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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

休眠和活性人肿瘤细胞的时间推移、无标签、定量相成像研究

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57035
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

应用定量相成像技术对休眠和活性癌细胞表型进行了表征。用一种简单的方法对细胞增殖、迁移和形态学测定进行了综合分析。

Abstract

血管生成表型的获得是肿瘤休眠逃逸的重要组成部分。虽然一些经典的体外检测 (例如、增殖、迁移和其他) 和在体内模型已经开发, 以调查和表征血管生成和非血管生成细胞表型, 这些方法是时间和劳动密集型, 往往需要昂贵的试剂和仪器, 以及重要的专业知识。在最近的一项研究中, 我们用一种新的定量相成像 (QPI) 技术来进行血管生成和非血管生成性人骨肉瘤 KHOS 细胞的时间推移和无标记的特征。用 QPI 定量测量和分析了细胞参数的一个小组, 包括胞形态学、增殖和运动。这一新颖和定量的方法提供了机会, 以持续和非侵入性研究相关的细胞过程, 行为, 和肿瘤细胞的特点和其他细胞类型的简单和综合的方式。本报告描述了我们的实验性协议, 包括细胞制备、QPI 采集和数据分析。

Introduction

在固体肿瘤的发展和进展中, 最早的检查点之一是获得血管生成表型, 这是癌症的标志。这一进展涉及各种生物化学和分子过程1,2,3。研究肿瘤进展这一关键步骤的技术挑战是缺乏连续和定量地对活癌细胞的血管生成和非血管生成性表型进行无偏定性和鉴别的工具。传统的检测方法用于研究血管生成和非血管生成细胞的细胞行为, 通常需要昂贵的试剂和仪器, 例如细胞增殖/迁移分析4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14或互补的在体内评估4,5,6,8,15,16, 以及需要大量的专业知识和密集的时间和劳动消费。

最近, 定量相位成像 (QPI) 已经成为一种新的技术, 它能够对各种细胞形态学和行为参数进行时间推移和无标记的评估17,18,19,20,21,22. 与常规光学显微术不同, QPI 在光通过光学物体后按像素量化相移像素的变化, 并重建具有转换的光学厚度和体积的全息图像, 从而使直接对活细胞的分析和以下特点: (1) 定量成像, (2) 无创和时间推移成像, (3) 无标签成像, (4) 同时多参数成像。这些特性使 QPI 成为评估和理解细胞级病理过程的有力工具。

在最近的一项研究中, 我们利用 QPI 定量地定性和区分人骨肉瘤细胞的血管生成 KHOS 和非血管生成 KHOS-N 表型, 结合细胞形态学分析,扩散和运动23。利用图像分析软件, 对血管生成体与非血管生成性人骨肉瘤细胞的细胞形态和行为参数进行了定量比较, 并在这两个方面确定了五种特征差异。型.这种新的方法提供了一个综合和定量的平台, 以评估各种生物相关的细胞特征。

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Protocol

这里描述的所有方法都已被波士顿儿童医院机构生物安全委员会批准。

1. 细胞制剂

  1. 解冻 KHOS 细胞
    1. 预热培养基,即, Dulbecco 的改性鹰培养基辅以 10% (卷/卷) 胎小牛血清 (血清) 和 1% (卷/卷) 青霉素/链霉素。
    2. 从液氮罐中取去低温小瓶, 将瓶子的底部浸入37摄氏度水浴中的温水中, 轻轻摇动低温瓶以加速解冻过程。保持低温小瓶的盖子不接触水, 以避免污染。一旦细胞解冻, 通过喷洒70% 乙醇溶液和擦拭瓶子来消毒低温小瓶。
    3. 在层流罩中, 立即从低温小瓶中吸出细胞悬浮液, 并在10毫升加热培养基中轻轻悬浮 (1.1.1 中描述)。离心机细胞悬浮在大约 200 x g 为 5-7 分钟。
    4. 并用重悬细胞颗粒与10毫升加热培养基, 并转移到一个 T75 瓶。用10毫升的吸管轻轻地用吸管多次悬浮细胞。
    5. 将烧瓶放入一个37°c 孵化器与 5% (卷/卷) CO2和湿润气氛。允许单元格附加至少12小时。
    6. 孵育细胞大约 3-7 天直到 80-100% 汇合。每 2-3 天改变培养基。
  2. 分裂 KHOS 和 N 细胞
    1. 从烧瓶中移除培养基介质。
    2. 用5毫升不含钙和镁的无菌 PBS (1x) 冲洗细胞, 去除不附着的细胞或分数。
    3. 在烧瓶中加入1毫升0.05% 胰蛋白酶-edta 溶液, 并简单地旋转烧瓶, 以确保胰蛋白酶-edta 均匀分散。
    4. 在37摄氏度孵化器或 3-5 分钟的室温下孵育烧瓶 2-3 分钟。检查显微镜下的细胞在大约400x 倍放大, 以确保细胞被四舍五入和分离。
    5. 一旦细胞分离, 添加10毫升培养基, 并轻轻地将培养基上下移几次, 用10毫升的吸管将细胞团聚体分解成单个细胞悬浮。
    6. 使用单元格计数器计数单元格。将细胞悬浮到新的 T75 烧瓶中, 密度为 2 x 106细胞或比例为1:4。
    7. 允许细胞生长到 80-100% 汇合之前, 播种的 QPI 实验。
  3. QPI 种子 KHOS 细胞
    1. 种子 KHOS-6 井板中的 A 和 N 细胞密度为 5万-30万细胞/以及5毫升培养基后计数的细胞计数器。
      注: 在图像采集过程中, 播种密度依赖于细胞增殖率和成像时间周期, 以 < 100% 汇合。
    2. 孵育细胞至少12小时, 以允许附着。
    3. 在进行 QPI 前, 用新鲜的媒介改变培养基。

2. QPI 收购

  1. 盖板滑动设置
    1. 用75% 乙醇溶液浸泡15分钟, 清洗好几次, 用运行去离子水冲洗, 并消毒. 把盖子滑入一个不育的层流罩中晾干。
    2. 小心地把盖子滑到一个6井板上, 以避免明显的气泡。确保盖板底部浸入培养基中 (最小5毫升/井)。
    3. 将盘子放入孵化器 (37 °c, 5% CO2和湿润气氛) 到平衡至少15分钟。如果在盖子上有雾, 用无菌棉签擦拭干净。
  2. 用显微镜成像细胞
    1. 打开软件初始化系统, 包括曝光时间的自标定、模式对比度和全息图噪声。请确保这些值是可接受的 (以绿色或黄色范围显示)。
    2. 把6井板放到 QPI 显微镜的舞台上。
    3. 单击 "实时捕获", 然后在 "软件焦点" 中选择 "手动"。通过调整 "显微镜设置" 中的工作距离, 粗略地聚焦细胞的相位图像, 获得相图中细胞的轮廓。在 "软件焦点" 中更改为 "自动"。
    4. 点击 "新实验" 来创建一个新的实验。首先使用鼠标或数字键盘上的箭头键选择图像采集位置。在每次选择后单击 "记住"。通常 3-5 个位置为每个样品被选择。
    5. 设置 "Timelapse" 部分的成像间隔和时间段。
      注意: 要清楚地跟踪癌细胞, 间隔应短于5分钟, 48 小时设置为组合 QPI 分析的时间段。
    6. 通过单击 "捕获" 来启动实验, 它将自动聚焦并在设置时间点获取图像。

3. 数据分析

  1. 细胞形态学分析
    1. 单击 "识别单元格"。调整 "背景阈值" 的数值设置, 使单元格区域与背景噪音很好地分离。调整 "对象大小" 的设置编号, 以确保每个单元格都有一个核。为需要比较的样本保持一致的参数, 因为这可能会影响最终的面积和体积测量。如果需要, 请使用 "手动更改" 手动修改单元格段。
    2. 使用软件中的 "分析数据" 功能对单元格进行分析。通过单击 "新分析" 开始新的数据分析。将所选图像拖动到 "源框架" 选项卡和单元格形态学参数, 包括单元格区域 (µm2)、光学厚度 (µm) 和每个单元格的卷 (µm3)。选择散点图或直方图模式, 并将数据导出为表或数字。
  2. 细胞增殖分析
    1. 为不同的时间点选择至少5个图像 (例如、初始、12 h、24 h、36 h 和 48 h)。记录由软件提供的单元格编号。
    2. 为了估计加倍时间, 在与初始数正常化后绘制细胞数, 并拟合指数生长曲线。
  3. 细胞运动分析
    1. 在软件中使用 "跟踪单元" 功能。单击 "新分析" 开始新的数据分析。在 "源框架" 选项卡中, 将选定时间段 (例如、4小时后的 24 h 孵化) 中的图像拖动一系列. 通过单击 "添加单元格" 选择模式下的单元格随机选择 10-30 单元格。排除边缘的单元格和移出视图的区域。
    2. 仔细检查图像序列中的跟踪。如果系统失去对单元格的跟踪或跟踪错误的单元格, 请通过单击 "确定" 以识别单元格, 或单击 "选择" 模式下的 "修改位置" 来修改单元格位置, 手动调整跟踪单元格。
    3. 选择 "剧情运动" 中的细胞轨迹的玫瑰图, 或在 "剧情特征" (如运动速度 (µm)、运动 (µm)、迁移 (µm) 和迁移直接性等与运动相关的参数上绘制图。将数据导出为表或数字。

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Representative Results

图 1描述了典型的细胞形态学特征。图像显示为全息图(图1A-b) 和2D 图像 (图1C D)。光学细胞厚度 (从折射率和光学路径长度计算) 通过线剖面或整个细胞测量来量化。绘制了用于整个单元格的 KHOS 和 KHOS 单元的面积和厚度的散射图, 如图 1EG所示, 这两个表型显示不同的分布模式。直方图中的平均数字 (图 1HM) 或导出的文件表明, KHOS 单元格区域比 KHOS 细胞小, 且厚度更大。

使用单元格计数器函数, 获得了单元格增殖配置文件 (图 2)。这些并没有显示出 KHOS 和 N 细胞之间的显著差异。此外, 细胞加倍的时间可以估计从增殖曲线 (即, 24-26 小时), 这也没有显着的差异。

图 3A-d显示了非方向性 (随机) 运动模式中 KHOS 和 N 单元格的典型跟踪以及相应的轨迹。平均细胞动力 (图 3EF), 运动速度(图 3GH), 迁移距离(图 3I-J)和迁移直接(图 3KL)被绘制为与记录时间相比较。与 KHOS 细胞相比, KHOS 细胞表现出更大的运动速度, 从而产生更长的运动和迁移距离。

Figure 1
图 1: 细胞形态学特征.(A-B)KHOS 的代表性全息图-- (A ) 和-n 单元格(B ) 的定量相位成像。刻度条为191.4 µm. 在右下角插入, 显示图像中绘制的蓝线的光学厚度的定量线轮廓。(C D)具有代表性的 QPI 图像 KHOS 的单元格分割- (C)和-n 单元格(D)。刻度条为100µm. 在边缘的细胞被排除为定量。(E G)KHOS 单个单元格的测量厚度与区域- (E)和-n 单元格(F)。每个点代表一个单个单元格 (n = 200-300)。重叠图(G)显示了 KHOS 和-n 单元格的不同色散模式。(H M)单元格粗细的直方图(h I)、区域(J K)和卷(L M)分布 KHOS ( H、J、L)和-n 单元格(I、K、M)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 细胞增殖特性.上部面板显示了用于计数细胞数的代表性细胞分割。刻度条为100µm。底部面板显示相应的计算细胞增殖率。数据被显示为平均值, 即标准差。学生的 t 检验 (配对, 双尾) 用于统计分析。当p < 0.05 时, 测试结果被认为是重要的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 单元格运动特性.(A-B)KHOS 的代表性单元跟踪图像- (a)和-n (B)单元格。刻度条为100µm. 选定的单元格用不同的颜色勾勒出来。在4小时内记录的细胞运动呈对应的有色线。(C D)KHOS 的单元轨迹--从原点 (00) 绘制的(C)和-n (D)单元格。每行表示单个单元格。KHOS 细胞显示出比 KHOS 细胞更分散的模式 (n = 10)。(E L)KHOS 细胞运动的研究时间段记录的定量参数 A (E, G、I、K)和-n (F、H、J、L)单元格, 包括单元运动(E F), 运动速度(G H), 迁移距离(I J)和迁移直接式(K L)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在本研究中, 我们描述了一个体外, 无创, 无标签的方法, 使用 QPI 定量表征人骨肉瘤细胞的血管生成和非血管生成表型。采用综合、高通量的方法对多细胞参数进行了分析, 包括细胞面积、细胞厚度、细胞体积、增殖率、加倍时间、迁移直接、运动速度、迁移和运动。

与常规的细胞形态学和细胞行为评估方法相比, 该法不仅节省了时间和人工, 而且提供了更准确、更详细的信息。例如, QPI 系统 (细胞孵化器内部) 的位置减少了环境变化的干扰, 例如在环境中拍摄 (室温和大气)23。此外, 从相移转换的光学细胞厚度和体积, 可以用 QPI 获得, 而只有细胞面积是由传统的细胞成像过程来测量的。QPI 的这一特点为不同细胞表型的定量比较提供了更详细的信息。

在当前方法中, 感兴趣细胞的适当播种密度是至关重要的。在成像采集阶段, 由于这种相干 QPI 技术的局限性, 细胞预计会少于一个汇合的单层, 成像采集只能用一个焦点面板进行, 这可能会在 z 中丢失部分信息。方向 (即, 覆盖的单元格)。此外, 使用 QPI 的刻画被限制在2D 格式, 这不是最佳的细胞入侵在 z 方向在细胞外基质。未来 QPI 方法开发需要多个预设焦距。

除了细胞计数, QPI 成像还提供信息图像的研究细胞有丝分裂没有额外的标签21,23,24。细胞分裂通过细胞面积和体积的明显减少而容易识别, 但对于单细胞细胞周期阶段的客观和定量定义和分化的能力尚未建立。这种能力将极大地促进对干细胞分化、药物反应和细胞周期骤停的细胞分析的研究。

由于具有定量、无标签、易于使用等优点, 此方法还可能有实用的临床应用25,26,27,28,29,30.例如, 该系统可用于非均质细胞种群的定性, 包括人体肿瘤的休眠和活性细胞。休眠细胞和活性癌细胞的特征性细胞形态和行为差异可以用来破译肿瘤休眠的分子机制。

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Disclosures

没有宣布利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢乳腺癌研究基金会和先进医学研究基金会的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 flask Corning, NY, USA 353136
6-well plates  Corning, NY, USA 3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11965092
Fetal bovine serum (FBS)  Atlanta Biologicals, GA, USA S11550
Penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific, MA, USA 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 10010023
Beckman Z1 Coulter counter Beckman Coulter, IN, USA Z1 
HoloMonitor M4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden M4 Microscope
Hololid Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden PHI 8020
HStudioM4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden HStudioM4 Software

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