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Medicine

Murine beber modelos en el desarrollo de farmacoterapias para el alcoholismo: en la opción oscurezca y dos botellas

doi: 10.3791/57027 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Trastorno de uso de alcohol (AUD) es un problema de salud nacional y el desarrollo de tratamientos más eficaces es necesaria para compensar las necesidades de esta población de pacientes. Para ello, el siguiente protocolo utiliza dos modelos de consumo roedores simple para evaluar la eficacia preclínica de compuestos de plomo contra el alcohol.

Abstract

Trastorno de uso de alcohol (AUD) es un problema importante con más de un aproximadamente 76 millones de personas en todo el mundo cumpliendo los criterios de diagnóstico. Los tratamientos actuales se limitan a tres medicamentos aprobados por la FDA que son en gran parte ineficaces, incluso cuando se combina con psicosociales de intervención, como es evidente por la alta recaída tasa. Como tal, la búsqueda de tratamientos más nuevos representa un objetivo de salud pública. Para ello, el siguiente protocolo utiliza dos modelos de consumo roedores simple para evaluar la eficacia preclínica de compuestos de plomo contra el alcohol: elección de dos botellas (por confirmar) y bebiendo en la obscuridad (DID). El primero permite ratones voluntaria beber con moderación mientras que el segundo induce ratones voluntaria consumen una gran cantidad de alcohol en un período corto que imita el consumo concentrado. La naturaleza simple y alto rendimiento de ambos de estos paradigmas permiten para la detección rápida de agentes farmacológicos o para la identificación de cepas de ratones que presentan cierto comportamiento consumo voluntario.

Introduction

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Durante los últimos 25 más años, se ha puesto un esfuerzo importante en el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de trastorno de uso de Alcohol (AUD)1. Aunque se han logrado muchos avances, AUD todavía sigue siendo un problema de salud pública importante, que afecta a más 18 millones de americanos y cuestan sobre $ 220 billones anualmente2,3. En la actualidad existen tres medicamentos aprobados por la FDA, disulfiram, naltrexona y acamprosato, todos los cuales han arrojado resultados inconsistentes en ensayos clínicos y éxito limitado incluso cuando se combina con la intervención psicosocial en los entornos clínicos 4 , 5 , 6 , 7.

La razón principal de fracasos de la terapia actual AUD está ligada a la naturaleza heterogénea de AUD8. Mientras que factores genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo de la AUD, heredabilidad representa aproximadamente el 50-60% del riesgo de inicio9. Similar al tratamiento de la depresión, está ampliamente aceptado que pacientes que sufren de AUD tendrá una variedad de medicamentos que están diseñados para satisfacer las necesidades de cada paciente10.

Claramente, hay una urgente necesidad de tratamientos más efectivos que se facilitaría si el proceso ya difícil y desperdiciador de tiempo del descubrimiento de fármacos fueron racionalizados3. Para ello, el siguiente protocolo demuestra la aplicabilidad preclínica de dos modelos de bebidas roedores ampliamente utilizado para examinar la base neurobiológica de AUD11. Más específicamente, el método introducido en el presente documento puede evaluar la eficacia de compuestos candidatos reducir alcohol consumo "moderado" y "borracheras" escenarios utilizando la opción de dos botellas (por confirmar) y beber en los paradigmas (DID) oscuros, respectivamente. Ambos paradigmas examinan autoadministración del etanol no operante, por el que ratones ingieren de etanol por vía oral y en la voluntad y por lo tanto ilustrar cara alta y construcción la validez como un modelo de alcoholismo humano11.

En TBC beber, también conocido como libre elección beber, beber, de preferencia o beber social, dos botellas de solución están continuamente disponibles en la jaula del hogar. Una botella contiene agua, y el otro contiene una solución diluida de etanol, por el que se puede variar la concentración de etanol (por ej., 5-30% v/v)11,12. Los ratones tienen acceso constante a dos botellas y por lo tanto, pueden elegir cuánto beber de cada botella.

Este modelo evalúa el consumo de etanol de cada ratón (g/kg), así como la relación de preferencia de etanol (volumen de etanol consumida ÷ volumen total líquido consumido). Habitualmente se utiliza para comparar niveles de consumo a través de diferentes cepas de ratones, o después de una manipulación genética específica (e.g., golpe de gracia del gene o caída) y resultados en concentraciones de etanol de sangre (BECs) similares a lo que se encuentra en los seres humanos cuando beber en moderación13,14.

En el procedimiento DID, 3 h después del inicio del ciclo oscuro, la botella de casa jaula de agua se intercambia con una botella de solución de etanol 20% (v/v) para un acceso limitado a beber de la sesión. Las sesiones de bebida se producen como un ciclo de 4 días consecutivo, duración 2 h días 1-3 y 4 h en día 4. Días 1-3 sirven como un periodo de habituación de alcohol antes de la prueba el día 4. Por lo tanto, ratones confiablemente consumirá suficiente etanol para lograr BECs > 100 mg/dL y como consecuencia, los efectos conductuales de la intoxicación en humanos que consumo concentrado de alcohol13,14,15. Acceso al agua está disponible en todo momento que no sea la sesión beber.

Hay varias variaciones del acceso limitado. Por ejemplo, en el modelo de acceso intermitente, ratones reciben dos botellas (una agua que contiene y otros que contengan etanol 20% (v/v)) sólo el lunes, el miércoles y el viernes con un tiempo de espera 24 h y 48 h en días laborables y fines de semana, respectivamente16. Después de varias semanas de acceso intermitente, los ratones se poco a poco y voluntariamente aumentar tomando niveles, logrando finalmente BECS similar a lo que se observa en el modelo DID. El DID, sin embargo, parece ser el modelo más utilizado para evaluar el comportamiento de beber compulsivo-como. Existen otros modelos de consumo intermitente, pero se basan en restringir el acceso a alimentos o vapor cámara inducido aumenta en autoadministración voluntaria, que los hace menos representante del alcohol humano voluntario consumo16.

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Protocol

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Todos los procedimientos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités de uso de lo Campus de Ciencias de la salud de University of Southern California.

1. montaje y configuración experimental

  1. Adquirir la totalidad de los siguientes suministros y productos químicos antes de iniciar el estudio: ratones, metal y jaulas jaula tops, ropa de cama, alimentos, agua, etanol, pipetas, tapas de sorber, shrink wrap, cuchillo, ataduras de cremallera, cinta, mechero Bunsen, escala, faro.
  2. Obtener ratones C57BL/6J, ya sea de una fuente comercial o una colonia interna, teniendo en cuenta que los ratones pueden ser grupo ubicado hasta el momento de la prueba.
    Nota: El número total de ratones adquiridos depende de la complejidad del diseño experimental. Plan para acomodar aproximadamente 12-15 ratones por grupo, con no menores que 5-7 ratones por grupo de estudios piloto. En los resultados representativos que se muestra a continuación se utilizó una configuración simple de dos grupos para evaluar la relación causa-efecto con una sola dosis (5 mg/kg) de la droga (MOX).
  3. Siga los siguientes pasos para montar las botellas18.
    1. Calentar un cuchillo con un mechero de Bunsen.
    2. Con este cuchillo, corte aproximadamente una pulgada de los extremos superior e inferior de una pipeta serológica de plástico 18 mL.
      1. Tenga en cuenta que pueden utilizarse también pipetas de volumen más pequeño (es decir, 10 mL) para aumentar la precisión de la medición.
    3. Caliente la pipeta en una pistola de calor.
    4. Inserte el tubo de sorber de cojinete de bolas en el extremo "inferior" de la pipeta (en otras palabras, la apertura más cercana a la línea de tablero de 18 mL).
    5. Sellar el tubo sorber con envoltorio usando una pistola de plástico encogimiento disponibles comercialmente.
    6. Tapa de la abertura con un tapón de silicona.

2. animal habituación

  1. A partir de al menos 1 semana antes de la fecha de comienzo del experimento, los ratones la transferencia a la sala donde los procedimientos experimentales deben llevarse a cabo para que pueda aclimatarse a las condiciones de cría (incluyendo la temperatura ambiente (21 ± 1 ° C) y 12 h claro/oscuro ciclo inverso, con luces apagado en 12:00). Asegúrese de seguir las directrices y notificar a los canales adecuados antes de trasladar animales de un lugar a otro.
    1. Si los ratones se transfieren de un ciclo de luz/oscuridad estándar permiten 2 semanas de tiempo adicional de la habituación.
  2. Llenar las botellas recién hechas hasta el borde con agua. Asegúrese de que la tapa está cerrada firmemente y sin burbujas de aire ni fugas por el pico. En caso de fugas de solución, vuelva a fijar la tapa. Eliminar las posibles burbujas de aire golpeando simplemente en la botella para que el aire puede escapar del tubo.
  3. A su llegada, solo casa cada ratón en jaulas estándar de policarbonato/polisulfona con ropa de cama y una tapa de la jaula de rejilla metálica; Retire la tapa de la jaula que ya no se usa.
    1. Facilitar el acceso a alimentos y water bottle(s) ad libitum.
    2. Asegure cada botella en la parte superior de la jaula envolviendo un lazo plástico del cierre relámpago alrededor de cada botella para mantener en su lugar. Recorte cualquier exceso de plástico de la brida para que no sobresalga en la jaula.
      Nota: Para beber en lo oscuro (DID), se requiere solamente una sola botella de agua. Habituación al paradigma de la elección (por confirmar) de dos botellas, sin embargo, requiere que el montaje de la jaula incluyen dos botellas de agua. Si la tolva rompesacos suministrada está diseñada para soportar solamente una botella de solución, doble suavemente aparte sus bares para crear espacio para una placa adicional dar cabida a la segunda botella para TBC.
  4. Establecer al menos 3 jaulas de libre control de ratón. Esto permitirá el seguimiento de cualquier pérdida de líquidos causada por evaporación o derrame de las botellas, que es simplemente un fenómeno natural que ocurre como jaulas se colocan en y fuera de la rejilla de la jaula (ver paso 2.6.3 3.6.1 y 4.6.1 para las ecuaciones).
  5. A partir del día 4 de la aclimatación de la vivienda solo 1 semana, mida y registre el peso cuerpo y alimento diario de cada ratón, utilizando una escala (en gramos) así como el consumo de agua, con los grabados junto a la botella invertida para grabar el punto más alto de la menisco (en mL).
    1. Si bien es una práctica científica estándar para leer el punto más bajo del menisco cóncavo, porque las botellas permanecen en posición invertida durante la medición, registre el punto más alto del menisco.
  6. Evaluar los parámetros de 2.5 usando las ecuaciones siguientes:
    1. Medir el cambio de peso corporal (g): peso del día actual (g) - peso del día anterior (g).
    2. Medir la ingesta de alimento (g): peso de los alimentos el día anterior (g) - peso de los alimentos en el día actual (g).
    3. Medir la ingesta de agua (mL): pérdida de agua media [volumen de agua en el día actual (mL) - volumen de agua el día anterior (mL)] - de todo control jaulas (mL).
  7. Repita el paso 2.5 consecutivamente, en los días 5-7, para permitir la determinación de una línea base para los tres días inmediatamente antes de la introducción de etanol. Si no se recogerá un registro consecutivo, extender el período de aclimatación para permitir la evaluación de mediciones iniciales.
  8. Una vez que la ingesta de agua se ha estabilizado a la variabilidad de ± 10% del promedio de los últimos 3 días, comienza acceso etanol con TBC (acceso ilimitado) o DID (cupo limitado).
    Nota: En raras ocasiones, uno o dos días adicionales pueden ser necesarias para que materias alcanzar esta estabilidad; no se alarme si se requiere tiempo adicional para que los valores a mostrar variabilidad de ±10% de la media de los últimos 3 días.

3. 24 horas dos botella de elección (por confirmar)

Nota: Se prepara un diagrama esquemático en la figura 1.

  1. Preparar una solución de etanol 10% (v/v) en un volumen de 500 mL agregando 52,65 mL de etanol de grano prueba 190 (~ 95% etanol) a 447,35 mL de H2O; Cerciórese de agite bien. Dado que el etanol se evapora rápidamente, reemplazar la solución en el intervalo de cada 3-4 días.
    Nota: Otras concentraciones de etanol pueden ser utilizadas también, pero los autores recomiendan una concentración de 10% para este modelo.
  2. En el primer día de la TBC, (día 8 en el más temprano) Vacíe 1 de las 2 botellas de agua, en cada jaula y llenar hasta el borde con la solución recién preparada de etanol. Dado que el etanol y el agua son difíciles de diferenciarse visualmente, claramente etiquetar las botellas con su contenido correspondiente. Basta con aplicar un trozo de masking tape a la botella y etiqueta con un marcador o escribiendo directamente en la botella.
  3. Añada más solución a la botella de agua, según sea necesario.
  4. Coloque botellas de nuevo en la jaula, asegurándose de que todos los tapones están cerrados firmemente y sin burbujas de aire ni fugas por el pico. Si la solución es fugas, vuelva a fijar la tapa. Eliminar las posibles burbujas de aire golpeando simplemente en la botella para que el aire puede escapar de la botella.
  5. Alterna la posición de las botellas diariamente como a correcta de preferencia de lugar condicionada relacionadas con influencias en las actividad de beber (ver discusión más).
  6. Además de las mediciones diarias de 2.5 y 2.6, que han sido constante, comienzan a leer y registrar los niveles de ingestión de etanol también. Analizar la relación de consumo y preferencia de 10% de etanol utilizando las siguientes ecuaciones:
    1. Medir 10% etanol toma (mL): [volumen de etanol en la actualidad (mL) - volumen de etanol en el día anterior (mL))]-promedio de pérdida de etanol de todo control jaulas (mL).
    2. Medir el 10% etanol ingesta (g/kg): [10% de etanol producto (mL) x 0,07893 g/mL] / peso (kg) corporal.
    3. Medir el % de preferencia: [consumo de etanol 10% (mL) agua (mL)] x 100.
  7. Tan pronto como producto de etanol se ha convertido en un estable, administrar una inyección (solución salina) intraperitoneal (i.p.) de control único (0.01 mL/g de peso corporal) para cada ratón durante la rutina diaria de la medición. De esta manera, sujetos se acostumbran a la inyección de sí mismo.
    1. Estabilidad se define como variabilidad de ± 10% del promedio de los últimos 3 días (igual que en la sección 2.8).
      Nota: Puede tardar hasta 1 semana para estabilizar los niveles de etanol. Esto es especialmente cierto si los ratones se utilizan nuevamente en un experimento anterior y han tenido exposición previa al etanol. El control es simplemente el solvente usado para disolver la droga.
  8. Una vez que una base de etanol con baja variabilidad es, dividir los ratones en dosis grupos utilizando los valores de ingesta de etanol para que todos los grupos tienen más o menos similar promedio valores de ingesta de etanol.
    1. Designar un grupo como el control (continuar recibir solución salina) y el otro como la experimental (inyección i.p. de la droga investigada en 0,01 mL/g de peso corporal). Iniciar drogas diario de dosificación, ya sea para una duración aguda o de varios día. Posteriormente, el control puede ser reintroducido para probar los efectos de la drogas (opcionales).
      Nota: Porque beber es monitoreado a través de un largo período de 24 horas, el tiempo de administración de la dosis no es dependiente en el ciclo oscuro.

4. bebiendo en la obscuridad (hizo)

Nota: Se prepara un diagrama esquemático en la figura 3.

  1. En cada día de acceso al etanol programadas (días 1-4) registrar las mediciones de volumen de agua, consumo de alimentos y peso corporal y realizar la dosificación de la droga. Hacer esto durante un tiempo preseleccionado durante el ciclo de luz que se elige según la farmacocinética de la droga para que el compuesto es en / o acercarse a la concentración máxima del cerebro durante el período de consumo.
    Nota: Recuerde días 1-3 se pretenden aclimatar simplemente los ratones para beber abundantes niveles de etanol en un periodo corto de tiempo. Mientras que los ratones no alcanzan niveles BEC comparables a la humana 0,08; estos días de "entrenamiento" aseguran de que el día 4, durante la sesión beber un poco más largo, que de hecho se beben a ese nivel.
    1. Dar a todos los ratones control (solución salina) en días 1-3 y el control o drogas el día 4. Este procedimiento DID produce a lo largo de 3 semanas con un medicamento previo (semana 1), drogas (semana 2) y sesión beber post-medicamentos (semana 4).
    2. Nota: Tenga en cuenta que durante la semana de dosis de drogas, niveles de ingestión de etanol día 3 se utilizan para asignar ratones a ninguno del grupo control o drogas de manera que los niveles de ingesta de etanol de ambos grupos tienen la menor variabilidad. Esto es a diferencia de la TBC, que asigna a grupos basados en un promedio de 3 días.
  2. Preparar una solución 20% (v/v) de etanol (20E) en un volumen de 500 mL agregando 105,25 mL de etanol de grano prueba 190 (~ 95% etanol) a 394,75 mL de H2O; Cerciórese de agite bien.
  3. Llenar las botellas de etanol antes del inicio de la sesión beber para que tan pronto como comience el DID las botellas de agua se puede substituir simplemente con las botellas de alcohol.
  4. Durante la sesión entera de DID (pasos 4.5-4.8), utilizar un proyector de luz roja para no molestar a los animales.
  5. Al comienzo de la DID beber sesión, programada para comenzar 3 horas en el ciclo oscuro, registrar el volumen de agua para cada ratón. Luego, reemplace cada botella de agua con una botella de la solución de 20E y registrar el volumen de etanol a partir.
  6. Leer y registrar el volumen de etanol final 2 horas más tarde, al final de la sesión beber en los días 1-3 y 4 horas más tarde en el día 4. Analizar la ingesta de etanol 20% utilizando las siguientes ecuaciones.
    1. Medir el 20% el consumo de etanol (mL): [volumen de etanol en el final del período de sesiones (mL) - volumen de etanol en el inicio del período de sesiones (mL)] - etanol promedio pérdida de todo control jaulas (mL).
    2. Medir el 20% etanol ingesta (g/kg): [20% consumo de etanol (mL) x 0,15786 g/mL] / peso (kg) corporal.
  7. El día 4, inmediatamente después de registrar volúmenes de etanol y antes de volver a introducir el acceso al agua, recolección de sangre para evaluar la concentración de etanol de la sangre de cada ratón (opcional).
    Nota: Cualquier método de recolección de sangre no terminal puede utilizarse, como colección de la sangre sino de retro-orbital o colección de sangre de la vena safena. Para protocolos útiles ver referencias de Parasuraman et al. 21 y Yardley et al. 20.
    1. Realizar análisis usando varios métodos incluyendo LCMS o maquinaria disponible en el mercado (véase Tabla de materiales).
  8. Reemplace todas las botellas de etanol con botellas de agua y volumen de agua registro.

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Representative Results

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En las siguientes investigaciones representativas, beber social fue modelado utilizando el paradigma de la elección de dos botellas (por confirmar). Brevemente, los ratones tenían acceso a dos botellas de solución, uno de los cuales contiene agua y el otro una solución de etanol 10% (v/v). Los sujetos fueron posteriormente dividir y uniformemente asignados a grupos de tratamiento de drogas, moxidectina (MOX) vs control de solución salina, para que cada grupo hubiera un promedio de niveles de ingesta de etanol con la menor cantidad de variación.

Ingesta inicial base 10E durante el período de 24 horas se estabilizó en 14.46 ± 1,85 g/kg (n = 8) antes de las inyecciones comenzaban y posteriormente volver a estabilizaron a 14,14 g/kg post inyecciones de solución Salinas. Para evaluar los efectos de una dosis aguda (5 mg/kg) de MOX en la ingesta de etanol y de preferencia, potable actividad fue evaluado pre MOX, MOX y MOX. Se encontró que una dosis única de MOX redujo significativamente la ingesta de alcohol superior a 45%, en comparación con las inyecciones de MOX pre [F (2, 22) = 26.33, p < 0.0001] (figura 2A) y la preferencia [F (2, 14) = 17,35, p < 0.0001] (figura 2B ) por encima del 30%. Entrada 10E y preferencia seguía siendo significativamente menores que la solución salina en el día inmediatamente después del tratamiento de MOX (por más del 25% y 15% respectivamente) se muestra como las inyecciones de MOX en la figura 2).

En un estudio piloto inédito, excesos alcohólicos fue modelado usando el beber en el procedimiento (DID) oscuro que ratones habían diario acceso limitado (2 h) a una botella que contiene 20E principio 3-h en la fase oscura circadiana, durante 3 días consecutivos, con un acceso más período (4 h) el día 4 (figura 4). Ratones hembra (n = 12, 6 ratones/grupo) inyecciones de solución Salinas administradas (i.p.) en días 1 al 4 con base 20E se establecieron el día 4 (la droga). En los días 1-3 de la 2nd semanal ciclo, todos los ratones recibieron una inyección de solución salina diariamente. Los valores de ingesta de etanol desde el día 3 fueron utilizados para dividir los ratones en dos grupos (n = 6 / Grupo) que recibió posteriormente una inyección (i.p.) de MOX (5 mg/kg) o solución salina en el día 4 (drogas). La semana siguiente que todos los ratones recibieron inyecciones diarias Salinas sobre la ingesta de etanol y 1-4 días se midió una vez más en el día 4 (post drogas). Administración aguda de 5 mg/kg MOX fue analizado y se encontró que la ingesta de alcohol redujo significativamente superior al 54%, en comparación con las inyecciones de la drogas (t = 7.635, p < 0.0001)

Figure 1
Figura 1 . Dos botellas elección esquemáticahaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  

Figure 2
Figura 2 . Dos botellas a elección (por confirmar). MOX (5 mg/kg) reduce 10% v/v etanol (10E) toma (A) y preferencia (B) en ratones C57BL/6J femeninos utilizando un paradigma de elección 24 h acceso dos botellas. Después de alcanzar niveles de consumo estables durante 3 días consecutivos, se administró MOX. Las barras representan niveles de ingestión media 10E desde el día antes de la inyección de MOX (blanco; Pre MOX), el día de la inyección de MOX (negro; MOX) y el día después de la inyección de MOX (gris; Post MOX). Los valores representan la media ± SEM de 12 ratones. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, y *** P < 0.0001 versus Pre MOX (línea horizontal de la izquierda) o Post MOX (línea horizontal de la derecha), Tukey de prueba de post hoc de comparación múltiple. Modificado de N. Huynh et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Beber en el mismo oscurohaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  

Figure 4
Figura 4 . Bebiendo en la obscuridad (hice). MOX (5 mg/kg) reduce la ingesta de etanol (20E) 20% v/v en ratones C57BL/6J femeninos con un bebe en el paradigma oscuro. Las barras representan niveles de ingestión promedio 20E en la semana previa a la inyección de MOX (la droga), la semana de la inyección de MOX (droga) y la semana después de la inyección de MOX (la droga). Los valores representan la media ± SEM de 12 ratones (6/Grupo) entre grupos MOX y solución salina. P < 0.0001 versus la droga (línea horizontal de la izquierda) o la droga (línea horizontal de la derecha), Tukey de prueba de post hoc de comparación múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Estimaciones a nivel Mundial indican que unos 76 millones de personas cumplen con los criterios para justificar un diagnóstico de trastorno de uso de Alcohol (AUD). Por desgracia, farmacéuticos tratamientos actualmente disponibles son en gran parte ineficaces y desarrollo es necesario para compensar las necesidades de esta población clínica20. Para ello, el siguiente protocolo pretende facilitar este esfuerzo por ejemplificar dos del roedor más básico potable paradigmas: dos botella de elección (por confirmar) y bebiendo en la obscuridad (DID). Ambos modelos miden no operante autoadministración de etanol, por el que ratones ingieren etanol por vía oral. En la TBC paradigma, agua y etanol (10% v/v) están disponibles continuamente, dando como resultado niveles de etanol comparable bajo en la sangre que son consecuencia de un patrón de consumo episódico y gradual el etanol. Este modelo es mejor para la evaluación de niveles inferiores de ingesta de etanol como una preferencia tastant y por lo tanto, se dice que es similar a la humana "" moderado. Figura 2 anterior muestra resultados representativos para el paradigma de la TBC.

Por otra parte, en el DID modelo etanol (20% v/v) es solamente disponible para una cantidad limitada de tiempo. A diferencia de la TBC, este modelo evalúa los efectos de un compuesto en conductualmente relevantes concentraciones de etanol, aprovechando el hecho de que ratones C57BL/6J consumen grandes cantidades de etanol muy rápidamente durante la fase más activa de su ciclo circadiano. Estas sesiones potables ocurren durante 4 días consecutivos, comenzando en el 3rd h en el ciclo oscuro, con una duración de 2 h en 1-3 días y 4 horas el día 4. Mediante este procedimiento, ratones normalmente consumen suficiente etanol para lograr BECs > 100 mg/dL y exhibir comportamiento evidencia de intoxicación. Nuestros resultados representativos para el paradigma de la DID se muestran en la figura 4. Aunque no se medida BECs estos ratones, los niveles de consumo son similares a los reportados en la literatura que logrado BECs en 100 mg/dL13,14,15.

Ambos paradigmas tienen limitaciones. Durante instancias cuando gavages orales son el método preferido de administración para las pruebas farmacológicas de compuestos de plomo, trauma de esófago causado por el procedimiento puede dificultar la autoadministración de etanol en ambos paradigmas. Esto es especialmente cierto para el modelo DID, que utiliza una mayor concentración de etanol (20%) y que pueden presentes instancias donde la farmacocinética del fármaco requiere la sesión beber para comenzar antes de los animales han tenido tiempo suficiente para recuperarse de la procedimiento. Esto es evidente en un grupo de control, bebiendo en los niveles que corresponden a BECs muy por debajo de la esperada 0.08. En nuestro laboratorio, hemos experimentado dificultades con la alimentación de fuerza tanto con el DID y TBC. Hemos sido capaces de solucionar estos problemas mediante la formulación de nuestros compuestos por lo que podría ser entregados usando una disolución oral tira fina (ODS)19.

Por otra parte, en el modelo DID específicamente, dado el hecho de que el período de acceso del etanol es tan corto en duración, dosificación de drogas debe hacerse durante un tiempo preseleccionado durante el ciclo de luz que se elige según la farmacocinética de la droga para que la compuesto en / o acercarse a la concentración máxima del cerebro durante el período de consumo. Si no puede realizarse un análisis de farmacocinético, una alternativa sería realizar una evaluación del curso de tiempo de los efectos conductuales de la droga con TBC. Siguiendo esta lógica, supervisar la actividad de beber sobre una base horaria, y determinando los efectos pico contra el alcohol, uno podría razonablemente estrategias cuando los medicamentos deben ser administrados19.

Mientras que el campo del alcoholismo tiene varios modelos animales para investigar los diferentes aspectos fisiológicos y de comportamiento de AUD8, el siguiente protocolo describe dos paradigmas utilizados, que permite comparaciones de los resultados a través de laboratorios. Un segundo beneficio es que estos métodos son sencillos, haciendo su uso conveniente en estudios agudos y crónicos similares a los ejemplos anteriormente indicados. Además, a diferencia de otros paradigmas de alcohol comúnmente usado como paradigmas de cámara de condicionamiento operante y el vapor, la metodología que hemos descrito aquí puede llevarse a cabo sin necesidad de equipos especiales. Como anécdota, es probable que casi todos los componentes de los aparatos de consumo se pueden encontrar en un vivero institucional prototípico. También hay varias formas de alterar los protocolos descritos aquí para que pueden caber mejor los objetivos de cada experimento. Por ejemplo, nuestro procedimiento DID es mejor para las pruebas de los efectos agudos de un medicamento en una sola sesión bebe (durante el día día 4). Sin embargo, hemos demostrado que drogas de varios días de dosificación puede evaluarse por aumentar las sesiones potables a 4 días consecutivos de acceso de 2 horas, a diferencia de las actuales 2 horas de acceso en los días 1-3 y 4 horas el día 419. Ratones también pueden ser transferidos de un paradigma a otro, o re-probado para dosis adicionales y diferentes compuestos, con un período de lavado simple 1-2 semanas en el medio.

Cabe mencionar que cualquier cambio inducido por medicamentos en beber observado a través de estos métodos debe investigarse cuidadosamente para determinar si los efectos son selectivos para el alcohol o si podría ser el resultado de la toxicidad. Para obtener más información sobre controles el lector debe consultar Yardley et al. 20 no solo paradigma puede modelar todos los aspectos de esta condición. En cambio, cada paradigma típicamente examina algunos de los principales atributos asociados a AUD. Los modelos de TBC y DID descritos aquí, se han ligado a la etapa de borrachera/intoxicación del ciclo de adicción. Para una comprensión más profunda de la utilidad del compuesto, deben utilizarse varios modelos preclínicos de beber.

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Disclosures

DLD y LA son inventores de una patente para la reasignación de la ivermectina y las avermectinas relacionadas para el tratamiento de trastornos de consumo de alcohol. Los autores no tienen otros conflictos de interés y son totalmente responsables por el contenido científico del documento.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado, en parte, por la investigación concede SC CTSI NIH/NCRR/NCATS--UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) y la Facultad de farmacia de la USC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L  graduated cylinder VWR https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle Pyrex (Fisher Scientific) https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 To prepare ethanol solution.
Analox One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes Ancare Corp. http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice Jackson lab https://www.jax.org/strain/000664 May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged 10 mL, 18 mL, or 25 mL 
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC Decon Labs (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec ---
heat gun  Master Appliances Corp. http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing --- --- Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade --- --- ---
metal cage plate --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale Ohaus (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus ---
red light headlamp nyteBright (Amazon) https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 ---
silicone stoppers Fisher --- ---
thermometer Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 ---
weigh boat VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative

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References

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Murine beber modelos en el desarrollo de farmacoterapias para el alcoholismo: en la opción oscurezca y dos botellas
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Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).More

Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).

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