Summary
Vilande och aktiv cancer cell fenotyper präglades med hjälp av kvantitativa fas imaging. Cell proliferation, migration och morfologi analyser var integrerade och analyseras i en enkel metod.
Abstract
Förvärvet av angiogena fenotypen är en viktig komponent i flykten från tumör dvala. Även om flera klassiska in vitro- analyser (t.ex., spridning, migration och andra) och i vivo modeller har utvecklats för att utreda och karakterisera angiogena och icke-angiogena cell fenotyper, är dessa metoder tid och labor intensiv, och ofta kräver dyra reagens och instrument, samt betydande expertis. I en färsk studie använde vi en roman kvantitativa fas bildteknik (QPI) för att genomföra time-lapse och märkning-gratis karakteriseringar av angiogena och icke-angiogena mänskliga osteosarkom KHOS celler. En panel av cellulära parametrar, inklusive cellmorfologi, spridning och motilitet, mättes kvantitativt och analyseras med QPI. Denna roman och kvantitativ metod ger möjlighet att kontinuerligt och icke-invasivt studera relevanta cellulära processer, beteenden och egenskaper hos cancerceller och andra celltyper i ett enkelt och integrerat sätt. Rapporten beskriver vår experimentella protokoll, inklusive cell förberedelse, QPI anskaffning och dataanalys.
Introduction
En av de tidigaste kontrollpunkterna i utvecklingen och utvecklingen av en solid tumör är förvärvet av angiogena fenotypen, ett kännetecken för cancer. Denna utveckling innebär en mängd olika biokemiska och molekylära processer1,2,3. En teknisk utmaning i studien av detta viktiga steg i tumör progression är bristen på verktyg för att kontinuerligt och kvantitativt karakterisera och skilja mellan angiogena och icke-angiogena fenotyper av levande cancerceller på ett opartiskt sätt. De traditionella analyser som används för att undersöka cellulära beteenden av angiogena och icke-angiogena celler brukar kräva dyra reagens och instrument, till exempel cell spridning/migration analyser4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 eller kompletterande in-vivo utvärderingar4,5,6,8,15,16, samt som kräver betydande expertis och intensiv tid och labor konsumtion.
Nyligen, kvantitativa fas imaging (QPI) har vuxit fram som en ny teknik som möjliggör time-lapse och märkning-fri bedömning av en mängd cell morfologi och beteende parametrar17,18,19, 20 , 21 , 22. till skillnad från konventionella optisk mikroskopi, kvantifierar QPI varianter av fasförskjutning pixel för pixel när ljus passerar genom ett optiskt objekt och rekonstruerar ett holografiskt med konverterade optisk tjocklek och volym, vilket gör det möjligt att direkt analys av levande celler och följande funktioner: (1) kvantitativa imaging, (2) icke-invasiv och time-lapse imaging, (3) etikett-fri imaging och (4) samtidiga multi-parameter imaging. Dessa funktioner gör QPI ett kraftfullt verktyg för att bedöma och förstå patologiska processer på cellulär nivå.
I en färsk studie, utnyttjade vi QPI för att kvantitativt karakterisera och skilja mellan angiogena KHOS-A och icke-angiogena KHOS-N fenotyper av mänskliga osteosarkom celler i en systematisk och kvantitativa sätt att kombinera analyser av cellmorfologi, spridning och motilitet23. Med bild analys programvara, en panel av cell morfologiska och beteende jämfördes kvantitativt parametrar mellan angiogena och icke-angiogena mänskliga osteosarkom celler och fem karakteristiska skillnader identifierades mellan dessa två fenotyper. Detta nya tillvägagångssätt ger en integrerad och kvantitativa plattform för att bedöma en mängd biologiskt relevanta cellulära egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla de metoder som beskrivs här har godkänts av Boston Children's Hospital institutionella Biosäkerhetskommittén.
1. cell förberedelse
-
Upptining KHOS-A och -N celler
- Värm upp odlingsmedium, dvsDulbecco's modified Eagle medium kompletteras med 10% (vol/vol) fetalt kalvserum (FBS) och 1% (vol/vol) penicillin/streptomycin.
- Ta de kryogena injektionsflaskorna av celler från flytande kväve tanken, doppa botten av flaskorna i varmt vatten i 37 ° C vattenbad och skaka försiktigt de kryogena injektionsflaskorna för att påskynda upptining. Hålla locket kryogen flaskor från att kontakta vatten för att undvika kontaminering. Så snart celler är tinade, sterilisera kryogen injektionsflaskan genom sprutning 70% etanol lösningen och torka av injektionsflaskan.
- I en LAF, omedelbart aspirera cellsuspensionen från injektionsflaskan med kryogen och försiktigt avbryta i 10 mL värmde odlingsmedium (beskrivs i 1.1.1). Centrifugera cellsuspensioner på cirka 200 x g i 5-7 min.
- Återsuspendera cellpelleten med 10 mL värmde odlingsmedium och till en T75 mätkolv. Pipettera försiktigt flera gånger för att avbryta celler jämnt med en 10 mL Pipettera.
- Placera kolven i ett 37 ° C inkubator med 5% (vol/vol) CO2 och fuktad atmosfär. Tillåta celler att fästa för minst 12 h.
- Inkubera cellerna i ca 3-7 dagar tills 80-100% konfluenta. Ändra odlingssubstratet varje 2-3 dagar.
-
Dela KHOS-A och -N celler
- Ta bort kultur media från kolven.
- Tvätta cellerna med 5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (1 x) utan kalcium och magnesium, för att ta bort icke vidhäftande celler eller bråk.
- Tillsätt 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA lösning i kolven och kort snurra kolven för att säkerställa att den trypsin-EDTA sprids jämnt.
- Inkubera i kolven för 2-3 min i en 37 ° C inkubator eller 3-5 min i rumstemperatur. Kontrollera cellerna i Mikroskop på cirka 400 x förstoring se till att cellerna är avrundat uppåt och fristående.
- När cellerna är fristående, lägga till 10 mL odlingsmedium och försiktigt Pipettera medium upp och ner flera gånger för att bryta upp cell aggregat till en enda cellsuspension med en 10 mL Pipettera.
- Räkna celler som använder en cell räknare. Utsäde cellsuspensionen i nya T75 kolvar på en densitet på 2 × 106 celler eller ett förhållande av 1:4.
- Tillåta celler att växa till 80-100% sammanflödet före sådd för QPI experimentet.
-
Seedning KHOS-A och -N celler för QPI
- Utsäde KHOS-A och -N celler i 6-väl pläterar på tätheten av 50 000-300 000 celler per brunn med 5 mL odlingsmedium efter räknar med en cell räknare.
Obs: Sådd tätheten är beroende av andelen cell spridning och imaging tidsperioden för att ha < 100% sammanflödet under imaging förvärv. - Inkubera cellerna för minst 12 h att tillåta bifogade filer.
- Ändra på medellång med färska media innan du utför QPI.
- Utsäde KHOS-A och -N celler i 6-väl pläterar på tätheten av 50 000-300 000 celler per brunn med 5 mL odlingsmedium efter räknar med en cell räknare.
2. QPI anskaffning
-
Täckglas ställa in
- Rengör täckglaset genom att skölja flera gånger med rinnande avjoniserat vatten och sterilisera med 75% etanol lösning genom nedsänkning för 15 min. sätta täckglaset i en steril LAF att torka.
- Placera försiktigt cover slip på 6-väl plåt att undvika uppenbara bubblor. Se till att botten av täckglaset är nedsänkt i kultur media (minimum 5 ìl/hål).
- Placera plattan i inkubatorn (37 ° C 5% CO2och fuktad atmosfär) temperera för minst 15 min. Om dimma bildas på cover slip, Använd en steril bomullspinne för att torka den ren.
-
Imaging celler med ett Mikroskop
- Öppna programvaran för att initiera systemet, inklusive självkalibrering av exponeringstid, mönster kontrast och hologram buller. Kontrollera att värdena är acceptabel (visas i gröna eller gula).
- Placera 6-väl plattan på scenen av mikroskopet QPI.
- Klicka på ”Live Capture” och väljer ”manuell” i ”programvara fokus”. Grovt fokusera fas bilder av celler genom att justera arbetsavståndet i ”Mikroskop inställningen” att få konturerna för celler i fas bilder. Ändra till ”automatisk” i ”programvara fokus”.
- Klicka på ”nytt experiment” att skapa ett nytt experiment. Börja med valet av bild förvärv positioner med musen eller piltangenterna på det numeriska tangentbordet. Klicka på ”kom ihåg” efter varje val. Normalt väljs 3-5 platser för varje prov.
- Ställa in imaging intervaller och tidsperiod i avsnittet ”Timelapse”.
Obs: Spåra cancerceller tydligt genom intervallen bör vara kortare än 5 min. 48 timmar sätts som tidsperiod för kombinationen QPI analys. - Starta experimentet genom att klicka på ”Capture”, som automatiskt fokuserar och förvärva bilderna på inställningen tidpunkter.
3. dataanalys
-
Cell morfologi analys
- Klicka på ”identifiera celler”. Justera den numeriska inställningen för ”bakgrund tröskel” så att cellen områden avgränsas väl från bakgrundsljud. Justera inställningen numret för ”objektstorlek” att se till att varje cell har en kärna. Upprätthålla konsekventa parametrar för prover som behöver jämföras, eftersom dessa kan påverka de slutliga och volymen mätningarna. Manuellt ändra cellen segment med hjälp av ”manuella ändringar”, om det behövs.
- Använd funktionen ”analysera data” i programvaran för att analysera celler. Starta en ny analys av data genom att klicka på ”ny analys”. Dra markerade bilder till ”Source ramar” fliken cell morfologi parametrarna och inklusive cellområde (µm2), optisk tjocklek (µm) och volym (µm3) för varje enskild cell. Välj scatter plot eller histogram läge och exportera data som tabeller eller siffror.
-
Cell spridning analys
- Välj minst 5 bilder för de olika tidpunkterna av intresse (t.ex., inledande, 12 h, 24 h, 36 h och 48 h). Spela in cell nummer som tillhandahålls av programvaran.
- För att uppskatta den fördubbling tid, rita cell nummer efter normalisering med inledande siffrorna och passa med exponentiell tillväxtkurvor.
-
Cell rörelse analys
- Använd funktionen ”spår celler” i programvaran. Klicka på ”ny analys” att starta en ny analys av data. Drar serie bilder för en vald tidsperiod (t.ex., 4 h efter 24 h inkubation) i fliken ”Source ramar” välja slumpmässigt 10-30 celler genom att klicka på celler under ”Lägg till celler” val av läge. Utesluta cellerna på kanterna och de flytta ut ur synfältet.
- Kontrollera noga spårning i serien av bilder. I händelse av att systemet förlorar spår av en cell eller spårar fel cellen, manuellt justera spårning cellen genom att klicka på ”identifiera” för att identifiera celler eller klicka på ”ändra läge” under ”Välj” läge att ändra platsen för cellen.
- Välj ros tomt på cell banor i ”Plot rörelse” eller tomt för övriga rörelse-relaterade parametrar i ”Plot funktioner”, såsom motilitet hastighet (µm/h), motilitet (µm), migration (µm) och migration direkthet. Exportera Data som tabeller eller siffror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en typisk cell morfologi karakterisering. Bilder presenteras som holographs (figur 1A-B) och 2D-bilder (figur 1 c-D). Optisk cell tjocklekar (beräknat från brytningsindex och optiska ljuspassagelängden) kvantifieras via line profil eller en hel cell mätning. Scatter tomter i området och tjocklek av KHOS-A och KHOS-N celler mätt för en hel cell var ritas upp, som i figur 1E-G, där dessa två fenotyper visas olika spridningsmönster. Den genomsnittliga siffror från histogrammet (figur 1 H-M) eller de exporterade filerna visat att KHOS-A celler har mindre cell områden och större tjocklekar än KHOS-N celler.
Använder funktionen cell counter, erhölls cell spridning profiler (figur 2). Dessa inte visade en signifikant skillnad mellan KHOS-A och -N celler. Dessutom kan cellen fördubbling tid uppskattas från spridning kurvan (dvs, 24-26 h), som också inte visat några signifikanta skillnader.
Figur 3A -D visar typiska spårning av KHOS-A och -N celler i rundstrålande (slumpmässiga) motion läge och de motsvarande banor. Den genomsnittliga cell motiliteten (figur 3E-F), motilitet hastighet ()figur 3 g-H), migration avstånd ()figur 3I-J), och migration direkthet ()figur 3 K-L) var plottade kontra inspelningstid. Jämfört med KHOS-N celler, KHOS-A celler visade ökad motilitet hastighet, vilket resulterar i längre motilitet och migration avstånd.
Figur 1: Cell morfologi karakterisering. (A-B) Representativa holographs KHOS-A (A) och -N celler (B) av kvantitativa fas imaging. Skalstapeln är 191,4 µm. inläggningar på det nedre högra hörnet visar kvantitativa line profil optisk tjocklek för den blå linjen dras i bilderna. (C-D) Representant QPI bilder av cell segmentering för KHOS-A (C) och -N celler (D). Skalstapeln är 100 µm. celler vid kanterna exkluderades för kvantifiering. (E-G) Uppmätt tjocklek kontra område för enskilda celler av KHOS-A (E) och -N celler (F). Varje prick representerar en enskild cell (n = 200-300). Överlappning tomten (G) visar signifikant olika dispersion mönster för KHOS-A och -N celler. (H-M) Histogrammen för cell tjocklek (H-jag), (J-K), och volym (L-M) -fördelning för KHOS-A (H, J, L) och -N celler (I, K, M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cell spridning karakterisering. Den övre panelen visar representativa cell segmentering för inventering cell nummer. Skalstapeln är 100 µm. Den nedre panelen visar den motsvarande beräknade cellhastighet för spridning. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Student's t-test (oparade, tvåsidiga) användes för statistiska analyser. Testresultat ansågs betydande när p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell rörelse karakterisering. (A-B) Representativa cell spårning bilder för KHOS-A (A) och -N (B) celler. Skalstapeln är 100 µm. markerade celler markeras med olika färger. Cell motilitet registreras i en 4 h lång tid presenteras med den motsvarande färgade linjen. (C-D) Cell-banor KHOS-A (C) och -N (D) celler ritas från peka av beskärning (0,0). Varje rad representerar en enskild cell. KHOS-A celler visade en mer spridda mönster jämfört med KHOS-N celler (n = 10). (E-L) Inspelade kvantitativa parametrar under den undersökta tidsperioden för cellrörelse KHOS-a (E, G, I, K) och -N (F, H, J, L) celler, inklusive cell motilitet (E-F), motilitet hastighet (G-H), migration avstånd (I-J ), och migration direkthet (K-L). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskriver vi en in vitro-, icke-invasiv, och etikett-fri metod med QPI att kvantitativt karakterisera de angiogena och icke-angiogena fenotyperna av mänskliga osteosarkom celler. Flera cellulära parametrar har analyserats samtidigt av denna integrerade, hög genomströmning metod, inklusive cellområde, cell tjocklek, cellvolym, spridning takt, fördubbling tid, migration direkthet, motilitet hastighet, migration och motilitet.
Jämfört med de konventionella analyser som utvärderar cellmorfologi och cell beteenden, denna metod inte bara sparar tid och arbetskraft, men också ger mer korrekt och detaljerad information. Till exempel, minskar platsen för QPI systemet (inuti cellen inkubatorn) störningarna från miljömässiga förändringar såsom fotografering i en omgivande miljö (rumstemperatur och atmosfär)23. Dessutom kunde optisk cell tjocklek och volym, konverterat från fasförskjutning, erhållas med QPI, medan endast cellområde mäts av traditionella cellen imaging process. QPI-funktionen genererar mer detaljerad information för kvantitativa jämförelser av olika cell fenotyper.
Ordentlig sådd densitet av cellerna i intresse är avgörande i den nuvarande metoden. Under fasen för imaging förvärv förväntas celler vara mindre än en konfluenta enskiktslager på grund av begränsningen av denna sammanhängande QPI teknik att imaging förvärv endast kunde utföras med ett fokus panel, som kan förlora partiell information i z riktning (dvs, överlappande celler). Karakteriseringar använder QPI är dessutom begränsade till 2D-format, som inte är optimalt för cell invasion i z riktning i den extracellulära matrixen. Flera förinställda brännvidder behövs för framtida QPI metodutveckling.
Förutom cell räkna ger QPI imaging också informativa bilder för att studera cell Mitos utan ytterligare märkning21,23,24. Medan celldelning erkändes enkelt av uppenbara minskningen av cellen och volym, har förmågan att objektivt och kvantitativt definiera och särskilja cellcykelns faser för enstaka celler ännu inte fastställas. Denna förmåga skulle avsevärt underlätta forskning med avseende på cell analys för stamcellers differentiering, narkotika svar och cellcykelarrest.
På grund av fördelarna med att vara kvantitativ, etikett-gratis och lätt att använda, kan denna metod har också användbar kliniska tillämpningar25,26,27,28,29,30 . Till exempel skulle detta system kunna utnyttjas i karakterisering av heterogena cellpopulationer, inklusive vilande och aktiva celler i mänskliga tumörer. Karakteriserade cell morfologiska och beteendemässiga skillnader mellan vilande och aktiv cancerceller kan potentiellt användas att dechiffrera de molekylära mekanismerna bakom tumör dvala i mänskliga cancerformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt stöd av bröst Cancer forskning stiftelsen och stiftelsen avancerad medicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
References
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
- Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
- Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
- Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
- Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
- Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
- Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
- Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
- Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
- Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001 (2012).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395 (2012).
- Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
- Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
- Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
- Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
- Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369 (2013).
- Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546 (2014).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000 (2014).
- Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
- Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
- Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676 (2013).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976 (2015).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257 (2016).
- Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).
