Summary
Fenotipi cellulari tumorali dormienti e attivi sono stati caratterizzati usando la formazione immagine fase quantitativa. Analisi di proliferazione, la migrazione e la morfologia delle cellule sono state integrate e analizzate in un metodo semplice.
Abstract
L'acquisizione del fenotipo angiogenico è una componente essenziale della fuga dalla dormienza del tumore. Anche se parecchi saggi classici in vitro (ad esempio, proliferazione, migrazione e altri) e in vivo modelli sono stati sviluppati per studiare e caratterizzare fenotipi cellulari angiogenici e non-angiogenici, questi metodi sono tempo lavoro intensivo e spesso richiedono costosi reagenti e strumenti, nonché significative esperienze. In un recente studio, abbiamo usato una romanzo fase quantitativa (QPI) tecnica di imaging per condurre time-lapse e privo di etichettatura caratterizzazioni di cellule umane di osteosarcoma KHOS angiogenici e non-angiogenici. Un pannello dei parametri cellulari, tra cui la morfologia delle cellule, la proliferazione e la motilità, sono stati misurati quantitativamente e analizzati usando QPI. Questo romanzo e l'approccio quantitativo offre l'opportunità di continuamente e in modo non invasivo di studio pertinenti processi cellulari, comportamenti e le caratteristiche delle cellule tumorali e altri tipi di cellule in modo semplice e integrato. Questo rapporto descrive il nostro protocollo sperimentale, tra cui la preparazione delle cellule, QPI acquisizione e analisi dei dati.
Introduction
Uno dei primi punti di controllo nello sviluppo e nella progressione di un tumore solido è l'acquisizione del fenotipo angiogenico, un marchio di garanzia di cancro. Questa progressione comporta tutta una serie di processi biochimici e molecolari1,2,3. Una sfida tecnica nello studio di questo passaggio chiave nella progressione del tumore è la mancanza di strumenti per continuamente e quantitativamente caratterizzare e distinguere tra fenotipi angiogenici e non-angiogeniche delle cellule tumorali dal vivo in modo imparziale. Le analisi tradizionali utilizzate per indagare i comportamenti cellulari delle cellule angiogenici e non-angiogenici solitamente richiedono strumenti e reagenti costosi, ad esempio, proliferazione e migrazione di cellule dosaggi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 o complementari in vivo valutazioni4,5,6,8,15,16, come pure che richiedono ad alta intensità e significativa esperienza consumo di tempo e manodopera.
Recentemente, la fase quantitativa imaging (QPI) è emerso come una nuova tecnica che consente la valutazione di time-lapse e privo di etichettatura di una varietà di cellula morfologia e comportamento parametri17,18,19, 20 , 21 , 22. a differenza di microscopia ottica convenzionale, QPI quantifica variazioni di pixel per pixel di sfasamento dopo luce passa attraverso un oggetto ottico e ricostruisce un testamento olografo con spessore ottico convertito e volume, consentendo in tal modo la diretta analisi di cellule vive e le seguenti caratteristiche: (1) quantitativa imaging, imaging (2) non-invasivo e time-lapse, imaging (3) privo di etichetta e (4) simultanea multi-parametro imaging. Queste caratteristiche rendono QPI un potente strumento per valutare e comprendere i processi patologici a livello cellulare.
In un recente studio, abbiamo utilizzato QPI per quantitativamente caratterizzare e distinguere tra angiogenici KHOS-A e non-angiogenici KHOS-N fenotipi di cellule di osteosarcoma umano in maniera sistematica e quantitativa, combinando analisi della morfologia delle cellule, proliferazione e la motilità23. Utilizzando software di analisi di immagine, un pannello di cella morfologica e comportamento parametri quantitativamente sono stati confrontati fra le cellule di osteosarcoma umano angiogenici e non-angiogenici e sono state identificate cinque differenze di caratteristiche tra questi due fenotipi. Questo approccio novello fornisce una piattaforma integrata e quantitativa per valutare una gamma di caratteristiche cellulari biologicamente rilevanti.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da ospedale Comitato bambini di Boston biosicurezza istituzionale.
1. cella preparazione
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Lo scongelamento KHOS-A e cellule -N
- Riscaldare il terreno di coltura, cioè, Dulbecco per volta supplementato Eagle con 10% di siero fetale di vitello (vol/vol) (FBS) e 1% (vol/vol) penicillina/streptomicina.
- Prendere le fiale criogeniche delle cellule dal serbatoio di azoto liquido, il fondo delle fiale non immergere in acqua calda a bagnomaria a 37 ° C e agitare delicatamente i flaconi criogenici per accelerare il processo di scongelamento. Tenere il coperchio delle fiale criogeniche dal contatto con acqua, per evitare contaminazioni. Non appena le cellule vengono scongelate, sterilizzare il flaconcino criogenico spruzzando soluzione di etanolo 70% e asciugandosi il flaconcino.
- In una cappa a flusso laminare, aspirare immediatamente la sospensione cellulare dal flaconcino criogenico e delicatamente sospendere in terreno di coltura 10ml riscaldato (descritto al punto 1.1.1). Centrifugare le sospensioni delle cellule a circa 200 x g per 5-7 min.
- Risospendere il pellet cellulare con terreno di coltura 10ml riscaldato e trasferire in un matraccio T75. Pipettare delicatamente più volte a sospendere le cellule in modo uniforme utilizzando una pipetta da 10 mL.
- Collocare la beuta in un incubatore a 37 ° C con 5% (vol/vol) CO2 e atmosfera umidificata. Consentire alle cellule di fissare per almeno 12 ore.
- Incubare le cellule per circa 3-7 giorni fino a 80-100% confluenti. Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
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Spaccare KHOS-A e cellule -N
- Rimuovere il supporto di cultura dal pallone.
- Lavare le cellule con 5 mL di PBS sterile (1x) senza calcio e magnesio, per rimuovere le cellule non aderenti o frazione.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di 0.05% tripsina-EDTA nel pallone, e agitare brevemente il pallone per garantire che la tripsina-EDTA è disperso in modo uniforme.
- Incubare la beuta per 2-3 min in un incubatore a 37 ° C o 3-5 min a temperatura ambiente. Controllare le cellule con un microscopio a circa 400 ingrandimenti per assicurarsi che le celle sono arrotondate e staccate.
- Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere 10 mL terreno di coltura e pipettare delicatamente il mezzo su e giù più volte per spezzare aggregati cellulari in sospensione singola cella utilizzando una pipetta da 10 mL.
- Contare le celle utilizzando un contatore di cellule. La sospensione cellulare del seme in nuovo T75 matracci a una densità di 2 × 106 cellule o un rapporto di 1:4.
- Consentire alle cellule di crescere alla confluenza di 80-100% prima della semina per l'esperimento QPI.
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Seeding KHOS-A e -N celle per QPI
- Seme KHOS-A e -N cellule in piastre da 6 pozzetti alla densità di 50.000-300.000 cellule/pozzetto con 5 mL di coltura dopo il conteggio con un contatore di cellule.
Nota: La densità di semina dipende il tasso di proliferazione delle cellule e il formazione immagine periodo di tempo al fine di avere < 100% confluenza durante acquisizione di imaging. - Incubare le cellule per almeno 12 ore consentire l'attaccamento.
- Modificare il mezzo con media fresco prima di condurre QPI.
- Seme KHOS-A e -N cellule in piastre da 6 pozzetti alla densità di 50.000-300.000 cellule/pozzetto con 5 mL di coltura dopo il conteggio con un contatore di cellule.
2. QPI acquisizione
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Vetrini coprioggetto istituito
- Pulire il vetrino coprioggetto risciacquando più volte con acqua deionizzata e sterilizzare con soluzione di etanolo di 75% per immersione per 15 minuti, mettere il vetrino coprioggetto in una cappa a flusso laminare sterile ad asciugare.
- Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto sul piatto 6-pozzetti per evitare bolle ovvie. Verificare che il fondo di vetrini coprioggetto è immerso nel mezzo di coltura (minimo 5 mL/pozzetto).
- Posizionare la piastra in incubatrice (37 ° C, 5% CO2e atmosfera umidificata) stabilizzare per almeno 15 min. Se la nebbia si forma sui vetrini coprioggetto, utilizzare un tampone di cotone sterile per pulirlo.
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Cellule di imaging con un microscopio
- Aprire il software per inizializzare il sistema, tra cui autocalibrazione del tempo di esposizione, il contrasto di modello e rumore di ologramma. Assicurarsi che i valori siano accettabili (mostrato nella fascia verde o giallo).
- Posizionare la piastra a 6 pozzetti sul palco del microscopio QPI.
- Fare clic su "Live Capture" e selezionare "Manuale" a "Fuoco Software." Grossolanamente a fuoco le immagini di fase delle cellule regolando la distanza di lavoro "Impostazione del microscopio" per ottenere contorni per le celle in immagini di fase. Modificare in "Automatico" a "Fuoco Software."
- Fai clic su "Nuovo esperimento" per creare un nuovo esperimento. Iniziare con la selezione delle posizioni di acquisizione immagine utilizzando il mouse o i tasti freccia sul tastierino numerico. Fare clic su "Memorizza" dopo ogni selezione. Normalmente 3-5 posizioni per ciascun campione sono selezionate.
- Impostare gli intervalli di imaging e il periodo di tempo nella sezione "Timelapse".
Nota: Per tenere traccia di cellule tumorali chiaramente, gli intervalli devono essere inferiore a 5 min 48 ore è impostato come periodo di tempo per la combinazione di analisi QPI. - Iniziare l'esperimento facendo clic su "Cattura", che verrà automaticamente a fuoco e acquisire le immagini a intervalli di tempo di impostazione.
3. analisi dei dati
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Analisi della morfologia di cellule
- Fare clic su "Identificare cellule." Regolare l'impostazione numerica per "Soglia di sfondo" in modo che aree di celle sono separati anche dal rumore di fondo. Regolare il numero di impostazione per "Dimensioni dell'oggetto" per assicurarsi che ogni cellula ha un nucleo. Mantenere i parametri coerenti per i campioni che devono essere confrontati, come possono interessare le misure finali di area e volume. Se necessario, modificare manualmente segmenti di cella utilizzando "Modifiche manuali,".
- Utilizzare la funzione "Analisi dati" nel software per analizzare le cellule. Avviare una nuova analisi di dati facendo clic su "Nuova analisi". Trascinare le immagini selezionate in "Fotogrammi sorgente" scheda e cella morfologia parametri tra cui area di cella (µm2), spessore ottico (µm) e volume (µm3) per ogni singola cella. Scegliere scatter plot o istogramma modalità ed esportazione dati come tabelle o figure.
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Analisi di proliferazione delle cellule
- Selezionare almeno 5 immagini per i diversi momenti di interesse (ad es., iniziale, 12h, 24h, 36h e 48 h). Numeri di record delle cellule che sono forniti dal software.
- Per stimare il tempo di raddoppiamento, tracciare i numeri delle cellule dopo normalizzazione con i numeri iniziali e in forma con curve di crescita esponenziale.
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Analisi del movimento cellulare
- Utilizzare la funzione "Track cellule" nel software. Fare clic su "Nuova analisi" per avviare una nuova analisi di dati. Serie di trascinamento di immagini per un periodo di tempo selezionato (ad esempio, 4 h dopo 24 ore di incubazione) nella scheda "Fotogrammi sorgente" scegliere casualmente 10-30 celle facendo clic su celle sotto la modalità di selezione "Aggiungere celle". Escludere le cellule ai bordi e coloro che si spostano fuori del campo di vista.
- Controllare attentamente il tracciamento della serie di immagini. Nel caso in cui il sistema perde traccia di una cella o tracce nella cella sbagliata, regolare manualmente la cella di rilevamento facendo clic su "Identificare" per identificare le celle o facendo clic su "Modifica posizione" sotto la modalità "Select" per modificare la posizione della cella.
- Scegliete rosa trama delle traiettorie delle cellule nel "Movimento di trama" e trama per gli altri parametri dovute al movimento in "Caratteristiche di trama," come velocità di motilità (µm/h), motilità (µm), migrazione (µm) e l'immediatezza di migrazione. Esportare i dati come tabelle o figure.
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Representative Results
Figura 1 raffigura una caratterizzazione di morfologia tipica delle cellule. Immagini sono presentate come olografia (Figura 1A-B) e immagini 2D (Figura 1-D). Spessori di cellula ottica (calcolati l'indice di rifrazione e la lunghezza del cammino ottico) vengono quantificati tramite linea profilo o una misura di tutta la cella. Dispersione della zona e spessore di KHOS-A e sono stati tracciati KHOS-N celle misurate per una cella intera, come in Figura 1E-G, dove questi due fenotipi visualizzato diverse distribuzioni. I numeri di medio dall'istogramma (Figura 1 H-M) o i file esportati ha dimostrato che KHOS-A cellule più piccole aree di celle e spessori maggiori rispetto alle cellule KHOS-N.
Utilizzando la funzione di contatore di cella, profili di proliferazione delle cellule sono stati ottenuti (Figura 2). Questi non hanno mostrato una differenza significativa tra KHOS-A e -N celle. Inoltre, il tempo di raddoppiamento di cella potrebbe essere valutata dalla curva di proliferazione (cioè, h 24-26), che inoltre non ha mostrato differenze significative.
Figura 3A -D Mostra il tipica tracking di KHOS-A e -N celle in non-direzionale (casuale) movimento modalità le traiettorie corrispondente. La motilità cellulare medio (Figura 3E-F), velocità di motilità (Figura 3-H), distanza di migrazione (Figura 3I-J)e l'immediatezza della migrazione (Figura 3 K-L) sono state tracciate contro tempo di registrazione. Confrontato alle cellule di KHOS-N, KHOS-A cellule hanno mostrato una maggiore velocità di motilità, con conseguente maggiore distanza di motilità e migrazione.
Figura 1: caratterizzazione della morfologia di Cell. (A-B) Olografia rappresentativo delle cellule (A) e -N KHOS-A (B) di quantitativi di fase imaging. Barra della scala è che 191,4 µm. inserti nell'angolo in basso a destra mostrano il profilo di linea quantitativa di spessore ottico per la linea blu disegnata nelle immagini. (C-D) Immagini di QPI rappresentante di segmentazione di cella per le celle (C) e -N KHOS-A (D). Barra della scala è che 100 µm. cellule ai bordi sono stati esclusi per la quantificazione. (E-G) Spessore misurato contro zona per le singole celle delle cellule (E) e -N di KHOS-A (F). Ogni punto rappresenta una singola cella (n = 200-300). La trama di sovrapposizione (G) Mostra di modelli di dispersione significativamente differenti per KHOS-A e -N celle. (H-M) Gli istogrammi di spessore della cella (H-I), (J-K)di volume (L-M) distribuzione per KHOS-A (H, J, L) e -N cells (I, K, M). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione di proliferazione di Cell. Il pannello superiore Mostra segmentazione cellulare rappresentativo per il conteggio dei numeri di cellulare. Barra della scala è 100 µm. Il pannello inferiore mostra il corrispondente tasso di proliferazione di cella calcolata. Dati sono presentati come media ± deviazione standard. Test t di Student (spaiato, a due code) è stato utilizzato per le analisi statistiche. Risultati dei test sono stati considerati significativi p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: caratterizzazione del movimento di cella. (A-B) Tracciamento cellulare rappresentativo immagini per KHOS-A (A) e -N (B) cellule. Barra della scala è 100 µm. Selected cellule sono delineate con colori diversi. Motilità cellulare registrata in un 4h periodo di tempo è presentata con la corrispondente riga colorata. (C-D) Traiettorie delle cellule delle cellule di KHOS-A (C) e -N (D) tracciata dal punto di origine (0,0). Ogni riga rappresenta una singola cella. KHOS-A cellule hanno mostrato un modello più disperso rispetto alle cellule di KHOS-N (n = 10). (E-L) Registrati parametri quantitativi durante il periodo di tempo oggetto dell'inchiesta per il movimento delle cellule di KHOS-A (E, G, I, K) e -N (F, H, J, L) cellule, tra cui cellulare motilità (E-F), velocità di motilità (G-H), distanza di migrazione (I-J )e l'immediatezza di migrazione (K-L). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, descriviamo un in vitro, non invasivo e privo di etichetta metodo usando QPI per caratterizzare quantitativamente i fenotipi angiogenici e non-angiogeniche delle cellule di osteosarcoma umano. Più parametri cellulari sono stati analizzati simultaneamente da questo metodo integrato, ad alta produttività, tra cui area di cella, spessore della cella, volume delle cellule, il tasso di proliferazione, raddoppiando il tempo, immediatezza di migrazione, velocità di motilità, migrazione e motilità.
Confrontato con i dosaggi convenzionali che valutano la morfologia delle cellule e cellula comportamenti, questo metodo non solo consente di risparmiare tempo e manodopera, ma fornisce anche informazioni più accurate e dettagliate. Ad esempio, la posizione del sistema QPI (all'interno dell'incubatore di cella) riduce le dispersioni da cambiamenti ambientali come fotografare in un contesto ambientale (temperatura e atmosfera)23. Inoltre, spessore ottico della cella e volume, convertito da spostamento di fase, potrebbe essere ottenuti con QPI, considerando che solo area di cella viene misurata dalla cella tradizionale processo di imaging. Questa caratteristica di QPI genera informazioni più dettagliate per confronti quantitativi dei fenotipi cellulari diversi.
Adeguata densità di semina delle cellule di interesse è fondamentale nel metodo corrente. Durante la fase di acquisizione immagini, cellule dovrebbero essere meno di un monostrato confluente a causa della limitazione di questa tecnica QPI coerente che acquisizione di imaging può essere eseguita solo con pannello di un fuoco, che potrebbe perdere informazioni parziali nel z direzione (cioè, cellule sovrapposte). Inoltre, caratterizzazioni utilizzando QPI sono limitati nel formato 2D, che non è ottimale per l'invasione delle cellule nella direzione z nella matrice extracellulare. Molteplici lunghezze focali preimpostate sono necessari per lo sviluppo futuro di metodologia QPI.
Oltre conta cellulare, formazione immagine QPI fornisce anche immagini informativi per lo studio della mitosi delle cellule senza ulteriori etichettatura21,23,24. Mentre la divisione cellulare è stata riconosciuta facilmente tramite la diminuzione evidente in cellule di superficie e volume, la capacità di oggettivamente e quantitativamente definire e differenziare le fasi del ciclo cellulare per singole celle deve ancora essere stabilito. Questa funzionalità sarebbe significativamente facilitare la ricerca per quanto riguarda l'analisi delle cellule per la differenziazione delle cellule staminali, risposta ai farmaci e arresto del ciclo cellulare.
Grazie ai vantaggi di essere quantitativa, privo di etichetta e facile da usare, questo metodo può anche avere applicazioni cliniche utili25,26,27,28,29,30 . Ad esempio, questo sistema potrebbe essere utilizzato nella caratterizzazione delle popolazioni eterogenee delle cellule, compreso le cellule dormienti e attive nei tumori umani. Le differenze morfologiche e comportamentali di cellulare caratterizzato tra cellule tumorali dormienti e attivo possono essere potenzialmente utilizzate per decifrare i meccanismi molecolari sottostanti la dormienza del tumore nei cancri umani.
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Disclosures
Conflitti di interesse non dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno della Breast Cancer Research Foundation e Advanced Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
References
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