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शराब के लिए Pharmacotherapies के विकास में Murine पीने के मॉडल: अंधेरे में पीने और दो बोतल विकल्प

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/57027
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Titus Family Department of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Economics & Policy, School of Pharmacy, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

शराब का उपयोग विकार (AUD) एक प्रमुख राष्ट्रीय स्वास्थ्य समस्या है और अधिक प्रभावी उपचार के विकास के लिए इस रोगी की आबादी की जरूरतों को ऑफसेट करने के लिए आवश्यक है । इस अंत करने के लिए, निम्न प्रोटोकॉल लीड एंटी-अल्कोहल यौगिकों की नैदानिक प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए दो सरल कुतर पीने के मॉडल का इस्तेमाल करता है ।

Abstract

शराब का उपयोग विकार (AUD) एक अनुमान से अधिक के साथ एक बड़ी समस्या है ७६,०००,००० लोगों को दुनिया भर में नैदानिक मानदंड बैठक । वर्तमान उपचार तीन एफडीए-अनुमोदित दवाओं है कि मोटे तौर पर भी जब मनोसामाजिक हस्तक्षेप के साथ संयुक्त अप्रभावी रहे हैं, के रूप में उच्च पतन की दर से स्पष्ट है के लिए सीमित हैं । जैसे, और अधिक उपंयास उपचार के लिए खोज एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है । दो बोतल विकल्प (TBC) और अंधेरे में पीने (किया): इस अंत करने के लिए, निम्न प्रोटोकॉल सीसा विरोधी शराब यौगिकों की नैदानिक प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए दो सरल कुतर पीने के मॉडल का इस्तेमाल करता है । पूर्व चूहों स्वैच्छिक पीने के लिए मॉडरेशन में अनुमति देता है, जबकि बाद चूहों स्वैच्छिक एक छोटी अवधि में शराब की एक बड़ी राशि है कि बिंग पीने नकल की खपत करने के लिए प्रेरित करता है । इन मानदंड के दोनों के सरल और उच्च प्रवाह प्रकृति औषधीय एजेंटों की तेजी से जांच के लिए या चूहों की पहचान उपभेदों है कि कुछ स्वैच्छिक पीने के व्यवहार के प्रदर्शन के लिए अनुमति देते हैं ।

Introduction

पिछले 25 से अधिक वर्षों के लिए, महत्वपूर्ण प्रयास शराब का उपयोग विकार (AUD)1के उपचार के लिए दवाओं के विकास की दिशा में डाल दिया गया है । हालांकि कई अग्रिम किया गया है, AUD अभी भी एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बनी हुई है, १८,०००,००० अमेरिकियों पर प्रभावित है, और $२२०,०००,०००,००० से अधिक सालाना2,3की लागत । वर्तमान में वहां केवल तीन एफडीए को मंजूरी दी दवाओं, disulfiram, naltrexone, और acamprosate, जिनमें से सभी नैदानिक परीक्षणों और सीमित सफलता में असंगत परिणाम भी जब क्लिनिक सेटिंग्स में मनोसामाजिक हस्तक्षेप के साथ संयुक्त झुकेंगे है 4 , 5 , 6 , 7.

वर्तमान aud चिकित्सा की विफलताओं के लिए एक प्राथमिक कारण aud8के heterogenous प्रकृति से जुड़ा हुआ है । जबकि दोनों पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों AUD, heritability खातों के विकास के लिए एक अनुमान के लिए योगदान ५०-9शुरुआत के जोखिम का ६०% । अवसाद के उपचार के लिए इसी तरह, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि AUD से पीड़ित रोगियों कि प्रत्येक रोगी10की जरूरतों को पूरा करने के लिए सिलवाया रहे हैं दवाओं की एक किस्म की आवश्यकता होगी ।

जाहिर है, वहां अधिक प्रभावी उपचार है कि अगर पहले से ही कठिन और दवा की खोज के समय लेने की प्रक्रिया को व्यवस्थित किया जाएगा की सुविधा होगी के लिए एक तत्काल जरूरत है3। इस अंत करने के लिए, निंनलिखित प्रोटोकॉल दो कुतर पीने मॉडल व्यापक रूप से AUD11के neurobiological आधार की जांच करने के लिए इस्तेमाल के नैदानिक प्रयोज्यता को दर्शाता है । अधिक विशेष रूप से, यहां शुरू की विधि दोनों में शराब की खपत को कम करने में उंमीदवार यौगिकों की प्रभावकारिता का आकलन कर सकते है "मध्यम" और "bing पीने" परिदृश्यों दो बोतल विकल्प (TBC) और अंधेरे में पीने का उपयोग (किया) मानदंड, क्रमशः. दोनों मानदंड गैर operant इथेनॉल स्वयं प्रशासन की जांच, जिससे चूहों को मौखिक रूप से इथेनॉल और पर होगा, और इसलिए उच्च चेहरा वर्णन और मानव शराब11के एक मॉडल के रूप में वैधता का निर्माण ।

TBC पीने में भी मुफ्त पसंद पीने, वरीयता पीने, या सामाजिक पीने के रूप में जाना जाता है, समाधान की दो बोतलें लगातार घर पिंजरे में उपलब्ध हैं । एक बोतल पानी होता है, और अंय इथेनॉल का एक पतला समाधान शामिल है, जिससे इथेनॉल की एकाग्रता अलग किया जा सकता है (जैसे, 5-30% v/ चूहों दोनों बोतलों के लिए लगातार उपयोग किया है, और इसलिए, कितना प्रत्येक बोतल से पीने के लिए चुन सकते हैं ।

यह मॉडल प्रत्येक माउस (g/kg), साथ ही इथेनॉल वरीयता अनुपात (इथेनॉल भस्म ÷ कुल मात्रा तरल भस्म की मात्रा) के इथेनॉल खपत का आकलन है । यह नियमित रूप से चूहों के विभिंन उपभेदों में पीने के स्तर, या एक विशिष्ट आनुवंशिक हेरफेर के बाद तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है (जैसे, जीन नॉकआउट या पछाड़ना) और रक्त इथेनॉल सांद्रता में परिणाम (BECs) क्या मनुष्य में पाया जाता है के समान जब मॉडरेशन में पीने13,14।

किया प्रक्रिया में, 3 ज अंधेरे चक्र के शुरू होने के बाद, पानी की घर पिंजरे बोतल एक सीमित पहुंच पीने के सत्र के लिए 20% (वी/वी) इथेनॉल समाधान की एक बोतल के साथ आदान प्रदान की है । पीने के सत्र लगातार 4 दिन चक्र के रूप में होते हैं, 2 दिन 1-3 पर और 4 दिन 4 पर ज स्थायी । दिन 1-3 4 दिन पर परीक्षण से पहले एक शराब-आदी होना अवधि के रूप में सेवा । नतीजतन, चूहों मज़बूती से पर्याप्त इथेनॉल BECs पाने के लिए भस्म हो जाएगा > 100 मिलीग्राम/डीएल और एक परिणाम के रूप में, नशे के व्यवहार प्रभाव मनुष्य है कि13,14,15पीने बिंग में पाया प्रदर्शन । पेयजल सत्र के अलावा हर समय पानी का पहुंचना उपलब्ध है ।

वहां सीमित पहुंच पीने के कई रूपांतरों हैं । उदाहरण के लिए, आंतरायिक पहुंच मॉडल में, चूहों दो बोतलें (एक युक्त पानी और अंय युक्त 20% (v/v) इथेनॉल प्राप्त) केवल सोमवार, बुधवार, और शुक्रवार के कार्यदिवस और सप्ताहांत, क्रमशः16पर एक 24 एच और ४८ एच वापसी की अवधि के साथ । आंतरायिक उपयोग के कई हफ्तों के बाद, चूहों धीरे-धीरे और स्वेच्छा से पीने का स्तर बढ़ेगा, अंततः BECS क्या किया मॉडल में मनाया जाता है के समान हटेगा । किया, तथापि, के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल को बिंग की तरह पीने के व्यवहार का आकलन प्रतीत होता है । आंतरायिक पीने के अंय मॉडल मौजूद है, लेकिन वे भोजन या भाप स्वैच्छिक स्वयं प्रशासन में वृद्धि प्रेरित है, जो उंहें स्वैच्छिक मानव शराब खपत16के प्रतिनिधि कम बनाता है का उपयोग सीमित पर निर्भर हैं ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और दक्षिणी कैलिफोर्निया स्वास्थ्य विज्ञान परिसर के विश्वविद्यालय के उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. प्रायोगिक सेटअप और विधानसभा

  1. अध्ययन के शुरू होने से पहले निंनलिखित आपूर्ति और रसायनों के सभी मोल: चूहों, पिंजरों/धातु पिंजरे में सबसे ऊपर है, बिस्तर, भोजन, पानी, इथेनॉल, pipets, सिप्पी सबसे ऊपर, लपेटो हटना, उपयोगिता चाकू, ज़िप संबंधों, टेप, Bunsen बर्नर, स्केल, headlamp ।
  2. C57BL/6J चूहों प्राप्त करें, या तो एक वाणिज्यिक स्रोत या एक घर में कॉलोनी से, ध्यान में रखते हुए कि चूहों समूह हो सकता है परीक्षण के समय तक ईमारत ।
    नोट: खरीदे चूहों की कुल संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन की जटिलता पर निर्भर करता है । प्रति समूह लगभग 12-15 चूहों को समायोजित करने के लिए योजना, पायलट अध्ययन के साथ नहीं समूह प्रति 5-7 चूहों से छोटे. नीचे दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों में हमने एक साधारण दो-समूह सेट-अप का उपयोग किया जिसका कारण-प्रभाव संबंध का आकलन एक ही खुराक (५ मिलीग्राम/) की दवा (मॉक्स) का उपयोग करना है.
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करने के लिए18बोतलें इकट्ठा ।
    1. हीट एक उपयोगिता चाकू एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर ।
    2. इस चाकू का प्रयोग, एक प्लास्टिक 18 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक के ऊपर और नीचे सिरों से मोटे तौर पर एक इंच काट ।
      1. ध्यान दें कि माप की शुद्धता बढ़ाने के लिए छोटे वॉल्यूम pipets (यानी, 10 एमएल) का भी उपयोग किया जा सकता है ।
    3. एक गर्मी बंदूक के तहत प्लास्टिक गर्म ।
    4. प्लास्टिक के अंत में "नीचे" में सिप्पी ट्यूब असर गेंद डालें (दूसरे शब्दों में, उद्घाटन 18 मिलीलीटर डैश लाइन के पास) ।
    5. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लपेटो बंदूक का उपयोग कर हटना लपेटो के साथ जगह में सिप्पी ट्यूब सील ।
    6. एक सिलिकॉन डाट के साथ अंय खोलने बंद कैप ।

2. पशु आदी होना

  1. प्रयोग की शुरुआत की तारीख से कम से 1 सप्ताह पहले शुरू, चूहों कमरे में स्थानांतरित करने के लिए जहां प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को बाहर किया जा करने के लिए कर रहे हैं ताकि वे (परिवेश तापमान (21 ± 1 ° c) और 12-h सहित पशुपालन शर्तों को acclimate कर सकते हैं दोपहर 12 बजे बंद रोशनी के साथ प्रकाश/ संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करना सुनिश्चित करें और जानवरों को एक स्थान से दूसरी जगह ले जाने से पहले उचित चैनल को सूचित करे ।
    1. यदि चूहों को एक मानक प्रकाश/अंधेरे चक्र से स्थानांतरित किया जा रहा है अतिरिक्त आदी होना समय के 2 सप्ताह की अनुमति दें ।
  2. पानी के साथ सीमा को नए बनाया बोतलों भरें । सुनिश्चित करें कि टोपी सुरक्षित रूप से बंद कर दिया है और किसी भी हवा के बुलबुले या टोंटी से लीक से रहित है । यदि समाधान टपक रहा है, तो कैप को पुनः सुरक्षित करें । बस बोतल पर दोहन इतना है कि हवा ट्यूब से बच सकते हैं द्वारा किसी भी हवा के बुलबुले निकालें ।
  3. आगमन पर, एकल घर मानक पाली में प्रत्येक माउस/polysulfone पिंजरों बिस्तर और एक धातु ग्रिड पिंजरे शीर्ष के साथ; पिंजरे ढक्कन निकालें के रूप में यह अब नहीं किया जाएगा ।
    1. भोजन और पानी की बोतल (ओं) के लिए पहुंच प्रदान विज्ञापन libitum।
    2. प्रत्येक बोतल के आसपास एक प्लास्टिक ज़िप टाई लपेटकर यह जगह में रखने के लिए प्रत्येक बोतल सुरक्षित । यह पिंजरे में बहर नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ज़िप टाई से किसी भी अतिरिक्त प्लास्टिक ट्रिम कर दीजिए ।
      नोट: अंधेरे (किया) प्रक्रिया में पीने के लिए, केवल पानी की एक बोतल की आवश्यकता है । दो बोतल विकल्प (TBC) प्रतिमान को आदी होना, तथापि, की आवश्यकता है कि पिंजरे सेट अप पानी की दो बोतलें शामिल हैं । यदि धातु ग्रिड कूदनेवाला प्रदान समाधान का केवल एक ही बोतल पकड़ बनाया गया है, धीरे से अपनी सलाखों के अलावा मोड़ के लिए एक अतिरिक्त प्लेट के लिए जगह बनाने के लिए TBC के लिए दूसरी बोतल को समायोजित ।
  4. सेट अप कम से 3 माउस नि: शुल्क नियंत्रण पिंजरों । यह किसी भी द्रव वाष्पीकरण या बोतलों से छलकने की वजह से नुकसान की निगरानी के लिए अनुमति है, जो सिर्फ एक प्राकृतिक घटना है कि पिंजरों पर और पिंजरे रैक बंद रखा जाता है के रूप में होता है (कदम 2.6.3, 3.6.1, और 4.6.1 समीकरणों के लिए) ।
  5. 1-सप्ताह एकल आवास acclimation के 4 दिन पर शुरुआत, माप और दैनिक शरीर और प्रत्येक माउस के भोजन के वजन रिकॉर्ड, एक पैमाने का उपयोग, (ग्राम में) के रूप में अच्छी तरह से पानी का सेवन, उल्टे बोतल के साथ नक़्क़ाशी का उपयोग करने के उच्चतम बिंदु रिकॉर्ड meniscus (एमएल में) ।
    1. हालांकि यह मानक वैज्ञानिक अभ्यास के लिए गुफा meniscus के निम्नतम बिंदु को पढ़ने के लिए है, क्योंकि बोतलों माप के दौरान एक औंधा स्थिति में रहते हैं, meniscus के उच्चतम बिंदु रिकॉर्ड.
  6. २.५ के मापदंडों के नीचे समीकरण का उपयोग कर का आकलन करें:
    1. शरीर का वजन बदलने के उपाय (g): वर्तमान दिन का वजन (g)-पिछले दिन का वजन (g) ।
    2. भोजन के सेवन का उपाय (g): पिछले दिवस (g) पर भोजन का वजन-वर्तमान दिन (g) पर भोजन का वजन ।
    3. पानी के सेवन (एमएल) को मापने: [वर्तमान दिन (एमएल) पर पानी की मात्रा-पिछले दिन (एमएल) पर पानी की मात्रा]-सभी नियंत्रण पिंजरों (एमएल) से औसत पानी की हानि ।
  7. दोहराएं २.५ चरण लगातार, दिन 5-7 पर, तीन दिन के लिए एक आधार रेखा के निर्धारण के लिए अनुमति देने के तुरंत पहले इथेनॉल की शुरूआत करने के लिए । एक लगातार रिकॉर्डिंग संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, तो आधारभूत माप के मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए acclimation अवधि का विस्तार करें ।
  8. एक बार पानी का सेवन करने के लिए पिछले 3 दिनों के मतलब से 10% परिवर्तनशीलता स्थिर है, या तो TBC (असीमित उपयोग) या किया (सीमित पहुंच) के साथ इथेनॉल का उपयोग शुरू करते हैं ।
    नोट: दुर्लभ अवसर पर, इस स्थिरता को प्राप्त करने के लिए विषयों के लिए एक से दो अतिरिक्त दिन की आवश्यकता हो सकती है; अतिरिक्त समय पिछले 3 दिनों के माध्य से ± 10% परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करने के लिए मूल्यों के लिए आवश्यक है, तो चिंतित मत हो ।

3.24 घंटे दो बोतल विकल्प (TBC)

नोट: एक योजनाबद्ध 1 चित्रामें तैयार किया जाता है.

  1. एक 10% तैयार (v/v) ५०० मिलीलीटर की मात्रा में इथेनॉल समाधान १९० सबूत अनाज इथेनॉल के ५२.६५ मिलीलीटर जोड़कर (~ ९५% इथेनॉल) एच2ओ के ४४७.३५ मिलीलीटर के लिए; अच्छी तरह से हिला कर रहें । यह देखते हुए कि इथेनॉल जल्दी से लुप्त होता है, हर 3-4 दिन के अंतराल में समाधान की जगह ।
    नोट: इथेनॉल के अंय सांद्रता के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लेखक इस मॉडल के लिए एक 10% एकाग्रता की सिफारिश ।
  2. TBC के पहले दिन पर, (जल्दी से कम दिन 8) 2 पानी की बोतलों के 1 खाली, प्रत्येक पिंजरे में, और यह हौसले से तैयार इथेनॉल समाधान के साथ सीमा को भरने । यह देखते हुए कि इथेनॉल और पानी के लिए नेत्रहीन प्रतिष्ठित होना मुश्किल है, स्पष्ट रूप से उनकी इसी सामग्री के साथ बोतलों लेबल । बस बोतल को मास्किंग टेप का एक टुकड़ा लागू करते है और यह एक मार्कर के साथ लेबल या बोतल पर सीधे लिख कर ।
  3. पानी की बोतल के लिए और अधिक समाधान जोड़ें, आवश्यकतानुसार ।
  4. पिंजरे पर बोतलें वापस प्लेस, सुनिश्चित करें कि सभी टोपियां सुरक्षित रूप से बंद कर रहे है और किसी भी हवा के बुलबुले या टोंटी से लीक से रहित कर रहे हैं । अगर समाधान टपक रहा है तो कैप को पुनः सुरक्षित करें । बस बोतल पर दोहन इतना है कि हवा की बोतल से बच सकते द्वारा किसी भी हवा के बुलबुले निकालें ।
  5. वैकल्पिक बोतलों की स्थिति हर दूसरे दिन के रूप में वातानुकूलित जगह वरीयता पीने गतिविधि में संबंधित प्रभावों के लिए सही करने के लिए (अधिक के लिए चर्चा देखें) ।
  6. २.५ और २.६, जो चल रहा है से दैनिक माप के अलावा, पढ़ने और इथेनॉल के सेवन के स्तर को रिकॉर्ड के रूप में अच्छी तरह से शुरू करते हैं । 10% इथेनॉल का सेवन और वरीयता निम्न समीकरण का उपयोग कर अनुपात का विश्लेषण:
    1. 10% इथेनॉल सेवन (एमएल): [वर्तमान दिन (एमएल) पर इथेनॉल की मात्रा-पिछले दिन (एमएल) पर इथेनॉल की मात्रा)]-सभी नियंत्रण पिंजरों (एमएल) से औसत इथेनॉल हानि मापने ।
    2. 10% इथेनॉल सेवन (g/kg): [10% इथेनॉल सेवन (एमएल) x ०.०७८९३ g/एमएल]/शरीर के वजन (किग्रा) को मापने ।
    3. वरीयता% मापने: [10% इथेनॉल का सेवन (एमएल)/पानी (एमएल)] x १०० ।
  7. जैसे ही इथेनॉल का सेवन स्थिर हो गया है, एक एकल नियंत्रण (खारा) intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन (०.०१ मिलीलीटर शरीर के वजन के जी) दैनिक माप दिनचर्या के दौरान प्रत्येक माउस के लिए । इस तरह, विषयों इंजेक्शन के आदी हो जाते हैं ।
    1. स्थिरता ± 10% परिवर्तनशीलता के रूप में पिछले 3 दिनों के माध्य से परिभाषित किया गया है (धारा २.८ के रूप में ही) ।
      नोट: यह इथेनॉल के स्तर को स्थिर करने के लिए 1 सप्ताह तक ले जा सकते हैं । यह विशेष रूप से सच है अगर चूहों फिर से एक पिछले प्रयोग से इस्तेमाल किया जा रहा है और इथेनॉल के लिए पिछले जोखिम पड़ा है । नियंत्रण बस विलायक दवा भंग करने के लिए इस्तेमाल किया है ।
  8. एक बार एक इथेनॉल कम परिवर्तनशीलता के साथ आधार रेखा फिर से स्थापित किया गया है, खुराक समूहों में इथेनॉल का उपयोग करते हुए सभी समूहों मोटे तौर पर समान औसत इथेनॉल का सेवन मूल्यों है कि मात्रा में चूहों विभाजित ।
    1. एक समूह को नियंत्रण के रूप में निर्दिष्ट करें (खारा प्राप्त करने के लिए जारी) और अन्य के रूप में प्रयोगात्मक (जांच की दवा के आईएफसआई इंजेक्शन पर ०.०१ मिलीलीटर/ दैनिक दवा खुराक शुरू, या तो एक तीव्र या बहु दिन की अवधि के लिए । इसके बाद, नियंत्रण के बाद दवा प्रभाव (वैकल्पिक) का परीक्षण करने के लिए फिर से पेश किया जा सकता है ।
      नोट: पीने के एक 24-h लंबी अवधि में निगरानी की जाती है, क्योंकि खुराक प्रशासन के समय अंधेरे चक्र पर निर्भर नहीं है ।

4. अंधेरे में पीना (किया)

नोट: एक योजनाबद्ध 3 चित्रामें तैयार किया जाता है ।

  1. अनुसूचित इथेनॉल का उपयोग (दिन 1-4) के प्रत्येक दिन पर, पानी की मात्रा, भोजन के सेवन के लिए माप रिकॉर्ड, और शरीर के वजन, और दवा खुराक प्रदर्शन । प्रकाश चक्र के दौरान एक चयनित समय के दौरान यह मत करो कि दवा के फार्माकोकाइनेटिक्स के अनुसार चुना जाता है ताकि यौगिक पर है/या पीने की अवधि के दौरान अधिकतम मस्तिष्क एकाग्रता आ ।
    नोट: याद रखें दिन 1-3 सिर्फ समय की एक छोटी अवधि में इथेनॉल के प्रचुर स्तर पीने के लिए चूहों acclimate करने के लिए होती हैं । जबकि चूहों BEC मानव ०.०८ के बराबर स्तर तक पहुंच नहीं है; इन "प्रशिक्षण" दिन यह सुनिश्चित करना है कि 4 दिन पर, थोड़ा समय पीने के सत्र के दौरान, वे वास्तव में पेय है कि स्तर तक होगा ।
    1. सभी चूहों 1-3 दिनों पर नियंत्रण (खारा) दे दो, और या तो नियंत्रण या दवा 4 दिन पर. यह प्रक्रिया किया 3 सप्ताह के अंतराल पर होता है एक पूर्व दवा (1 सप्ताह), दवा (सप्ताह 2), और बाद दवा (4 सप्ताह) पीने के सत्र शामिल है ।
    2. नोट: ध्यान दें कि दवा खुराक सप्ताह के दौरान, 3 दिन इथेनॉल का सेवन स्तर या तो नियंत्रण या एक तरह से दवा समूह के लिए चूहों को आवंटित करने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां दोनों समूहों के इथेनॉल का सेवन स्तर कम परिवर्तनशीलता है. यह TBC के विपरीत है, जो एक 3 दिन के औसत के आधार पर समूह प्रदान करता है ।
  2. एक 20% (v/v) इथेनॉल समाधान (20E) ५०० मिलीलीटर की मात्रा में १९० सबूत अनाज इथेनॉल के १०५.२५ मिलीलीटर (~ ९५% इथेनॉल) को एच2ओ के ३९४.७५ मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा तैयार; अच्छी तरह से हिला कर रहें ।
  3. पीने के सत्र के शुरू होने से पहले इथेनॉल की बोतलें भरें ताकि जैसे ही किया शुरू होता है पानी की बोतलें बस शराब की बोतलों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
  4. पूरे बगान सत्र (स्टेप्स ४.५-४.८) के दौरान, जानवरों को परेशान न करने के लिए लाल बत्ती headlamp का प्रयोग करें ।
  5. किया पीने के सत्र के शुरू में, अंधेरे चक्र में 3 घंटे शुरू अनुसूचित, प्रत्येक माउस के लिए पानी की मात्रा रिकॉर्ड । फिर, 20E समाधान की एक बोतल के साथ प्रत्येक पानी की बोतल की जगह और शुरू इथेनॉल की मात्रा रिकॉर्ड.
  6. पढ़ें और अंतिम इथेनॉल खंड 2 घंटे बाद रिकॉर्ड, दिन पर पीने के सत्र के अंत में 1-3 और 4 दिन बाद 4 घंटे पर । विश्लेषण 20% इथेनॉल निंनलिखित समीकरणों का उपयोग कर सेवन ।
    1. 20% इथेनॉल सेवन (एमएल): [पीने के सत्र (एमएल) के अंत में इथेनॉल की मात्रा-पीने के सत्र (एमएल) के शुरू में इथेनॉल की मात्रा]-सभी नियंत्रण पिंजरों (एमएल) से औसत इथेनॉल हानि मापने ।
    2. 20% इथेनॉल सेवन (g/kg): [20% इथेनॉल सेवन (एमएल) x ०.१५७८६ g/एमएल]/शरीर के वजन (किग्रा) को मापने ।
  7. 4 दिन केवल, तुरंत इथेनॉल की मात्रा रिकॉर्डिंग के बाद, और फिर से पहले पानी के लिए उपयोग शुरू करने, रक्त इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक माउस के रक्त इथेनॉल एकाग्रता का आकलन (वैकल्पिक) ।
    नोट: किसी भी गैर-टर्मिनल रक्त संग्रह विधि इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे रेट्रो कक्षीय साइनस रक्त संग्रह, या saphenous नस रक्त संग्रह. उपयोगी प्रोटोकॉल के लिए Parasuraman एट अल के लिए संदर्भ देखें । 21 और Yardley एट अल. 20।
    1. LCMS, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मशीनरी सहित विभिन्न पद्धतियों का उपयोग करके विश्लेषण करें ( सामग्री तालिकादेखें).
  8. पानी की बोतलें और रिकॉर्ड पानी की मात्रा के साथ सभी इथेनॉल की बोतलों की जगह ।

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Representative Results

निंनलिखित प्रतिनिधि जांच में, सामाजिक पीने के दो बोतल विकल्प (TBC) प्रतिमान का उपयोग कर मॉडलिंग की थी । संक्षेप में, चूहों समाधान के दो बोतलों के लिए उपयोग किया था, जिनमें से एक पानी समाहित, और अंय एक 10% (v/ विषयों बाद में विभाजित किया गया और समान रूप से दवा उपचार समूहों को सौंपा, moxidectin (मॉक्स) बनाम खारा नियंत्रण, ताकि प्रत्येक समूह भिंनता की कम राशि के साथ इथेनॉल के सेवन का स्तर औसत होगा ।

24-h अवधि के दौरान प्रारंभिक आधार रेखा 10E सेवन १४.४६ ± १.८५ g/kg (n = 8) इंजेक्शन से पहले शुरू हुआ, और बाद में १४.१४ g/kg पोस्ट खारा इंजेक्शन पर फिर से स्थिर । एक तीव्र खुराक के प्रभाव का आकलन करने के लिए (5 मिलीग्राम/इथेनॉल का सेवन और वरीयता पर मॉक्स, पीने गतिविधि पूर्व मॉक्स, मॉक्स, और पोस्ट मॉक्स का आकलन किया गया. हमने पाया है कि मॉक्स की एक खुराक काफी कम शराब का सेवन ४५% से अधिक में, पूर्व मॉक्स इंजेक्शन के साथ तुलना में [f (2, 22) = २६.३३, p < 0.0001] (चित्रा 2ए), और वरीयता [f (2, 14) = १७.३५, p < 0.0001] (चित्रा 2बी ) में 30% से अधिक है । 10E सेवन और वरीयता दोनों दिन पर खारा की तुलना में काफी कम रहे तुरंत मॉक्स उपचार के बाद (25% से अधिक, और 15% क्रमशः) चित्रा 2में पोस्ट मॉक्स इंजेक्शन के रूप में दिखाया गया है) ।

एक अप्रकाशित पायलट अध्ययन में, बिंग पीने के अंधेरे में पीने का उपयोग कर मॉडलिंग की थी () प्रक्रिया है जिससे चूहों दैनिक सीमित उपयोग (2 एच) 20E 3 शुरुआत circadian अंधेरे चरण में एच युक्त एक बोतल के लिए था, के लिए लगातार 3 दिनों, एक लंबे समय तक पहुंच के साथ अवधि (4 ज) 4 दिन (चित्रा 4) पर । महिला चूहों (n = 12, 6 चूहों/समूह) (पूर्व दवा) 4 दिन पर स्थापित आधारभूत 20E के साथ 1-4 दिनों पर खारा इंजेक्शन (आईएफसआई) प्रशासित किया गया. 2एन डी साप्ताहिक चक्र के 1-3 दिनों में, सभी चूहों अभी तक एक और दैनिक खारा इंजेक्शन प्राप्त किया । 3 दिन से इथेनॉल का सेवन मूल्यों तो दो समूहों में चूहों विभाजित किया गया (n = 6/) है कि बाद में मॉक्स का एक इंजेक्शन (आईएफसआई) प्राप्त (5 मिलीग्राम/) या खारा 4 दिन पर (दवा) । अगले सप्ताह सभी चूहों दिन 1-4 पर दैनिक खारा इंजेक्शन प्राप्त किया और इथेनॉल का सेवन अभी तक 4 दिन पर फिर से मापा गया था (पोस्ट ड्रग). तीव्र प्रशासन के 5 मिलीग्राम/एक का विश्लेषण किया गया था और काफी कम शराब का सेवन करने के लिए पाया ५४% से अधिक, पूर्व दवा इंजेक्शन के साथ तुलना में (टी = ७.६३५, पी < ०.०००१)

Figure 1
चित्रा 1 . दो बोतल पसंद योजनाबद्धकृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।  

Figure 2
चित्रा 2 . दो बोतल विकल्प (TBC) । मॉक्स (5 मिलीग्राम/) 10% v/v इथेनॉल (10E) सेवन कम कर देता है (ए) और वरीयता (बी) महिला C57BL/6J चूहों में एक 24-एच का उपयोग दो बोतल विकल्प प्रतिमान का उपयोग कर । लगातार 3 दिनों के लिए स्थिर पीने का स्तर प्राप्त करने के बाद, मॉक्स प्रशासित किया गया था । सलाखों के मॉक्स इंजेक्शन से पहले दिन से औसत 10E सेवन के स्तर का प्रतिनिधित्व (सफेद; पूर्व मॉक्स), मॉक्स इंजेक्शन का दिन (काला; मॉक्स) और दिन के बाद मॉक्स इंजेक्शन (ग्रे; पोस्ट मॉक्स). मूल्यों 12 चूहों के लिए मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, और * * * * p < 0.0001 बनाम पूर्व मॉक्स (सबसे बाएँ क्षैतिज रेखा) या पोस्ट मॉक्स (rightmost क्षैतिज रेखा), Tukey की एकाधिक तुलना पोस्ट-हॉक परीक्षण. Huynh एन एट अलसे संशोधित । 19 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . अंधेरे योजनाबद्ध में पीनेकृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।  

Figure 4
चित्र 4 . अंधेरे में पीना (किया) । मॉक्स (5 मिलीग्राम/) 20% v/v इथेनॉल (20E) मादा C57BL में सेवन/6J चूहों अंधेरे प्रतिमान में एक पीने का उपयोग कर कम कर देता है । सलाखों के मॉक्स इंजेक्शन (पूर्व दवा), मॉक्स इंजेक्शन (दवा) और सप्ताह के बाद मॉक्स इंजेक्शन (दवा के बाद) से पहले सप्ताह पर औसत 20E सेवन के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं । मूल्यों खारा और मॉक्स समूहों के बीच 12 चूहों (6/समूह) के लिए मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । P < 0.0001 बनाम पूर्व-औषध (सबसे बाएं क्षैतिज रेखा) या पोस्ट-ड्रग (rightmost क्षैतिज रेखा), Tukey की एकाधिक तुलना पोस्ट-हॉक परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

दुनिया भर में अनुमान है कि कई के रूप में ७६,०००,००० लोगों को मानदंडों को पूरा करने के लिए शराब का उपयोग विकार के लिए एक निदान वारंट (AUD) । दुर्भाग्य से, दवा वर्तमान में उपलब्ध उपचार मुख्यतः अप्रभावी और आगे विकास के लिए इस नैदानिक आबादी20की जरूरतों को ऑफसेट करने के लिए आवश्यक है । दो बोतल पसंद (TBC) और अंधेरे में पीने (किया): इस अंत करने के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल सबसे बुनियादी कुतर पीने के प्रतिमान के दो exemplifying द्वारा इस प्रयास की सुविधा के लिए करना है । दोनों मॉडलों को मापने गैर operant स्वयं इथेनॉल के प्रशासन, जिससे चूहों मौखिक रूप से इथेनॉल घूस । TBC प्रतिमान में, इथेनॉल (10% v/और पानी दोनों लगातार उपलब्ध हैं, तुलना में कम रक्त इथेनॉल का स्तर है कि एक प्रासंगिक और क्रमिक इथेनॉल की खपत पैटर्न का परिणाम है जिसके परिणामस्वरूप । यह मॉडल एक वरीयता tastant के रूप में इथेनॉल के सेवन के निचले स्तर का आकलन करने के लिए सबसे अच्छा है और इसलिए, मानव के समान होना कहा जाता है "मध्यम" पीने । चित्रा 2 के ऊपर TBC प्रतिमान के लिए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है ।

दूसरी ओर, मॉडल इथेनॉल में किया (20% वी/समय की एक सीमित राशि के लिए ही उपलब्ध है । TBC के विपरीत, इस मॉडल इथेनॉल के व्यवहार प्रासंगिक सांद्रता पर एक यौगिक के प्रभाव का आकलन, तथ्य यह है कि C57BL/6J चूहों इथेनॉल की बड़ी मात्रा में अपने circadian चक्र के सबसे सक्रिय चरण के दौरान बहुत जल्दी भस्म हो जाएगा का लाभ उठाते हुए । इन पीने के सत्र लगातार 4 दिनों के लिए होते हैं, 3rd एच में अंधेरे चक्र में शुरुआत, 2 दिन 1-3 पर एच की अवधि के साथ और 4 दिन पर एच 4 । इस प्रक्रिया का उपयोग करना, चूहों आम तौर पर पर्याप्त इथेनॉल का उपभोग करने के लिए BECs प्राप्त > 100 मिलीग्राम/डीएल और नशे के व्यवहार सबूत प्रदर्शित करने के लिए. किया प्रतिमान के लिए हमारे प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4में दिखाया गया है । हालांकि हम इन चूहों के लिए BECs उपाय नहीं किया, उनके पीने का स्तर साहित्य कि १०० से अधिक मिलीग्राम/डीएल13,14,15पर BECs हासिल में रिपोर्ट करने वालों के समान हैं ।

दोनों प्रतिमान सीमाएं हैं । उदाहरणों के दौरान जब मौखिक gavages नेतृत्व यौगिकों के औषधीय परीक्षण के लिए प्रशासन के पसंदीदा तरीका है, esophogeal आघात प्रक्रिया की वजह से दोनों मानदंड में इथेनॉल स्वयं प्रशासन बाधा हो सकती है । यह क्या मॉडल है, जो इथेनॉल के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करता है के लिए विशेष रूप से सच है (20%) और जो मौजूद उदाहरण जहां दवा के फार्माकोकाइनेटिक्स पीने के सत्र से पहले पशुओं के लिए पर्याप्त समय से उबरने की आवश्यकता शुरू हो सकता है प्रक्रिया. इस स्तर पर पीने के एक नियंत्रण समूह में स्पष्ट है कि ०.०८ की उंमीद से नीचे अच्छी तरह से BECs के अनुरूप होगा । हमारी प्रयोगशाला में, हम दोनों किया और TBC के साथ बल भक्षण के साथ कठिनाई का अनुभव किया है । हम अपने यौगिकों तैयार करने के लिए इतना है कि वे एक मौखिक रूप से भंग पतली पट्टी (ODS)19का उपयोग कर दिया जा सकता है इन मुद्दों के आसपास काम करने में सक्षम थे ।

इसके अलावा, विशेष रूप से किया मॉडल में, तथ्य यह है कि इथेनॉल का उपयोग अवधि इतनी अवधि में कम है दिया, दवा खुराक एक चयनित समय के दौरान किया जाना चाहिए प्रकाश चक्र है कि दवा के फार्माकोकाइनेटिक्स के अनुसार चुना जाता है के दौरान इतना है कि यौगिक में/या पीने की अवधि के दौरान अधिकतम मस्तिष्क एकाग्रता आ रहा है । यदि एक pharmacokinetic विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण TBC का उपयोग कर दवा के व्यवहार प्रभाव का एक समय पाठ्यक्रम मूल्यांकन का संचालन करने के लिए किया जाएगा । इस तर्क के बाद, एक प्रति घंटा के आधार पर पीने गतिविधि की निगरानी, और पीक विरोधी शराब प्रभाव का निर्धारण करके, एक यथोचित strategize सकता है जब ड्रग्स19प्रशासित किया जाना चाहिए ।

जबकि शराब के क्षेत्र में विभिंन पशु मॉडल है AUD8के विभिंन शारीरिक और व्यवहार पहलुओं की जांच, निंनलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है दो आमतौर पर इस्तेमाल किया मानदंड है, जो भर में परिणामों की तुलना के लिए अनुमति देता है प्रयोगशालाओं. एक दूसरे को लाभ यह है कि इन तरीकों सीधा कर रहे हैं, तीव्र और जीर्ण ऊपर दिए गए उदाहरणों के समान अध्ययन के दौरान उनके उपयोग सुविधाजनक बनाने । इसके अतिरिक्त, अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया शराब मानदंड के विपरीत, ऐसे operant कंडीशनिंग और वाष्प चैंबर मानदंड के रूप में, पद्धति हम यहां वर्णित है विशेषता उपकरणों के लिए की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है । Anecdotally, यह संभावना है कि पीने के तंत्र के लगभग सभी घटकों को एक prototypical संस्थागत vivarium में पाया जा सकता है । वहां भी विभिंन तरीकों से यहां वर्णित प्रोटोकॉल में परिवर्तन कर रहे है ताकि वे सबसे अच्छा प्रत्येक प्रयोग के लक्ष्यों को फिट कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हमारी किया प्रक्रिया एक ही पीने के सत्र पर एक दवा के तीव्र प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है (दिन के दौरान 4 दिन). हालांकि, हमें पता चला है कि बहु दिन दवा खुराक 2 घंटे का उपयोग के लगातार 4 दिनों के लिए पीने के सत्रों को बढ़ाने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, के रूप में दिन 1-3 पर उपयोग के वर्तमान 2 घंटे के लिए विरोध और 4 दिन 4 घंटे पर19। चूहों को भी एक प्रतिमान से दूसरे में स्थानांतरित किया जा सकता है, या के बीच में एक साधारण 1-2 सप्ताह वॉशआउट अवधि के साथ फिर से अतिरिक्त खुराक के लिए परीक्षण/

यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि इन तरीकों के माध्यम से मनाया पीने में किसी भी दवा प्रेरित परिवर्तन अच्छी तरह से प्रभाव शराब के लिए चयनात्मक हैं या यदि वे विषाक्तता का परिणाम हो सकता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए जांच की जानी चाहिए. नियंत्रण के बारे में अधिक जानकारी के लिए पाठक Yardley एट अलका उल्लेख करना चाहिए । 20 कोई एक प्रतिमान इस हालत के सभी पहलुओं मॉडल कर सकते हैं । इसके बजाय, प्रत्येक प्रतिमान आमतौर पर प्रमुख AUD के साथ जुड़े विशेषताओं में से कुछ की जांच । TBC और मॉडल यहां वर्णित है, की लत चक्र के binge/नशा मंच से जोड़ा गया है । यौगिक की उपयोगिता की एक और अधिक गहन समझ के लिए, कई नैदानिक पीने के मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

DLD और ला ivermectin और संबंधित avermectins के repurposing के लिए एक पेटेंट पर अंवेषकों शराब के इलाज के विकारों के उपचार के लिए कर रहे हैं । लेखकों के हित का कोई दूसरा संघर्ष नहीं है और कागज की वैज्ञानिक सामग्री के लिए पूरी तरह जिम्मेदार हैं.

Acknowledgments

यह काम, भाग में, अनुसंधान अनुदान अनुसूचित जाति CTSI NIH/NCRR/NCATS--UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.), और यूएससी स्कूल ऑफ फार्मेसी द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L  graduated cylinder VWR https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle Pyrex (Fisher Scientific) https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 To prepare ethanol solution.
Analox One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes Ancare Corp. http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice Jackson lab https://www.jax.org/strain/000664 May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged 10 mL, 18 mL, or 25 mL 
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC Decon Labs (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec ---
heat gun  Master Appliances Corp. http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing --- --- Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade --- --- ---
metal cage plate --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale Ohaus (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus ---
red light headlamp nyteBright (Amazon) https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 ---
silicone stoppers Fisher --- ---
thermometer Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 ---
weigh boat VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative

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References

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चिकित्सा अंक १४३ शराब का उपयोग विकार pharmacotherapy औषध-विकास नैदानिकी माउस मॉडल बिंग पीने नि: शुल्क विकल्प पीने
शराब के लिए Pharmacotherapies के विकास में Murine पीने के मॉडल: अंधेरे में पीने और दो बोतल विकल्प
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Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).

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