Summary
Спящие и активный рак клеток фенотипов характеризовались с использованием количественных этапа визуализации. Клетки распространения, миграции и морфология анализы были интегрированы и проанализированы в один простой способ.
Abstract
Приобретение ангиогенных фенотипа является важным компонентом побег из опухоли покоя. Хотя несколько классических в vitro анализов (например, распространение, миграция и другие) и в естественных условиях модели были разработаны для расследования и характеризуют ангиогенных и не ангиогенных клеток фенотипов, эти методы являются время и трудоемким и часто требуют дорогостоящих реагентов и инструментов, а также значительный опыт. В недавнем исследовании мы использовали Роман количественных этап визуализации (QPI) техника для проведения промежуток времени и без маркировки характеристики ангиогенных и не ангиогенных человека остеосаркома KHOS клеток. Группа клеточных параметров, включая морфологии клеток, распространение и моторики, измерялись количественно и анализируются с помощью QPI. Этот роман и количественный подход обеспечивает возможность непрерывно и неинвазивным изучить соответствующие клеточных процессов, поведения и характеристик раковых клеток и другие типы клеток в простой и комплексным образом. В настоящем докладе описываются наши экспериментальный протокол, включая подготовка клетки, QPI сбора и анализа данных.
Introduction
Один из первых контрольно-пропускных пунктов в развитии и прогрессировании твердых опухолей является приобретение ангиогенных фенотип, признаком рака. Этот прогресс включает в себя целый ряд биохимических и молекулярных процессов в1,2,3. Техническая проблема в изучении этой ключевой шаг в опухолевой прогрессии является отсутствие инструментов непрерывно и количественно охарактеризовать и дифференцировать между ангиогенных и не ангиогенных фенотипов живой раковых клеток в непредвзято. Традиционные анализы, используется для изучения клеточного поведения ангиогенных и не ангиогенных клеток обычно требуют дорогостоящих реагентов и инструментов, например, клеток распространения/миграции assays4,5, 6,,78,9,10,11,12,,1314 или Дополнительные в естественных условиях оценки4,5,6,8,15,16, а также требует значительного опыта и интенсивной расход времени и труда.
Недавно количественные этап визуализации (QPI) стала Роман технику, которая позволяет промежуток времени и маркировки свободной оценки различных клеток морфологии и поведении параметров17,18,19, 20 , 21 , 22. в отличие от обычных оптической микроскопии, QPI количественно вариации сдвиг фазы попиксельно после того, как свет проходит через оптический объект и реконструирует собственноручно с преобразованной оптической толщины и объем, таким образом позволяя прямой анализ живых клеток и следующие возможности: (1) количественные изображений, изображений (2)-неинвазивные и промежуток времени, (3) лейбл свободных изображений и (4) одновременно нескольких параметров визуализации. Эти особенности делают QPI мощный инструмент для оценки и понимания патологических процессов на клеточном уровне.
В недавнем исследовании, мы использовали QPI количественно охарактеризовать и дифференцировать между ангиогенных KHOS-A и не ангиогенных KHOS-N фенотипов клеток человека остеосаркома на основе систематического и количественных, объединяя анализ морфологии клеток, распространение и моторики23. С помощью программного обеспечения для анализа изображений, группа клеток морфологических и поведения параметров были количественно сравнить между ангиогенных и не ангиогенных клеток человека остеосаркома и были определены пять характерных отличий между этими двумя фенотипов. Этот новаторский подход обеспечивает комплексное и количественные платформу для оценки различных биологически соответствующих характеристик сотовой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь методы были одобрены Бостон Детская больница институциональных биобезопасности Комитета.
1. Подготовка клетки
-
Размораживание KHOS-A и -N клетки
- Разминка питательной среды, т.е., Дульбекко изменение среднего орла с 10% (vol/vol) плода телячьей сыворотки (ФБС) и 1% (vol/vol) пенициллина/стрептомицина.
- Возьмите криогенных флаконы клеток из бака жидким азотом, погрузиться в нижней части флаконов в теплую воду в водяной бане 37 ° C и осторожно встряхните криогенных флаконы для ускорения процесса размораживания. Держите крышку криогенных флаконов от контактов с воды во избежание загрязнения. Как только разморозить клетки, стерилизуйте криогенных флакона путем распыления 70% этанола раствор и вытирая флакона.
- Ламинарный шкаф немедленно аспирационная суспензию клеток от криогенных флакон и осторожно приостановить в 10 мл утепленные питательной среды (указанные в подпунктах 1.1.1). Центрифуга клеточных суспензий на примерно 200 g x 5-7 мин.
- Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл утепленные питательной среды и передачи в T75 колбу. Аккуратно Пипетка несколько раз приостановить клетки, равномерно с помощью пипетки 10-мл.
- Поместите колбу в 37 ° C инкубатор с 5% (vol/vol) CO2 и увлажненные атмосферой. Позволяют клеткам вложить по крайней мере 12 часов.
- Инкубации клеток для примерно 3-7 дней до 80-100% притока. Изменение культуры среднего каждые 2-3 дня.
-
Разделение KHOS-A и -N клетки
- Удалите медиа культуры из колбы.
- Вымыть клетки с 5 мл стерильной PBS (1 x) без кальция и магния, чтобы удалить не адэрентных клеток или дроби.
- Добавить 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА в колбу, и кратко вихрем Фляга для обеспечения что трипсин ЭДТА рассеивается равномерно.
- Инкубируйте Фляга для 2-3 мин в инкубаторе 37 ° C или 3-5 мин при комнатной температуре. Проверьте клетки под микроскопом при примерно 400-кратном чтобы убедиться, что клетки окружили и отсоединена.
- После того, как отдельные клетки, добавить 10 мл питательной среды и аккуратно Пипетка средних вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить агрегатов ячеек в одну ячейку подвеска с помощью пипетки 10 мл.
- Подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток. Семя суспензию клеток в новой T75 колбы на плотность 2 × 106 клеток или в соотношении 1:4.
- Позволяют клеткам расти до 80-100% слияния перед посевом для эксперимента QPI.
-
Заполнение KHOS-A и -N клетки для QPI
- Семя KHOS-A и -N клетки в 6-ну пластины при плотности 50 000-300 000 клеток/колодец с 5 мл питательной среды после подсчета с счетчик соматических клеток.
Примечание: Плотность посева зависит скорость распространения клеток и периода времени изображений для того чтобы иметь < 100% слияния во время обработки изображений приобретения. - Инкубируйте клетки для по крайней мере 12 h Разрешить вложение.
- Изменения в среду с свежими СМИ перед проведением QPI.
- Семя KHOS-A и -N клетки в 6-ну пластины при плотности 50 000-300 000 клеток/колодец с 5 мл питательной среды после подсчета с счетчик соматических клеток.
2. QPI приобретение
-
Крышка выскальзования, Настройка
- Очистите крышку выскальзования путем полоскания несколько раз с дейонизированной водой и стерилизуют с 75% этанола раствор путем погружения в воду на 15 мин, положите крышку выскальзования в стерильных Ламинарный шкаф для сушки.
- Осторожно поместите крышку выскальзования на пластину 6-Ну чтобы избежать очевидных пузыри. Убедитесь, что в нижней части крышки выскальзования погружается в культуру СМИ (минимум 5 мл/хорошо).
- Место пластину в инкубатор (37 ° C, 5% CO2и увлажненные атмосферу) сбалансировать по крайней мере 15 минут. Если туман образуется на крышку выскальзования, используйте стерильным ватным тампоном протирать чистой.
-
Визуализации ячейки с помощью микроскопа
- Открытое программное обеспечение для инициализации системы, в том числе самостоятельной калибровки времени экспозиции, контраста шаблон и голограммы шума. Убедитесь, что значения являются приемлемыми (показан в диапазоне зеленый или желтый).
- Место пластину 6-Ну на этап микроскопа QPI.
- Нажмите кнопку «Динамический захват» и выберите «Руководство» в «Программное обеспечение внимание.» Крупно фокусировать изображения этап клеток, регулируя расстояние работы в «Микроскоп установка» для получения контуров для ячеек в фазе изображений. «Автоматический» в «Программное обеспечение внимание.»
- Нажмите кнопку «Новый эксперимент» создать новый эксперимент. Начните с выбора позиций приобретения изображений с помощью мыши или клавиш со стрелками на цифровой клавиатуре. После каждого выбора, нажмите «Запомнить». Обычно выбираются 3-5 места для каждого образца.
- Настройка визуализации интервалы и период времени в разделе «Timelapse».
Примечание: Чтобы четко отслеживать раковые клетки, интервалы должны быть короче, чем 5 минут 48 часов как период времени для комбинации QPI анализ. - Запустите эксперимент, нажав «Захвата», который будет автоматически сосредоточиться и получить изображения в точках времени настройки.
3. анализ данных
-
Анализ морфологии клеток
- Нажмите кнопку «Определить клетки.» Настройка числового параметра для «Фон порог» так, что клетки районы отделены от фонового шума. Задайте значение параметра параметр «Размер объекта» чтобы убедиться, что каждая клетка имеет одно ядро. Поддерживать последовательную параметры для образцов, которые нужно сравнить, как они могут повлиять на окончательный измерения площади и объема. Вручную измените клетки сегменты с помощью «Изменения вручную», если необходимо.
- Используйте функцию «Анализ данных» программного обеспечения для анализа клеток. Начать новый анализ данных, нажав кнопку «Новый анализ.» Перетащите выбранные изображения в «Источник кадров» вкладку ячейка морфология параметры и включая область ячейки (2мкм), оптической толщины (мкм) и объем (3мкм) для каждой отдельной ячейки. Выберите Точечная график или Гистограмма режим и экспорта данных как таблицы или рисунки.
-
Анализ распространения клеток
- Выберите по крайней мере 5 изображений для различных временных точек интереса (например, первоначальный, 12 h, 24 h, 36 h и 48 ч). Номера записи ячейки, предоставляемые программного обеспечения.
- Чтобы оценить время удвоения, участок числа клеток после нормализации с первоначальной цифры и подходят с кривых экспоненциального роста.
-
Анализ движения клеток
- Используйте функцию «Трек клетки» в программном обеспечении. Нажмите кнопку «Новый анализ» чтобы начать новый анализ данных. Перетащите серии изображений для выбранного периода времени (например, 4 h после 24 ч инкубации) в закладке «Источник кадров» случайным образом выбирать ячейки 10-30, нажав клетки под режим выделения «Добавить клетки». Исключите ячейки по краям и тех, кто перемещается из поля зрения.
- Тщательно проверьте отслеживания в серии изображений. В том случае, если система теряет ячейки или отслеживает неправильные ячейки, вручную настройте Отслеживание Сотовые, нажав «Определение» для выявления клеток или нажав кнопку «Изменить место» в режиме «Выбрать» Изменить место расположения ячейки.
- Выберите розы участок клеток траекторий в «Участок движения» или участок для движения связанных параметров в «Участок функции, «подвижности скорость (микрон/ч), подвижность (мкм), миграция (мкм) и миграции прямого. Экспорт данных в таблицы или рисунки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 изображает морфология характеристика типичной клетки. Изображения представлены как голографии (рис. 1A-B) и 2D изображения (Рисунок 1 c-D). Оптическая ячейка толщины (рассчитывается от преломления и длиной оптического пути) количественно через линии профиля или клеточных измерения. Точечные и толщина KHOS-a и KHOS-N клеток измеряется для всей ячейки были построены, как Рисунок 1E-G, где эти два фенотипов отображаются различные распределения. Среднего числа от гистограмма (Рисунок 1 H-M) или экспортированных файлов показали, что KHOS-A клетки имеют меньшего размера ячейки и большей толщины, чем клетки KHOS-N.
Используя функцию счетчика клеток, клеток распространения профили были получены (рис. 2). Они не показывают существенное различие между KHOS-A и -N клеток. Кроме того можно оценить время удвоения клеток от распространения кривой (то есть, h 24-26), которая также не показывают существенные различия.
На рисунке 3A -D показывает типичный отслеживания KHOS-A и -N клеток в ненаправленный (случайных) движения режима и соответствующей траектории. Средняя ячейка подвижности (Рисунок 3E-F), подвижности скорость ()Рисунок 3 g-H), миграции расстояние ()Рисунок 3I-J)и миграции непосредственность ()Рисунок 3 K-L) были нанесены против времени записи. По сравнению с KHOS-N клеток, клеток KHOS-A показал большей подвижности скорость, приводит в большем расстоянии подвижности и миграции.
Рисунок 1: клетки характеристика морфология. (A-B) Представитель голографии (A) и -N клеток KHOS-A (B) , количественные этапа визуализации. Линейки шкалы является 191.4 мкм. вставками в правом нижнем углу показывают количественных линии профиля оптической толщины для голубой линии, проведенной в изображениях. (C-D) Представитель QPI изображения клетки сегментации для KHOS-A (C) и -N клеток (D). Линейки шкалы является 100 µm. клетки на краях были исключены для количественной оценки. (E-G) Измеренной толщины против уголок для отдельных ячеек клеток KHOS-A (E) и -N (F). Каждая точка представляет отдельную ячейку (n = 200-300). Совпадение участка (G) показывает значительно различных дисперсионных моделей для KHOS-A и -N клеток. (H-M) Гистограммы клеток толщины (H-я), площадь (J-K)и объем распределения (L-M) для KHOS-A (H, J, L) и -N клеток (I, K, M). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: клетки характеристика распространения. Верхняя панель показывает представитель клеток сегментации для подсчета числа клеток. Линейки шкалы составляет 100 мкм. На нижней панели показывает соответствующий показатель распространения вычисляемой ячейки. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Студента t-тест (непарных, двустороннее) был использован для статистического анализа. Результаты тестирования были значительными при p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ячейки движения характеристика. (A-B) Представитель ячейки отслеживания изображения KHOS-A (A) и -N клетки (B) . Линейки-100 мкм. выбранные ячейки описаны с различными цветами. Подвижности клеток, записанная в 4 h период времени представлен с соответствующей цветные линии. (C-D) Траекторий клеток клеток KHOS-A (C) и -N (D) нанесены с точки зрения происхождения (0,0). Каждая строка представляет отдельную ячейку. KHOS-A клетки показан шаблон более рассредоточенных по сравнению с клетками KHOS-N (n = 10). (E-Л) Записанный количественных параметров во время периода исследуемого времени для ячейки движения KHOS-a (E, G, I, K) и -N (F, H, J, L) клеток, включая клетки подвижности (E-F), подвижности скорость (G-H), миграция расстояние (I-J )и прямоту миграции (K-L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описываем в пробирке, неинвазивная и этикетка бесплатно использование метода QPI количественно характеризовать ангиогенных и не ангиогенных фенотипов клеток человека остеосаркома. Одновременно были проанализированы несколько клеточных параметров этим методом комплексной, высокой пропускной способности, включая область ячейки, ячейки толщина, объем ячейки, скорость распространения, удвоение время, миграции непосредственность, подвижности скорость, миграции и подвижности.
По сравнению с обычными анализов, которые оценить морфологию клеток и клеток поведения, этот метод не только экономит время и труд, но также обеспечивает более точную и подробную информацию. Например расположение QPI системы (внутри клетки инкубатора) уменьшает помехи от экологических изменений например, фотографирования в окружающей среды (комнатной температуры и атмосферы)23. Кроме того толщина оптические клеток и тома, преобразованные из фазового сдвига, можно получить с QPI, тогда как только ячейки области измеряется традиционной ячейки визуализации процесса. Эта функция QPI создает более подробную информацию для количественного сравнения различных клеточных фенотипов.
Надлежащего заполнения плотность клеток интерес имеет решающее значение в текущем методе. На этапе приобретения изображений клетки, как ожидается, будет меньше, чем вырожденная однослойные из-за ограничений этой согласованной методики QPI, что изображений приобретение может быть выполнена только с одной фокус-группой, которая может потерять частичную информацию в z направление (то есть, обложил клетки). Кроме того характеристики с помощью QPI ограничены в 2D формат, который не является оптимальным для клеток вторжения в направлении z в внеклеточного матрикса. Несколько предустановленных фокусных необходимы для будущего развития методологии QPI.
Кроме подсчета клеток, QPI изображений также обеспечивает информативные изображения для изучения митозе клеток без дополнительной маркировки21,23,24. В то время как деление клеток легко признана очевидное снижение ячейки области и объем, способность объективно и количественно определить и дифференцировать стадии клеточного цикла для одиночных клеток еще должен быть создан. Эта возможность значительно облегчит исследования относительно анализа клеток для дифференцировки стволовых клеток, ответ наркотиков и арест клеточного цикла.
Из-за преимущества количественные, лейбл бесплатный и простой в использовании этот метод может также иметь полезные клинические приложения25,26,27,28,29,30 . Например эта система может использоваться в характеристике гетерогенных клеточных популяций, включая спящие и активных клеток человека опухоли. Характеризуется клеток морфологических и поведенческих различий между спящие и активных раковые клетки потенциально может использоваться расшифровать молекулярные механизмы лежащие в основе покоя опухоли раковых заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признаем поддержку Фонд исследований рака молочной железы и расширенный медицинский исследовательский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
References
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
- Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
- Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
- Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
- Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
- Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
- Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
- Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
- Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
- Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001 (2012).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395 (2012).
- Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
- Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
- Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
- Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
- Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369 (2013).
- Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546 (2014).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000 (2014).
- Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
- Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
- Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676 (2013).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976 (2015).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257 (2016).
- Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).
