח ביום הרביעי (סמים). בשבוע שלאחר מכן שכל העכברים קיבלו זריקות מלוחים מדי יום על צריכת בימים 1-4 ואתנול נמדדה שוב ביום הרביעי (post סמים). חריפה מינהל 5 מ"ג/ק"ג MOX ניתח ומצא לצריכת אלכוהול מופחתת באופן משמעותי מעל 54%, לעומת זריקות של סמים טרום (t = 7.635, p < 0.0001)
איור 1 . בקבוק שני הבחירה סכמטיתאנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . שני בקבוקים הבחירה (TBC). MOX (5 מ"ג/ק"ג) מפחיתה את צריכת אתנול (10E) של 10% v/v (א) והעדפה (B) בעכברים C57BL/6J נקבה באמצעות פרדיגמה ברירה של בקבוק שני גישה 24 שעות ביממה. לאחר השגת רמות שתייה יציבה במשך 3 ימים רצופים, MOX היה מנוהל. העמודות מייצגות 10E ממוצע צריכת רמות מ ביום שלפני הזריקה MOX (לבן; טרום MOX), היום של הזריקה MOX (שחור; MOX) והיום אחרי הזריקה MOX (אפור; פוסט MOX). הערכים מייצגים זאת אומרת ± SEM עבור עכברים 12. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001, ו * * * P < 0.0001 לעומת טרום MOX (השמאלי ביותר קו אופקי) או פוסט MOX (קו אופקי הימנית), Tukey של מבחן פוסט-הוק השוואה מרובים. ששינה מן huynh ב ש ואח. 19 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . שתייה כהה סכמטיתאנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . לשתות בחושך (עשו). MOX (5 מ"ג/ק"ג) מפחיתה את צריכת אתנול (20E) וי/v 20% בעכברים C57BL/6J נקבה באמצעות שתייה ב הפרדיגמה כהה. ברים מייצגים 20E ממוצע צריכת רמות בשבוע לפני הזריקה MOX (סם מראש), השבוע של הזריקה MOX (סמים), שבוע לאחר הזריקה MOX (פוסט-סמים). הערכים מייצגים את זאת אומרת ± SEM עבור עכברים 12 (6/קבוצה) בין תמיסת מלח MOX לקבוצות. P < 0.0001 נגד סמים טרום (השמאלי ביותר קו אופקי) או פוסט-סמים (קו אופקי הימנית), Tukey של מבחן פוסט-הוק השוואה מרובים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הערכות ברחבי העולם מציינים כי כ- 76 מיליון אנשים לענות על הקריטריונים כדי להצדיק אבחנה של הפרעה לשימוש אלכוהול (AUD). למרבה הצער, זמין כרגע תרופות טיפולים יעילים בעיקר, פיתוח נוסף הוא הכרחי לקזז את צרכי האוכלוסייה קליניים20. למטרה זו, להלן פרוטוקול שמטרתה להקל על המאמץ הזה על ידי המשמשים שניים למכרסמים הבסיסיים ביותר שותה פרדיגמות: שני-בקבוק-הבחירה (TBC) ושותים בחושך (DID). שני הדגמים למדוד הלא-operant ניהול עצמי של אתנול, לפיה עכברים להבלע אתנול בעל פה. ב- TBC הפרדיגמה, אתנול (10% v/v) ומים הינן זמינות ללא הרף, וכתוצאה מכך רמות האתנול בדם נמוכה וזהובה כי הם תוצאה של דוגמת מילוי בצריכת האתנול אפיזודי והדרגתי. מודל זה הטוב ביותר להערכת רמות נמוכות יותר של צריכת אתנול כמו העדפה tastant, לכן, אמור להיות דומה לשתות "מתון" האנושי. איור 2 לעיל מראה תוצאות נציג הפרדיגמה TBC.
מצד שני, ב- DID דגם אתנול (20% v/v) זמינה רק עבור כמות מוגבלת של זמן. בניגוד TBC, מודל זה מעריך את ההשפעות של תרכובת על רלוונטיות בהתנהגותו ריכוזי אתנול, מנצל העובדה כי עכברים C57BL/6J תצרוך כמויות גדולות של אתנול מהר מאוד במהלך השלב הפעיל ביותר של מחזור היממה שלהם. אלה מפגשים שתייה להתרחש במשך ארבעה ימים רצופים, החל ב 3rd h לתוך מחזור כהה, עם משך של 2 h על ימים 1-3 ו- 4 שעות ביום 4. באמצעות הליך זה, עכברים בדרך כלל צורכים מספיק אתנול להשגת בקס > 100 מ"ג/ד"ל, שהפגינו עדויות התנהגותיות של שיכרון. תוצאות הנציגה שלנו הפרדיגמה DID מוצגים באיור4. למרות שאנחנו לא לכמת בקס עבור אלו עכברים רמות השתייה שלהם דומים לאלה שדווחו בספרות להשיג בקס מעל 100 מ"ג/ד"ל13,14,15.
שתי פרדיגמות יש מגבלות. במהלך המופעים כאשר gavages אוראלי השיטה המועדפת של המינהל לבדיקת תרופתי של תרכובות עופרת, esophogeal הטראומה הנגרמת על-ידי הפרוצדורה שעלולות להפריע אתנול ניהול עצמי בשתי פרדיגמות. דבר זה נכון במיוחד עבור דגם עשה, אשר משתמשת ריכוז גבוה יותר של אתנול (20%), אשר נוכח מופעים איפה פרמקוקינטיקה של הסם דורש את הפעלת שתייה כדי להתחיל לפני החיות שהיו מספיק זמן להתאושש נוהל. זה יהיה בולט בקבוצת ביקורת שותים ברמות המתאימות בקס מתחת 0.08 הצפוי. במעבדה שלנו, שאנו חווים קושי עם האכלות כוח הן עם DID ואת TBC. הצלחנו לעקוף בעיות אלה על-ידי גיבוש תרכובות שלנו, כך הם יכולים להיגאל באמצעות המסת בעל פה של רצועה דקה (נחמד)19.
יתר על כן, במודל עשה במיוחד, בהתחשב בעובדה תקופת גישה אתנול כל כך קצרים במשך, מינון התרופה חייב להיעשות בזמן שנבחרו מראש במהלך מחזור אור זה נבחר בהתאם פרמקוקינטיקה של הסם כך מתחם ב / או מתקרב הריכוז המרבי המוח במהלך תקופת שתייה. אם לא ניתן לבצע ניתוח פרמוקוקינטיים, גישה אלטרנטיבית יהיה לבצע הערכה מהלך הזמן של השפעת הסם באמצעות TBC התנהגותית. בעקבות ההיגיון הזה, על-ידי פיקוח על פעילות שתייה על בסיס תעריף-שעה ולאחר קביעת שיא נגד אלכוהול אפקטים, אחד יכול באופן סביר אסטרטגיה כאשר שסמים צריכים להיות מנוהל19.
בעוד השדה של אלכוהוליזם יש מודלים בבעלי חיים שונים כדי לחקור היבטים פיזיולוגיים והתנהגותיים שונים של AUD8, הפרוטוקול הבא מתאר שתי פרדיגמות נפוץ, המאפשר השוואות של תוצאות מעבר מעבדות. יתרון נוסף הוא כי שיטות אלה הם טיפה, שהופך את השימוש בהם נוח במהלך לימודי אקוטי וכרוני דומה לזה של הדוגמאות הכלול לעיל. בנוסף, בניגוד פרדיגמות אלכוהול נפוצים אחרים, כגון התניה אופרנטית ועשן פרדיגמות קאמרית, המתודולוגיה שתיארנו כאן יכול להתבצע ללא צורך ציוד מיוחדים. Anecdotally, סביר כי ניתן למצוא כמעט כל הרכיבים של המנגנון שתייה ביבר מוסדיים הטיפוסי. יש גם דרכים שונות בהן לשנות את הפרוטוקולים המתוארים כאן. כך הם יכולים מיטבית המטרות של כל ניסוי. למשל, הליך DID שלנו הוא הטוב ביותר עבור בחינת השפעת תרופה חריפה על מושב שתייה בודד (במהלך יום יום 4). עם זאת, אנחנו הראו כי מינון התרופה הנמשך יכול להיות מוערך על ידי משלים את ההפעלות שתייה 4 ימים רצופים של access 2 ביממה, לעומת השעות 2 הנוכחי של access על ימים 1-3 ו- 4 שעות באותו יום ד'19. ניתן גם להעביר עכברים מאחד הפרדיגמה נוסף, או נבדק מחדש עבור מנות נוספות / שונה תרכובות, עם נקודה שטיפה פשוטה 1-2 בשבוע בין לבין.
יצוין, כי כל שינוי תחת השפעת סמים בשתייה שנמדדו באמצעות שיטות אלה חייבים ייחקר ביסודיות כדי לקבוע אם ההשפעות הן סלקטיבי לאלכוהול או אם הם עשויים להיות התוצאה של רעילות. לקבלת מידע נוסף אודות פקדים לקורא לעיין יארדלי ואח. 20 אין פרדיגמה יחיד יכול מודל בכל ההיבטים של מצב זה. במקום זאת, כל פרדיגמה בדרך כלל בוחן כמה מהתכונות המרכזיות הקשורות אוד TBC דגמים DID המתוארים כאן, נקשרו אל הבמה מוגזמת/שיכרון של מחזור התמכרות. להבנה מעמיקה יותר של השירות של המתחם, מספר במודלים שתייה פרה צריך להיות מנוצל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עשינו לה ממציאים על פטנט על שינוי של איוורמקטין ו avermectins הקשורות לטיפול בהפרעות שימוש באלכוהול בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. המחברים יש שאין אחרים ניגודי אינטרסים, והם לגמרי אחראי על התוכן המדעי של הנייר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מחקר מעניקה SC CTSI NIH/NCRR/NCATS - UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) והספר לרוקחות באוניברסיטת קליפורניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
