Summary
दो तरीके आंतों बाधा समारोह का निर्धारण करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. एक उपकला मीटर (वाल्ट/ओम) सीधे टिशू कल्चर कुओं में कल्चरल epithelia के transepithelial विद्युत प्रतिरोध की माप के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों में, FITC-dextran gavage विधि vivo मेंआंतों पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
आंतों बाधा रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विष के खिलाफ बचाव । अपने कार्य तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है, और आंत्र बाधा समारोह के विघटन जठरांत्र और प्रणालीगत रोग की प्रगति के लिए योगदान देता है. आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने के लिए दो सरल तरीके यहाँ वर्णित हैं. इन विट्रो में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं ऊतक संस्कृति कुओं में एक monolayer और transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तेर) के रूप में चढ़ाया जाता है एक उपकला (वाल्ट/ओम) मीटर से मापा जा सकता है । यह विधि अपने उपयोगकर्ता के अनुकूल संचालन और दोहराव की वजह से कायल है । vivo में, चूहों 4 केडीए fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran के साथ gavaged हैं, और FITC-dextran सांद्रता चूहों से एकत्र सीरम नमूनों में मापा जाता है उपकला पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए. मौखिक gavage एक सटीक खुराक प्रदान करता है, और इसलिए vivo मेंआंतों पारगम्यता को मापने के लिए पसंदीदा तरीका है. एक साथ ले लिया, इन दो तरीकों इन विट्रो और vivoमें आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने कर सकते हैं, और इसलिए रोगों और बाधा समारोह के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा.
Introduction
आंत्र उपकला कोशिकाओं केवल पोषक तत्वों के अवशोषण के लिए जिम्मेदार नहीं हैं, लेकिन यह भी रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विषाक्त पदार्थों के खिलाफ की रक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा फार्म । इस आंत्र बाधा समारोह तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है1,2,3, और उपकला बाधा समारोह की शिथिलता भड़काऊ आंत्र के साथ जुड़ा हुआ है रोग (आईबीडी) । perijunctional actomyosin रिंग (PAMR) उस सेल के भीतर निहित है जो तंग जंक्शनों के निकट है । PAMR के संकुचन, जो मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (विधान परिषद) द्वारा विनियमित है, तंग जंक्शन पारगम्यता के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है4,5,6,7,8, 9,10. ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) आंत्र उपकला विधान परिषद कळेनासे (MLCK) अभिव्यक्ति और उत्प्रेरण occludin internalization11,12,13द्वारा आंत्र बाधा घटाने के लिए केंद्रीय है ।
ऐसे एनए+ और सीएल के रूप में आयनों या तो ताकना या रिसाव मार्ग14से paracellular अंतरिक्ष को पार कर सकते हैं । एक "टपका हुआ" उपकला में, तेर में परिवर्तन मुख्य रूप से बदल तंग जंक्शन पारगम्यता को प्रतिबिंबित. तेर माप एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया electrophysiological दृष्टिकोण है तंग जंक्शन पारगम्यता, मुख्य रूप से नाकरने के लिए+ और सीएल, सेल monolayers के प्रतिबाधा पर आधारित है । आंत्र उपकला कोशिकाओं, फेफड़े के उपकला कोशिकाओं, और संवहनी endothelial कोशिकाओं सहित विविध कोशिका प्रकार, तेर माप के लिए सूचित किया गया है. इस विधि के लाभ कर रहे है कि तेर माप गैर इनवेसिव रहे है और वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तेर माप तकनीक दवा विषाक्तता अध्ययन के लिए उपयोगी है15.
कएको छैन-2BBe कोशिकाओं मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं के साथ एक संरचना और समारोह विभेदित छोटे आंत्र उपकला कोशिकाओं के लिए समान हैं: उदाहरण के लिए, इन कोशिकाओं microvilli और छोटे आंत्र ब्रश के साथ जुड़े एंजाइमों है बॉर्डर. इसलिए, कल्चरल कएको छैन-2BBe monolayers में एक इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है बैरियर समारोह परीक्षण के लिए.
चूहों में, आंतों paracellular पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एक तरीका रक्त में लुमेन से पार करने के लिए FITC-dextran की क्षमता को मापने के द्वारा है । इस प्रकार, आंतों पारगम्यता gavaging FITC द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता-dextran सीधे चूहों में और रक्त के भीतर प्रतिदीप्ति को मापने. निम्नलिखित प्रोटोकॉल दोनों विट्रो में और vivo मेंआंतों उपकला पारगम्यता का आकलन करने के लिए दो सरल तरीकों का वर्णन करता है.
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Protocol
यह अध्ययन पशु देखभाल और कैंब्रिज-सूडा जीनोमिक रिसोर्स सेंटर (सांचा-सु), Soochow विश्वविद्यालय के उपयोग प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. चढ़ाना और कएको छैन-2bbe के रख-रखाव को असुरक्षित कार्बोनेट झिल्ली पर
- मीडिया के साथ एक T75 कुप्पी में कोशिकाओं को विकसित (10% FBS युक्त DMEM) । बोतल नियमित रूप से खिलाया जाना चाहिए, कोशिका घनत्व पर निर्भर करता है ।
नोट: इष्टतम चढ़ाना के लिए, कोशिकाओं को तेजी से विभाजित करना चाहिए और एक फ्लैट "तला हुआ अंडा" आकार है, जो इंगित करता है कि कोशिकाओं के विकास के चरण में हैं । - एक बार कोशिकाओं ८०% धाराप्रवाह, मशीन से बाहर कुप्पी ले और मीडिया को हटा रहे हैं । (बिना सीए2 +) बाँझ पंजाबियों की 1-2 मिलीलीटर के साथ किसी भी अवशिष्ट मीडिया कुल्ला । प्लास्टिक १.५ मिलीलीटर Trypsin-EDTA कुप्पी में और धीरे से कुप्पी रॉक; फिर, रॉक बिना 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कुप्पी जगह है ।
- कोशिकाओं trypsinizing कर रहे हैं, जबकि छिद्रित पाली कार्बोनेट झिल्ली (ताकना आकार, ०.४ µm; भूतल क्षेत्र, ०.३३ सेमी2; सामग्री की तालिकादेखें) 24 में अच्छी तरह से प्लेटों में शामिल हैं । बेसल चैंबर (झिल्ली के निचले स्थान) में संस्कृति मीडिया के १.० मिलीलीटर जोड़ें ।
- प्लास्टिक की कुप्पी में मीडिया के 5 मिलीलीटर और जोरदार प्लास्टिक के खिलाफ कोशिकाओं की कुप्पी 5-10 बार ढीला, व्यक्तिगत कोशिकाओं या 2-3 सेल के झुरमुट को प्राप्त करने के लिए ।
-
प्लेट कोशिकाओं के ०.१६६ मिलीलीटर (एक 1:8 कमजोर पड़ने अनुपात को प्राप्त करने) शिखर चैंबर (झिल्ली के ऊपरी अंतरिक्ष) में । 3 सप्ताह तक के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- फ़ीड कोशिकाओं को ध्यान से तीन बार साप्ताहिक प्रत्येक अच्छी तरह से एक दबाव पंप का उपयोग कर के बेसल डिब्बे से मीडिया aspirating । धीरे प्रत्येक डालने के शिखर चैंबर में मीडिया के 1 मिलीलीटर ड्रिप ।
2. तेर मापने के लिए उपकला मीटर (वाल्ट/ओम) का उपयोग
नोट: के बाद लगभग 3 सप्ताह की संस्कृति पर पाली कार्बोनेट झिल्ली, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को तेर माप के लिए तैयार हैं ।
- cytokine अध्ययन के लिए, माप से पहले एक दिन, IFNγ के 10 एनजी/एमएल युक्त मीडिया के साथ बेसल मीडिया की जगह । प्रयोग के दिन, TNF के २.५ या ७.५ एनजी/HBSS युक्त मीडिया की जगह ।
नोट: IFNγ उपचार TNF रिसेप्टर 2 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है (TNFR2)16. - मीटर सही करने के लिए, इनपुट बंदरगाह में सुधार इलेक्ट्रोड डालें, और "ओम" मोड का चयन. एक पेचकश के साथ आर Adj पेंच समायोजित जब तक मीटर १,००० Ω के एक पढ़ने प्रदर्शित करता है ।
- उंहें 15-30 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में रखकर इलेक्ट्रोड को निष्फल, और फिर उंहें 15 एस के लिए शुष्क हवा के लिए अनुमति प्रयोगात्मक सेल संस्कृति मीडिया में इलेक्ट्रोड कुल्ला ।
- पावर चालू करें, और "ओम" मोड चुनें । ध्यान से शिखर कक्ष में बेसल कक्ष और लघु समाप्त होता है इलेक्ट्रोड पुलों के लंबे सिरों जगह. यह सुनिश्चित करें कि लंबे समय इलेक्ट्रोड पकवान के नीचे स्पर्श, जबकि मीडिया की सतह के नीचे छोटे इलेक्ट्रोड रखने पर ऊतक संस्कृति आवेषण ऊपर. इलेक्ट्रोड ऊर्ध्वाधर रखें ।
- नमूना आवेषण और रिक्त आवेषण के प्रतिरोध को मापने (यानी, कोशिकाओं के बिना संस्कृति आवेषण लेकिन HBSS के साथ) 0, 1, 2, 3, 4 cytokine उपचार के बाद एच । प्रतिरोध रिकॉर्ड ।
- विभिन्न प्लेट स्वरूपों में स्थिरता प्राप्त करने के लिए, प्रतिरोध और प्रभावी झिल्ली क्षेत्र के उत्पाद की गणना:
24-well आवेषण के लिए, प्रभावी झिल्ली क्षेत्र ०.३३ cm2है ।
3. Dextran सल्फेट सोडियम (DSS) के Murine मॉडल-प्रेरित कोलाइटिस
- ३.५% (wt/vol) के अंतिम एकाग्रता के लिए autoclaved पानी के लिए DSS जोड़ें ।
- प्रशासन ३.५% DSS 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL के लिए 6 चूहों 7 दिनों की कुल के लिए/ चूहों को नियंत्रित करने के लिए DSS बिना नियमित पीने का पानी दें ।
- 7 दिन के बाद नियमित रूप से पीने के पानी के लिए DSS युक्त पानी स्विच ।
- चूहों तौलना और हर दिन प्रत्येक माउस के नैदानिक स्कोर का आकलन. अपने प्रारंभिक शरीर के वजन के लिए प्रत्येक माउस के शरीर के वजन को सामान्य । स्कोर चार मापदंडों द्वारा रोग गंभीरता के अनुसार परिभाषित कर रहे हैं: गुदा आगे को बढ़ाव (0-2), मल स्थिरता (0-2), खून बह रहा (0-2), और गतिविधि (0-2)5. एक अंतिम नैदानिक स्कोर के लिए इन मापदंडों से स्कोर का योग ।
- पेट के ऊतकों की histopathological हालत का विश्लेषण करने के लिए, euthanize चूहों द्वारा intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन के साथ १.२% (vol/Avertin (०.६ मिलीलीटर/10 ग्राम शारीरिक वजन) 7 दिनों के बाद DSS उपचार । १००% avertin का स्टॉक तैयार करने के लिए, 10 ग्राम के 2, 2, 2-tribromoethanol के 10 मिलीलीटर tert-amyl अल्कोहल के साथ मिलाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर । उपयोग करने के लिए, पानी में 2% करने के लिए १००% शेयर पतला ।
- अर्धविराम और अंधान्त्र को अलग करें, और कोलन5की लंबाई मापने ।
- बाहर बृहदांत्र से ०.५ सेमी क्षेत्रों में कटौती और एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब 10% की 10 मिलीलीटर रात भर formalin युक्त में ठीक । निश्चित ऊतकों को वर्गीकृत इथेनॉल (७५, ९५, और १००%) और xylene के साथ धोएं । आयल में ऊतक एंबेड और hematoxylin और eosin धुंधला8के लिए 6 मिमी वर्गों में कटौती ।
4. DSS-प्रेरित कोलाइटिस चूहों में उपकला बाधा पारगम्यता को मापने
- DSS प्रशासन की शुरुआत के बाद बाधा पारगम्यता 7 दिनों के उपाय ।
- पर परख के दिन, तेजी से चूहों 3 एच के लिए ।
- आटोक्लेव एक gavage सुई बाँझ सुनिश्चित करने के लिए, तो gavage चूहों के साथ १५० µ एल ८० मिलीग्राम/एमएल 4 केडीए FITC-dextran बाँझ पानी में, और अप्रयुक्त FITC-dextran सीरम संग्रह के बाद मानक वक्र को मापने के लिए रखें । पारगम्यता गणना के लिए चूहों तौलना.
नोट: पानी में FITC-dextran समाधान किया जाना चाहिए । - कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, पूंछ की एक 1 सेमी टुकड़ा क्लिप, और सीरम संग्रह ट्यूबों में पूंछ से रक्त की १०० µ एल इकट्ठा । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर एकत्र रक्त स्पिन ।
- पानी में सीरम 1:4 पतला । एक मानक वक्र बनाने के लिए, 1:300 पर पानी के साथ अप्रयुक्त FITC-dextran पतला, 1:1000, 1:3000, 1:10000, 1:30000, 1:100000, 1:300000, 1:1000000, और 1:3000000 । सीरम और ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में मानक वक्र नमूने के १०० µ एल जोड़ें/
- ४८५ उत्तेजना/528 उत्सर्जन के साथ एक प्लेट रीडर में प्रतिदीप्ति पढ़ें । मानक वक्र के आधार पर पारगम्यता मूल्यों की गणना, और कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए 4 से गुणा ।
- वजन से FITC-dextran की एकाग्रता विभाजित करने के लिए मूल्यों को सामान्य (यह मदद करता है FITC-dextran वितरण में अंतर को सामान्य अगर चूहों बीमार हैं और वजन खो दिया है).
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Representative Results
संस्कृति में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को एक monolayer के रूप में विकसित और धीरे परिपक्व अवशोषण enterocytes कि ब्रश सीमाओं है में अंतर । इस प्रोटोकॉल में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को पाली कार्बोनेट झिल्ली पर एक उच्च घनत्व के साथ चढ़ाया गया था, और कोशिकाओं १००% तक पहुंच एक दिन बोने के बाद प्रवाह । हालांकि, कोशिकाओं को इस स्तर पर विभेदित कर रहे हैं: पूरी तरह से कोशिकाओं को अंतर करने के लिए, मीडिया 3 सप्ताह के लिए हर 2-3 दिन बदल जाता है । कोशिकाओं नाभिक और F-actin दाग के साथ दाग को विभेदित और विभेदित कोशिकाओं के बीच मतभेदों को दिखा रहे थे । तनाव फाइबर स्पष्ट रूप से विभेदित कोशिकाओं में देखा जाता है । विभेदित कोशिकाओं के साथ तुलना में, विभेदित कोशिकाओं एक छोटी मात्रा, बड़ा नाभिक, और कम तनाव फाइबर (चित्रा 1) है ।
TNF MLCK-निर्भर तंग जंक्शन विनियमन के माध्यम से आंत्र बाधा घटाने के लिए केंद्रीय है । बिना या अलग समय बिंदुओं पर TNF उपचार के साथ कोशिकाओं का तेर का विश्लेषण किया गया । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, TNF काफी कएको छैन-2BBe monolayer के तेर एक खुराक पर निर्भर तरीके से कम हो जाती है, सुझाव है कि TNF उपकला पारगम्यता बढ़ जाती है.
DSS के प्रशासन चूहों में तीव्र कोलाइटिस लाती है । चूहों DSS के साथ इलाज काफी अपने प्रारंभिक शरीर के वजन की तुलना में वजन कम (आंकड़ा 3ए) । कोलाइटिस की गंभीरता गुदा आगे को बढ़ाव, मल संगति, खून बह रहा है, और गतिविधि (चित्र बी) द्वारा बनाए गए है । hematoxylin और eosin के साथ दाग बृहदांत्र ऊतकों के पार वर्गों का इलाज चूहों (चित्रा 3सी) DSS में बृहदांत्र श्लैष्मिक नुकसान दिखा । DSS चूहों में (चित्रा 3 डी) का इलाज तहखाने की लंबाई में कमी आई है । पेट की लंबाई DSS चूहों (चित्रा 3E) में छोटा है । जैसा कि चित्रा 3Fमें देखा गया है, चूहों पर नियंत्रण की तुलना में DSS चूहों के इलाज में FITC-dextran के स्तर में लगभग एक 2-गुना वृद्धि हुई है.
चित्रा 1: कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को पाली कार्बोनेट झिल्ली पर संस्कृति । प्रसंस्कृत कोशिकाओं 1 दिन (विभेदित) और 3 सप्ताह (पूरी तरह से विभेदित) चढ़ाना के बाद Hoechst ३३३४२ (नीले) के लिए नाभिक और Alexa Fluor ५९४ Phalloidin के लिए F-actin (लाल) के साथ दाग रहे हैं । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: TNF कएको छैन-2BBe monolayer के तेर को कम करता है । कोशिकाओं के साथ प्रधानमंत्री रहे है 10 रात के IFNγ के एनजी/ अगले दिन पर, संस्कृति मध्यम २.५ या ७.५ TNF के एनजी/एमएल युक्त HBSS के साथ बदल दिया है । तेर एक उपकला मीटर द्वारा मापा जाता है (वाल्ट/ओम) संकेत दिया समय बिंदुओं पर । मान ± SEM मतलब है, n = 4 । महत्वपूर्ण अंतर * (p < 0.05) और * * (p < 0.01) द्वारा दर्शाया गया है, जैसा कि TNF उपचार के बिना कक्षों के तेर मानों की तुलना में, दो-पुच्छीय t-परीक्षण द्वारा किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: चूहों में DSS-प्रेरित कोलाइटिस । C57BL/6 पुरुष चूहों 7 दिनों के लिए पीने के पानी में ३.५% DSS दिया जाता है । शरीर के वजन (क) और नैदानिक स्कोर (ख) प्रत्येक समूह के लिए दैनिक मूल्यांकन कर रहे है (± SEM, n = 4 प्रत्येक समूह के लिए) । नियंत्रण चूहों DSS बिना पानी प्राप्त किया । (ग) दिन 7 पद पर एकत्र की गई बृहदांत्र ऊतक वर्गों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण-DSS उपचार । (घ) बृहदांत्र तहखाना लंबाई 7 दिन के बाद-DSS उपचार पर मापा जाता है । (ङ) बृहदांत्र लंबाई 7 दिन के बाद-DSS उपचार पर मापा जाता है । (च) बृहदांत्र उपकला की पारगम्यता FITC-Dextran gavage द्वारा दिन 7 के बाद DSS उपचार पर मापा जाता है. मान ± SEM मतलब है, n = 4 । महत्वपूर्ण अंतर * (p < 0.05 द्वारा दो-पुच्छ t-परीक्षण द्वारा) दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| स्कोर | गुदा आगे को बढ़ाव | स्टूल संगति | खून बह रहा | गतिविधि |
| 0 | कोई | सामान्य | कोई | सक्रिय |
| 1 | आगे को बढ़ाव का संकेत | नरम | लाल | घटी हुई गतिविधि |
| 2 | व्यापक आगे को बढ़ाव | दस्त | सकल रक्तस्राव | सुस्त |
तालिका 1. रोग नैदानिक स्कोर
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Discussion
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । कएको छैन-2BBe (ब्रश सीमा-व्यक्त) कोशिकाओं को हमेशा के लिए उपयोग किया जाता है तेर माप, ब्रश की अभिव्यक्ति के लिए कएको छैन-2 सेल लाइन से चयनित-सीमा प्रोटीन । कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को एक अंकुर अवशोषण phenotype जब पूरी तरह से विभेदित (संस्कृति पश्चात संगम के बारे में 3 सप्ताह के बाद)17. यह माप के दौरान संक्रमण से बचने के लिए, और इलेक्ट्रोड निष्फल करने के लिए आवश्यक है । प्रक्रिया गैर बाँझ है, क्योंकि ज्यादातर मामलों में माप केवल 8 घंटे के लिए किया जा सकता है । माप के दौरान, हम दो अंक के अंदर और बाहर डालने के प्रतिरोध मूल्य निर्धारित किया है । विभिंन साइटों पर प्रतिरोध मापन कभी बहुत सेल राज्य में मतभेद की वजह से अलग कर सकते हैं; यह विधि की एक प्रमुख सीमा है । हालांकि, इस भिन्नता सांख्यिकीय विधियों और अन्य विधियों द्वारा काफी कम किया जा सकता है । तेर विधि अन्य कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता, जैसे फुफ्फुसीय उपकला कोशिकाओं और संवहनी endothelial कोशिकाओं की बाधा अखंडता का निर्धारण. इसके अलावा, तेर माप दवा विषाक्तता अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
पच अणुओं के प्रशासन, जो प्रसार के माध्यम से आंतों उपकला में प्रवेश, आंतों पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इस विधि का लाभ यह है कि vivo मेंआंतों के बैरियर फंक्शन की जांच की जा सकती है । वहां मार्करों के कई प्रकार है कि radioisotopes, पॉलीथीन glycols, और शर्करा18सहित इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, कई कारकों पारगम्यता की सटीक माप के लिए विचार किया जाना चाहिए: (1) आंत बाधा विषमता की स्थिति हमेशा ठीक से निर्धारित नहीं किया जा सकता; और (2) श्लैष्मिक रक्त प्रवाह और जठरांत्र गतिशीलता अवशोषण और अणुओं के उत्सर्जन को प्रभावित कर सकता है ।
इस स्टडी में 4 केडीए FITC-dextran चूहों में intragastrically का प्रबंध किया गया था और माउस सीरम में FITC-dextran की मात्रा मापी गई थी. इस विधि के कई फायदे हैं । मौखिक gavage एनीमा का उपयोग कर के साथ जुड़े रहे हैं कि संभव जोखिम कम कर देता है. उदाहरण के लिए, पेट उपकला के लिए अनजाने हानि गुदा जगाकर के कारण हो सकता है, एक झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए अग्रणी. तनाव के कारण होने वाले अतिरिक्त प्रभावों को भी समाप्त किया जाना चाहिए । पारगम्यता बढ़ाने के लिए जाना जाता है जब चूहों पर बल दिया जाता है. यह वास्तविक प्रयोग करने से पहले एक प्रारंभिक प्रयोग करने के लिए अनुशंसित है । अभ्यास प्रयोग करने से वास्तविक प्रयोग के लिए प्रयोगात्मक शोर को कम करने में मदद मिलेगी । एक जंगली प्रकार के नियंत्रण (कोई उपचार) हमेशा शामिल किया जाना चाहिए ।
FITC-dextran छोटी आंत के माध्यम से यात्रा और gavaging के बाद 3 एच बृहदांत्र में प्रवेश शुरू होता है । इस प्रकार, 3 एच छोटे आंत्र पारगम्यता को मापने के लिए एक आदर्श समय बिंदु है । बृहदांत्र पारगम्यता के माप के लिए, समय बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह तो रक्त प्रवाह से इन अणुओं के लुमेन और निकासी में FITC-dextran के रिसाव के बीच एक संतुलन बन जाता है । 4 एच आम तौर पर बृहदांत्र माप के लिए एक अच्छा समय बिंदु के रूप में स्वीकार किया है ।
अंत में, दो अलग तरीकों के लिए आंत्र उपकला कोशिका दोनों विट्रो में और vivo मेंपारगम्यता का निर्धारण करने के लिए वर्णित थे । जबकि तेर माप और FITC-dextran gavage तरीके दोनों उपाय paracellular पारगम्यता, वे प्रत्येक paracellular पारगम्यता के स्वतंत्र और विशिष्ट गुण प्रदान करते हैं ।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।
Acknowledgments
हम डॉ Jerrold आर टर्नर, ब्रिघम और महिला अस्पताल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल से, इस अध्ययन को पूरा करने में उनकी उदार मदद के लिए धंयवाद । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (अनुदान संख्या ८१४७०८०४, ३१४०१२२९, और ८१२००६२०), Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या BK20180838, और BK20140319), के लिए अनुसंधान नवाचार कार्यक्रम Jiangsu प्रांत के कॉलेज स्नातकों (अनुदान संख्या KYLX16-0116), Soochow विश्वविद्यालय के उंनत अनुसंधान परियोजनाओं (अनुदान संख्या SDY2015_06), और Crohn और कोलाइटिस फाउंडेशन रिसर्च फेलोशिप पुरस्कार (अनुदान संख्या ३१०८०१) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
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