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Medicine

알코올 중독에 대 한 Pharmacotherapies의 개발 모델을 마시는 murine: 어둡고 2 병 선택에 마시는

doi: 10.3791/57027 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

알코올 사용 장애 (AUD) 주요 국가 건강 문제가 고 더 효과적인 치료법의 개발이 환자 인구의 요구를 오프셋 하는 데 필요한. 이 위해 다음 프로토콜 리드 안티 알코올 화합물의 임상 효능을 평가 하기 위해 두 가지 간단한 설치류 마시는 모델을 활용 합니다.

Abstract

알코올 사용 장애 (AUD)와 주요 문제는 보다 더 약된 76 백만 사람들 전세계 진단 기준에 부합. 현재의 치료는 크게 효과가 정신 결합 하는 경우에 개입, 높은에 의해 분명 것으로 재발 율 3 FDA 승인 약품에 제한 됩니다. 따라서, 더 새로운 치료에 대 한 검색 중요 한 공중 보건 목표를 나타냅니다. 이 위해 다음 프로토콜 리드 안티 알코올 화합물의 임상 효능을 평가 하기 위해 두 가지 간단한 설치류 마시는 모델 활용: 2 병 선택 (TBC)과 어둠 (DID)에 마시는. 전 적당히 자발적인에 쥐를 유도 하는 동안 자발적인 음료를 쥐 술자리를 모방 하는 짧은 기간에 많은 양의 알코올 소비 수 있습니다. 이러한 패러다임의 둘 다의 간단 하 고 높은 처리량 특성 약리 에이전트의 신속한 심사에 대 한 또는 식별 특정 자발적인 마시는 행동 하는 쥐의 긴장에 대 한 허용.

Introduction

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지난 25 년 동안, 플러스 상당한 노력 알코올 사용 장애 (AUD)1의 치료를 위해 약물을 개발 하는 쪽으로 넣어 왔다. 비록 많은 발전 한 AUD 여전히 남아 중요 한 공중 위생 문제 이상의 18 백만 미국인에 영향을 미치는 220 십억 달러 이상 비용이 매년2,3. 현재 3 FDA 승인 약품, disulfiram, naltrexone, 그리고 acamprosate, 임상 시험 및 한정 된 성공 조차 병원 설정에서 사회 심리적인 내정간섭과 결합 될 때 일관성 없는 결과 굴복 했다 모두는 있다 4 , 5 , 6 , 7.

현재 AUD 치료의 실패에 대 한 주요 이유는 AUD8의 이기종 특성에 연결 된다. 환경 및 유전적 요인 AUD의 발전에 기여, 동안 상속 가능성 발병9의 위험의 약된 50-60%를 차지 한다. 우울증의 치료와 마찬가지로, 그것은 널리 허용 AUD 고통 받아 환자 환자 각10의 요구에 맞게 맞춤형 약물의 다양 한 필요 합니다.

명확 하 게, 보다 효과적인 치료 약물 발견의 이미 힘든 시간이 걸리는 과정 간소화3경우 촉진 될 것 이라고 위한 긴급 한 필요가 있다. 이 위해 다음 프로토콜 두 설치류 마시는 모델 널리 AUD11의 neurobiological 기초를 검사 하는 데 사용의 임상 적용을 보여줍니다. 여기 소개 하는 방법 알콜을 감소에서 후보 화합물의 효능을 평가할 수 있습니다 좀 더 구체적으로, "중간"와 "마시는 파티" 시나리오 2 병 선택 (TBC)을 활용 하 고 어두운 (DID) 패러다임에서 마시는 소비 각각. 두 패러다임 검사 비 조작 에탄올 자기 관리, 그것에 의하여 쥐 구두로 고 지에서 에탄올을 섭취 및 따라서 높은 얼굴을 설명 및 유효 인간의 알코올 중독11의 모델을 구성 합니다.

TBC 음주, 일컬어 자유 선택 음주, 음주, 환경 설정 또는 사회적 음주, 솔루션의 두 병 홈 장에 지속적으로 사용할 수 있습니다. 한 병 들어 물, 그리고 에탄올, 에탄올의 농도 변화 될 수 있다 그것에 의하여의 희석된 솔루션을 포함 (., 5-30 %v / v)11,12. 쥐 두 병 계속 액세스할 수 있고 따라서 얼마나 마시는 각 병에서 선택할 수 있습니다.

이 모델은 에탄올 선호 비율 (에탄올 소비 ÷ 총 볼륨 액체 소모의 볼륨) 뿐만 아니라 각 마우스 (g/kg)의 에탄올 소비를 평가 합니다. 그것은 정기적으로 또는 특정 유전자 조작 후 쥐의 다른 긴장에서 음주 레벨을 비교 하는 (., 유전자 녹아웃 또는 최저) 및 혈액 에탄올 농도 (BECs) 인간에서 무엇을 발견 비슷한 결과 때 적당히13,14에서 음주.

DID 절차, 어두운 주기의 시작 후 3 h 물 홈 케이지 병 마시는 세션 제한 된 액세스에 대 한 20% (v/v) 에탄올 솔루션의 병으로 교환 됩니다. 마시는 세션 하루에 4 연속 4 일 주기, 1-3 일 지속 2 h 4 h로 발생합니다. 일 1-3 주 4에 테스트 하기 전에 알코올 요법이 니 기간 역할을 합니다. 따라서, 마우스 안정적으로 BECs 달성 하기 위해 충분 한 에탄올 소비 > 100 mg/dL와 그 결과,13,,1415마시는 binge는 인간에서 발견 하는 중독의 행동 효과 전시. 물 접근은 항상 마시는 세션 이외에 사용할 수 있습니다.

제한 된 액세스 술의 몇몇 변이가 있다. 예를 들어 간헐적으로 액세스 모델에서 마우스 받을 두 병 (1 개의 포함 물과 다른 포함 20% (v/v) 에탄올) 월요일, 수요일, 그리고 금요일에만 평일 및 주말, 각각1624 시간 및 48 h 철수 기간. 간헐적인 액세스의 몇 주 후 쥐 조금씩 하 고 자발적으로 결국 달성 BECS 무엇 DID 모델에서 관찰은 비슷한 수준의 음주를 확대 시킨다. 그러나 DID,, 파티 같은 마시는 행동을 평가 하기 위해 가장 일반적으로 사용 모델에 나타납니다. 간헐적으로 마시는 다른 모델 존재 하지만 그들은 음식에 대 한 액세스를 제한에 의존 하거나 증기 챔버 유발 증가 그들에 게 자발적인 인간의 알코올 소비16의 더 적은 대표를 시키는 자발적인 자기 관리.

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Protocol

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여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 남부 캘리포니아 대학 보건 과학 캠퍼스의 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다.

1. 실험 설치 및 조립

  1. 다음 공급 및 화학 연구를 시작 하기 전에 모든 취득: 쥐, 새 장/금속 케이지 정상, 침구, 음식, 물, 에탄올, pipets, sipper 상판, 수축 포장, 유틸리티 나이프, 우편 넥타이, 테이프, 분 젠 버너, 규모, 전조 등.
  2. 가져올 C57BL/6J 쥐, 상용 소스 또는 사내 식민지에서 쥐 그룹 테스트의 시간까지 보관 될 수 있음을 염두에서에 유지.
    참고: 마우스 조달의 총 수는 실험 디자인의 복잡성에 따라 달라 집니다. 그룹, 파일럿 연구 그룹 당 5-7 마우스 보다 더 작은 당 대략 12-15 마우스에 맞게 계획 합니다. 아래 대표 결과에 우리는 약물 (MOX)의 단 하나의 복용량 (5 mg/kg)를 사용 하 여 원인-효과 관계를 평가 하기 위해 간단한 2-그룹 설정 활용.
  3. 18병 조합 하려면 다음 단계를 따릅니다.
    1. 열 분 젠 버너를 사용 하 여 유틸리티 나이프.
    2. 이 칼을 사용 하 여, 대략 인치 플라스틱 18 mL 혈 청 학적인 피펫으로의 위쪽과 아래쪽 끝을 잘라.
      1. Note 작은 볼륨 pipets (, 10 mL)는 측정의 정밀도 증가 또한 사용할 수 있습니다.
    3. 총 열 아래 피펫으로 따뜻한.
    4. 피펫으로 (즉, 18 mL 대시 라인에 가장 가까운 개방)의 "바닥" 끝에 볼 베어링 sipper 튜브를 삽입 합니다.
    5. 상업적으로 이용 가능한 수축 포장 총을 사용 하 여 수축 포장을 가진 장소에서 sipper 튜브 인감.
    6. 모자는 다른 실리콘 스 토퍼와 함께 여.

2. 동물 요법이 니

  1. 실험적인 절차 그들은 (주위 온도 (21 ± 1 ° C) 및 12-h 포함 농업 조건에 적응 수 있도록 실시 하 방 쥐 전송 실험의 시작 날짜 이전에 적어도 1 주를 시작, 반대로 빛과 명암 주기에서 12 시에). 기관 지침 및 다른 한 위치에서 동물을 이동 하기 전에 적절 한 채널을 통보 해야 합니다.
    1. 마우스는 표준 명암 주기에서 전송 되는 경우 추가 요법이 니 시간 2 주 소요 됩니다.
  2. 테두리에 새로 만든된 병 물으로 채우십시오. 안전 하 고 어떤 기포 또는 주 둥이에서 누수가 없는 모자 닫혀 있는지 확인 합니다. 솔루션을 유출 하는 경우 다시 뚜껑을 보안 합니다. 단순히 공기 튜브를 피할 수 있도록 병을 도청 하 여 모든 기포를 제거 합니다.
  3. 도착 시 단일 집 침구와 금속 그리드 케이지 상단; 표준 폴 리 카보 네이트/polysulfone 장에 각 마우스 그것은 더 이상 사용 될 때 케이지 뚜껑을 제거 합니다.
    1. 음식과 water bottle(s) 광고 libitum에 대 한 액세스를 제공 합니다.
    2. 장소에 그것을 잡아 각 병 주위 플라스틱 지퍼 넥타이 포장 하 여 각 병 케이지 상단에 보안. 감 금 소에 밀려 하지 않습니다 있도록 우편 넥타이에서 어떤 과잉 플라스틱 트림.
      참고: 어두운 (DID) 절차에서 마시는 물 한 병만이 필요 합니다. 그러나 2 병 선택 (TBC) 패러다임에 habituation, 케이지 설정 물 두 병을 포함 해야 합니다. 금속 그리드 호퍼 제공 솔루션의 단일 병만를 보유 하도록 설계 하는 경우 부드럽게 구 부 떨어져 TBC에 대 한 두 번째 병에 맞게 추가 접시에 대 한 공간을 창조 하는 바.
  4. 3 마우스 무료 제어 케이지를 설정 합니다. 이것은 감 금 소는 켜고 케이지 랙 배치로 일이 단순히 자연 발생 되는 병에서 증발 또는 흘림으로 인 한 유체 손실의 모니터링에 대 한 수 (2.6.3, 3.6.1, 및 4.6.1 방정식에 대 한 단계를 참조 하십시오).
  5. 주 1 주 하나의 주택 새 환경 순응의 4에 시작, 측정 하 고 기록 뿐만 아니라 기록의 가장 높은 지점에 거꾸로 병 함께 에칭을 사용 하 여 물 섭취 량 (그램)에서 규모를 사용 하 여 각 마우스의 매일 음식과 몸 무게는 (mL)에서 초승달 모양입니다.
    1. 그것은 오목한 초승달의 가장 낮은 지점 읽을 표준 과학적인 연습은 병 측정 동안 거꾸로 위치에 남아 있기 때문에, 초승달 모양의 가장 높은 지점을 기록 합니다.
  6. 아래의 방정식을 사용 하 여 2.5의 매개 변수를 평가:
    1. (G)의 몸 무게 변화를 측정: 현재 날짜 (g)-전날 (g)의 무게의 무게.
    2. 음식 섭취 량 (g)를 측정: 전날 (g)-현재 날 (g) 식품의 무게에 음식의 무게.
    3. 물 섭취 량 (mL)을 측정: 모든 제어 연습장 (mL)에서 [현재 하루 (mL)-전날 (mL)에 물이 볼륨에 볼륨]-평균 물 손실.
  7. 에탄올의 도입 직전 3 일에 대 한 초기 계획의 결정에 대 한 허용 하도록 5-7 일에 연속적으로, 2.5 단계를 반복 합니다. 연속 기록 수집 수 없습니다, 경우 기준선 측정의 평가 대 한 허용 하도록 새 환경 순응 기간 연장.
  8. 물 섭취 량은 지난 3 일의 평균에서 ± 10% 변동에 안정, 일단 TBC (무제한 액세스) 또는 (제한 된 액세스) DID 에탄올 액세스를 시작 합니다.
    참고: 드문 경우에, 1 ~ 2 일 더 필요할 수 있습니다이 안정성을 달성 하는 과목 지난 3 일의 평균에서 ± 10% 변화를 표시 하는 값에 대 한 추가 시간이 필요한 경우 놀라지 않습니다.

3. 24 시간 2 병 선택 (TBC)

참고: 회로도 그림 1에 준비가 되어 있습니다.

  1. H2O; 447.35 mL 52.65 mL 190 증거 곡물 에탄올 (~ 95% 에탄올)을 추가 하 여 500 mL 볼륨에서 10% (v/v) 에탄올 용액 준비 철저 하 게 악수를 해야 합니다. 에탄올 증발 신속 하 게, 모든 3-4 일의 간격에서 솔루션을 교체 합니다.
    참고: 다른 농도의 에탄올 뿐만 아니라, 사용할 수 있습니다 하지만 저자 추천이 모델에 대 한 10%의 농도.
  2. TBC의 첫번째 날에 (초기에 하루 8) 각 장에 2 물 병 1 빈 그리고 테두리에 갓된 에탄올 솔루션에 채워. 에탄올과 물은 어려운 고유 시각, 그에 주어진 명확 하 게 그들의 해당 내용으로 병 라벨. 단순히 병에 직접 병에 테이프를 마스킹 및 서 면으로 표시와 함께 또는 라벨의 조각 적용.
  3. 필요에 따라 물 병을 더 많은 솔루션을 추가 합니다.
  4. 다시 케이지, 모두 대문자 안전 하 게 폐쇄 확인 하 고 어떤 기포 또는 주 둥이에서 누수가 없는 병을 놓습니다. 솔루션을 유출 하는 경우 다시 뚜껑을 보안 합니다. 단순히 공기 병을 피할 수 있도록 병을 도청 하 여 모든 기포를 제거 합니다.
  5. 대체 병으로 매일의 위치 조절된 장소 특혜 관련에 대 한 올바른 음주 활동에 영향 (대 한 자세한 내용 참조).
  6. 2.5 및 2.6에서 일일 측정 이외에를 읽고 기록 뿐만 아니라 에탄올 섭취 수준 시작 진행 되었습니다. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 10% 에탄올 섭취와 선호 비율 분석:
    1. 측정 10% 에탄올 섭취 량 (mL): [현재 하루 (mL)-이전 날 (mL) 에탄올의 볼륨에 에탄올의 볼륨)]-평균 모든 제어 연습장 (mL)에서 에탄올 손실.
    2. 측정 10% 에탄올 섭취 량 (g/kg): [10% 에탄올 섭취 량 (mL) 0.07893 g/mL x] / 몸 무게 (kg).
    3. 측정 기본 설정 %: [10% 에탄올 섭취 량 (mL) / 물 (mL)] x 100.
  7. 최대한 빨리 에탄올 섭취는 안정 되 고, 매일 측정 루틴 동안 각 마우스를 단일 컨트롤 (염 분) 복 (i.p.) 주입 (체중의 0.01 mL/g)을 관리 합니다. 이 방법에서는, 주제 자체 주사에 익숙한 될.
    1. 안정성 (섹션 2.8와 동일)는 지난 3 일의 평균에서 ± 10% 변동으로 정의 됩니다.
      참고: 그것은 에탄올 안정화 수준에 대 한 최대 1 주를 걸릴 수 있습니다. 이것은 특히 사실 마우스 다시 이전 실험에서 사용 되 고 에탄올에 이전 노출 했다입니다. 컨트롤은 단순히 약물을 분해 하는 데 사용 용 매.
  8. 낮은 가변성 에탄올 기준선 주입으로 쥐를 분할 다시 설정 되 면 모든 그룹이 대략 비슷한 에탄올 섭취 량 값을 사용 하 여 그룹 에탄올 섭취 값 평균.
    1. (식 염 수를 받을 계속) 제어 및 실험으로 다른 한 그룹 지정 (체중의 0.01 mL/g에서 조사 약물의 i.p. 주입). 매일 약물 주입, 급성 또는 기간 중 하나를 시작 합니다. 그 후, 컨트롤 후 약물 효과 (선택 사항) 테스트 다시 도입 될 수 있습니다.
      참고: 24 h 장기간에 걸쳐 술을 모니터링 하기 때문에 복용량 관리의 시간 사용는 어두운 주기에 의존 합니다.

4. (한) 어둠 속에서 마시는

참고: 회로도 그림 3에 준비가 되어 있습니다.

  1. 예약 된 에탄올 액세스의 매일에 (일 1-4) 물 볼륨, 음식 섭취 량, 및 몸 무게, 측정, 기록 하 고 약물 주입을 수행. 화합물에 약물의 약 동학에 따라 선택은 빛 주기 동안 미리 시간 동안 이렇게 / 또는 음주 기간 동안 최대 두뇌 농도 접근.
    참고: 일 1-3는 간단히 적응 시간의 짧은 기간에 에탄올의 풍부한 레벨을 마시는 쥐 의미 기억. 반면 쥐 BEC 레벨 인간의 0.08; 비교에 도달 하지 않습니다 이러한 "훈련" 일을 하루에 4, 약간 이상 마시는 세션 동안 그들은 마실 것 이다 실제로 그 수준에 있는지 확인 합니다.
    1. 하루에 4 모든 쥐 일 1-3, 그리고 제어 또는 마약에 컨트롤 (염 분)을 제공 합니다. DID 이렇게 약물 (주 2), 및 포스트 약물 (주 4) 마시는 세션 사전 마약 (주 1)을 포함 3 주간의 기간 동안 발생 합니다.
    2. 참고: 약물 주입 주 동안 유의 3 일 에탄올 섭취 레벨은 두 그룹의 에탄올 섭취 수준을 최소 가변성에 있는 방법으로 컨트롤이 나 약물 그룹 중 하나에 쥐를 할당 하는 데 사용 됩니다. 이것은 달리 TBC, 3 일의 평균에 따라 그룹을 할당 합니다.
  2. 500ml 볼륨에 H2O; 394.75 mL 105.25 mL 190 증거 곡물 에탄올 (~ 95% 에탄올)을 추가 하 여 준비 하는 20% (v/v) 에탄올 솔루션 (20E) 철저 하 게 악수를 해야 합니다.
  3. 그렇게 물 병 단순히 알코올 병으로 대체 될 수 있다는 DID 시작 하자마자 마시는 세션의 시작 하기 전에 에탄올 병을 입력 합니다.
  4. 전체 DID 세션 (4.5-4.8 단계) 동안 동물을 방해 하지로 레드-라이트 전조 등을 사용 합니다.
  5. 마시는 세션, 어두운 사이클에 3 시간을 시작 하는 DID의 시작에서 각 마우스에 대 한 물의 양을 기록 합니다. 다음, 20E 솔루션의 병 각 물 병을 대체 하 고 시작 에탄올 볼륨 기록 합니다.
  6. 읽기 하 고 일 1-3에 마시는 세션 및 나중에 4 일 4 시간의 끝에 2 시간 후, 최종 에탄올 볼륨을 기록 합니다. 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 20% 에탄올 섭취 량을 분석 합니다.
    1. 측정 20% 에탄올 섭취 량 (mL): 모든 제어 연습장 (mL)에서 술 마시는 세션 (mL)의 시작에서 에탄올의 부피 (mL)-세션의 끝에 에탄올의 [볼륨]-평균 에탄올 손실.
    2. 측정 20% 에탄올 섭취 량 (g/kg): [20% 에탄올 섭취 량 (mL) 0.15786 g/mL x] / 몸 무게 (kg).
  7. 일에 4만, 에탄올 볼륨, 기록한 후 즉시 다시 액세스를 도입 하기 전에 물에, 각 마우스 (옵션)의 혈액 에탄올 농도 평가 하기 위해 혈액을 수집 합니다.
    참고: 모든 비 터미널 혈액 수집 방법 사용할 수 있습니다, 레트로 궤도 공동 혈, 또는 saphenous 정 맥 혈 등. 유용한 프로토콜 참조 Parasuraman 에 대 한 참조 21 , Yardley 외. 20.
    1. LCMS, 또는 상업적으로 사용할 수 있는 기계를 포함 하 여 다양 한 방법을 사용 하 여 분석 수행 ( 재료의 표참조).
  8. 모든 에탄올 병을 물 병 및 기록 물 볼륨으로 바꿉니다.

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Representative Results

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다음 대표 조사에서 사회 음주는 모델링 2 병 선택 (TBC) 패러다임을 사용 하 여. 간단히, 마우스 중 하나는 물, 그리고 다른 10% (v/v) 에탄올 솔루션을 포함 하는 솔루션의 2 개의 병에 접근을 했다. 과목 이후 분할 되었고 균등 하 게 할당 약물 치료 그룹, moxidectin (MOX) 염 분 제어 대에 각 그룹 에탄올 섭취 수준을 최소한 변이의 평균 것입니다.

24 시간 기간 동안 초기 기준선 10E 섭취 14.46 ±에 안정 1.85 g/kg (n = 8) 주사, 시작 하 고 이후 다시 14.14 g/kg에서 안정화 하기 전에 식 염 수 주사를 게시. 급성 (5 mg/kg)의 복용량 MOX 에탄올 섭취와 기본 설정의 효과 평가 하기 위해 마시는 활동 평가 사전 MOX, MOX, 및 사후 MOX 이었다. 우리는 MOX의 단 하나의 복용량 크게 사전 MOX 주사에 비해 45% 이상의 알코올 섭취를 감소 발견 [F (2, 22) 26.33, p = < 0.0001] (그림 2A), 및 기본 설정 [F (2, 14) 17.35, p = < 0.0001] (그림 2B ) 30%를 초과. 10E 섭취 및 기본 설정 MOX 치료 직후 하루에 염 분 보다 크게 낮은 남아 (이상 25%와 15% 각각) 그림 2에서 MOX 주사를 게시로 표시).

게시 되지 않은 파일럿 연구에서 사용 하 여 마우스 매일 액세스 (2 시간) 제한 했다 그것에 의하여 어두운 (DID) 절차에서 술 한 병 포함 20E 시작 3-h circadian 어두운 단계는 더 이상 액세스와 3 일 연속으로 모델링 했다 술자리 기간 (4 h) 하루에 4 (그림 4). 여성 쥐 (n = 12, 6 마우스/그룹) 관리 식 염 수 주사 (i.p.) 일에 1-4 기준선 20E 설립한 하루에 4 (약 사전). 일 1-3 2nd 의 주간 주기, 모든 마우스 또 매일 식 염 수 주입을 받았다. 주 3에서에서 에탄올 섭취 값 쥐를 두 그룹으로 분할 하는 데 사용 했다 (n = 6 / 그룹) 이후 한 주사 (i.p.) MOX (5 mg/kg)의 또는 주 4 (마약)에 염 분을 받았다. 모든 마우스 일 1-4와 에탄올 섭취에 매일 식 염 수 주사를 받은 다음 주 4 일 (약 post)에 또 다시 측정 했다. MOX 분석 하 고 54%, 초과 크게 감소 된 알콜 입구를 발견 했다 5 mg/kg의 심각한 관리 사전 약물 주사와 비교 (t = 7.635, p < 0.0001)

Figure 1
그림 1 . 2 병 선택 도식이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.  

Figure 2
그림 2 . 2 병 선택 (TBC). MOX (5 mg/kg)는 10 %v / v 에탄올 (10E) 섭취 량 (A) 와 24 시간 액세스 2 병 선택 패러다임을 사용 하 여 여성 C57BL/6J 생쥐에서 기본 설정 (B)를 감소 시킨다. 3 일 연속에 대 한 안정적인 음주 레벨을 달성 후 MOX 관리 되었다. 바 (화이트; MOX 주입 전날에서 평균 10E 섭취 수준을 나타내는합니다 MOX 중), MOX 주입 (블랙;의 하루 MOX) MOX 주입 (회색; 후 주 게시물 MOX)입니다. 값 12 마우스에 대 한 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001, 그리고 * * * P < 0.0001 대 사전 MOX (왼쪽 가로줄) 또는 게시 MOX (오른쪽 수평 라인), Tukey의 다중 비교 게시물 임시 테스트. Huynh N. 에서 수정. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 어두운 도식에서 마시는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.  

Figure 4
그림 4 . (한) 어둠 속에서 마시는. MOX (5 mg/kg) 어두운 패러다임에서 음주를 사용 하 여 여성 C57BL/6J 쥐에서 20 %v / v 에탄올 (20E) 섭취를 줄일 수 있습니다. 바는 MOX 주입 (약)의 주 및 MOX 주입 (후 마약) 후 주 MOX 주입 (약 사전), 이전 주에 평균 20E 섭취 수준을 나타냅니다. 값은 식 염 수와 MOX 그룹 사이 12 마우스 (6/그룹)에 대 한 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. P < 대 사전 마약 (왼쪽 가로줄) 또는 사후 약물 (오른쪽 수평 라인), Tukey 0.0001의 여러 비교 게시물 임시 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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전세계 추정으로 76 백만 명 영장 진단 알코올 사용 장애 (AUD)에 대 한 기준을 충족 나타냅니다. 불행히도, 현재 사용할 수 있는 제약 치료는 크게 효과적 이며 추가 개발이 임상 인구20의 요구를 오프셋 하는 데 필요한. 이 위해 다음 두 패러다임을 마시는 가장 기본적인 설치류의 예증으로이 노력을 촉진을 목표로 프로토콜: 2 병 선택 (TBC)과 어둠 (DID)에 마시는. 두 모델 모두 에탄올, 그것에 의하여 쥐 구두 에탄올 섭취의 비 조작 자체 관리 측정. TBC 패러다임, 에탄올 (10 %v / v) 및 물에 모두 사용할 수, 에피소드 및 점진적 에탄올 소비 패턴의 결과 대 등 하 게 낮은 혈액 에탄올 수준에서 결과. 이 모델 tastant 기본 설정으로 에탄올 섭취의 낮은 수준 평가 대 한 최고의 이며 따라서 인간의 "적당 한" 음주와 비슷한 수 있다. 위의 그림 2 TBC 패러다임에 대 한 대표적인 결과 보여줍니다.

다른 한편으로는 DID 모델 에탄올 (20 %v / v)에서는 사용할 수 있는 제한 된 시간 동안입니다. TBC, 달리이 모델에는 C57BL/6J 쥐 소모 됩니다 많은 양의 에탄올 매우 신속 하 게 자신의 circadian 주기의 가장 활성 단계 동안 사실의 활용, 에탄올의 농도 행동 관련 화합물의 효과 평가 합니다. 이러한 음주 세션 시작 하는 3rd 어두운 주기, 하루에 4 일 1-3 및 4 h 2 h의 기간으로 h 4 일 연속에 대 한 발생 합니다. 이 절차를 사용 하 여 마우스 일반적으로 BECs 달성 하기 충분 한 에탄올 소비 > 100 mg/dL와 중독의 행동 증거 전시. DID 패러다임에 대 한 우리의 대표 결과 그림 4에 나와 있습니다. BECs 이러한 마우스에 대 한 측정 하지 않았다, 비록 그들의 음주 레벨은 100 mg/dL13,,1415BECs 달성 문학에서 보고 그 비슷합니다.

두 패러다임은 한계를 가진다. 인스턴스 동안 구두 gavages는 리드 화합물의 약리 시험 관리의 기본 방법 때 프로시저에 의해 발생 하는 esophogeal 외상 두 패러다임에서 에탄올 자체 관리 방해 수 있습니다. 이 특히 DID 모델, 에탄올 (20%)의 높은 농도 사용 하 고 있는 현재 인스턴스 약물의 약 동학 동물 전에 시작을 마시는 세션을 필요로 했다 할 수 있습니다에서 회복 하기 위해 적절 한 시간에 절차입니다. 이 예상된 0.08 이하로 BECs에 해당 하는 수준에서 마시는 컨트롤 그룹에 분명 있을 것 이다. 우리 실험실에서 우리 힘 수 유 모두 DID와 TBC와 함께 어려움을 경험 했다. 우리는 우리의 화합물을 공식화 하는 그들은 구두로 녹이는 얇은 스트립 (ODS)19를 사용 하 여 전달 될 수 있도록 하 여 이러한 문제를 해결할 수 있었다.

또한, 한 모델에 특히, 에탄올 액세스 기간은 너무 짧은 기간에 사실을 감안할 때 마약 투약 할 수 있어야 합니다 약물의 약 동학에 따라 선택은 빛 주기 동안 미리 시간 동안 그렇게는 화합물에 / 또는 최대 두뇌 집중 음주 기간 동안 접근. Pharmacokinetic 분석을 수행할 수 없습니다, 다른 접근 TBC를 사용 하 여 약물의 행동 효과의 시간 과정 평가 될 것 이다. 이 논리에 따라 시간 단위로, 마시는 활동을 모니터링 하 고 피크 안티 알코올 효과 결정 한 수 합리적 전략 때 마약 관리19.

알코올 중독의 필드는 AUD8의 다양 한 생리 및 행동 측면을 조사 하는 다양 한 동물 모델, 다음 프로토콜 설명 두 가지 일반적으로 사용 되 패러다임에서 결과의 비교에 대 한 수 있는 실험실입니다. 두 번째 이점은 이러한 방법은 간단, 편리 사용 급성과 만성 연구 기간 동안 위에 제공 된 예제와 비슷한 것입니다. 또한, 조작 및 증기 챔버 패러다임 등 다른 일반적으로 사용 되 알코올 패러다임와 달리 우리는 여기에 설명 된 방법을 수행할 수 있습니다 밖으로 특수 장비에 대 한 필요 없이. Anecdotally, 그것은 원형 기관 물고기에서 마시는 기구의 거의 모든 구성 요소를 찾을 수 있습니다. 또한 다양 한 방법으로 그들은 각 실험의 목표에 맞게 수 있도록 여기에 설명 된 프로토콜을 변경할 수 있다. 예를 들어, 우리의 DID 절차는 단일 마시는 세션 (주 4 일) 동안에 약물의 급성 효과 테스트에 적합 합니다. 그러나, 우리는 여러 날 마약 투약 평가 될 수 있다 4 일 연속 2 시간 액세스, 1-3 일과 4 일19에 4 시간에 대 한 액세스의 현재 2 시간 반대를 마시는 세션을 보강 하 여 나타났습니다. 마우스도 하나에서 전송 될 수 있습니다 다른, 또는 다시 추가 복용에 대 한 테스트 / 다른 패러다임 화합물, 간단한 1-2 주 유실 기간의 사이.

그것은 이러한 방법을 통해 관찰 음주에 마약 유도 된 변화 효과 알코올에 대 한 선택적 여부 또는 그들이 독성의 결과 있을 경우 확인 하려면 철저 하 게 조사 되어야 한다는 언급 되어야 합니다. 에 대 한 자세한 내용은 컨트롤 독자 Yardley 참고 해야 합니다. 20 아니 하나의 패러다임이이 상황의 모든 측면을 모델링할 수 있습니다. 대신, 각 패러다임은 일반적으로 AUD.와 관련 된 주요 특성의 몇 가지 검사 여기서 설명 하는 DID 모델과 TBC 중독 사이클의 파티/중독 단계에 연결 되었습니다. 화합물의 유틸리티에 대 한 더 철저 한 이해, 여러 전 임상 마시는 모델을 활용 합니다.

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Disclosures

DLD와 라는 기 생선 충 약의 재사용에 대 한 특허와 관련된 avermectins 알코올 사용 장애의 치료에 대 한 발명가. 저자 다른 충돌의 관심을가지고 있으며 전적으로 종이의 과학적 내용에 대 한 책임.

Acknowledgments

이 작업을 지원 했다, 부분적으로, 연구에 의해 부여 SC CTSI NIH/NCRR/NCATS-UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.), 그리고 약국의 USC 학교.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L  graduated cylinder VWR https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle Pyrex (Fisher Scientific) https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 To prepare ethanol solution.
Analox One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes Ancare Corp. http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice Jackson lab https://www.jax.org/strain/000664 May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged 10 mL, 18 mL, or 25 mL 
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC Decon Labs (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec ---
heat gun  Master Appliances Corp. http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing --- --- Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade --- --- ---
metal cage plate --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale Ohaus (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus ---
red light headlamp nyteBright (Amazon) https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 ---
silicone stoppers Fisher --- ---
thermometer Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 ---
weigh boat VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative

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References

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알코올 중독에 대 한 Pharmacotherapies의 개발 모델을 마시는 murine: 어둡고 2 병 선택에 마시는
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Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).More

Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).

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