Summary
We beschrijven een dramatisch verbeterde methode voor het klonen van de muis met trichostatin A, vitamine C en gedeïoniseerd bovien serumalbumine. Laten we een vereenvoudigde, reproduceerbare protocol dat efficiënte ontwikkeling van gekloonde embryo's wordt ondersteund. Vandaar, zou deze methode worden een gestandaardiseerde procedure voor het klonen van de muis.
Abstract
Aantal somatische cellen nucleaire overdracht (SCNT) biedt een unieke gelegenheid om rechtstreeks produceren een gekloonde dier uit een cel van de donor, en het vereist het gebruik van bekwame technieken. Bovendien hebben de efficiëntie van het klonen bleven laag sinds de succesvolle productie van gekloonde dieren, vooral muizen. Er zijn vele pogingen ter verbetering van de kloneringsefficiëntie en trichostatin A (TSA), een histone deacetylase inhibitor, is wijd verbeid gebruikt ter verbetering van de efficiëntie van klonen. Wij rapporteren hier een drastisch verbeterde klonen methode in muizen. Dit aantal somatische cellen nucleaire overzetmethode omvat zede van Hemagglutinating virus van Japan envelop (HVJ-E), waardoor gemakkelijke manipulatie. Bovendien is de behandeling met behulp van twee kleine molecules, TSA en vitamine C (VC), met gedeïoniseerd bovien serumalbumine (dBSA), is zeer effectief voor embryonale ontwikkeling. Deze aanpak vereist extra injectie noch genetische manipulatie, en dus presenteert een eenvoudige, geschikte methode voor praktisch gebruik. Deze methode zou kunnen worden een technisch haalbaar aanpak voor onderzoekers voor de productie van genetisch gemodificeerde dieren uit gekweekte cellen. Bovendien zou het een nuttige manier voor de redding van bedreigde diersoorten via klonen.
Introduction
De SCNT-technologie maakt de productie van gekloonde dieren met behulp van slechts een aantal somatische cellen of een kern worden overgebracht naar een enucleated oöcyt. Een van de doeleinden van de SCNT-techniek is de afleiding van nucleaire embryonale stamcellen (NT-SER's) de transferregels van gekloonde embryo's. In 1998, Wakayama et al.., gerapporteerde produceren een succesvol gekloonde muis genaamd Cumulina voor de eerste keer1. Sindsdien is het klonen van muizen grote schaal is onderzocht, en vele belangrijke inzichten in nucleaire herprogrammering van somatische kernen zijn verkregen. Aan de andere kant, deze techniek gaat gepaard met talrijke micromanipulation stappen die heel moeilijk te meester, intensieve training van meer dan 3 maanden2vereisen.
Productie van gekloonde muizen met behulp van SCNT geëvolueerd van de oorspronkelijke Honolulu methode1, de electrofusion methode3, aan de methode cell fusion door Hemagglutinating virus van Japan (HVJ)4. Echter, de directe inspuiting van de kern van een cel door de cytomembrane neiging om leefbaarheid van invloed zijn op overleving van de oöcyt. De electrofusion is laag in efficiëntie, aangezien elke celmembraan verschillende hardheid heeft, waardoor het moeilijk is om een optimale conditie. De behandeling van het HVJ is moeizaam want het vergt specifieke apparatuur voor de veiligheid van onderzoekers en proefdieren. Om te smelten het donor-cel en oöcyt cytoplasma, HVJ-E heeft onlangs gebruikte5. HVJ-E heeft slechts de mogelijkheid om te fuseren membranen zonder de mogelijkheid van het proliferatieve of besmettelijke virussen. Genomic RNAs van HVJ zijn volledig geïnactiveerd in HVJ-E. Het gebruik van HVJ-E ondersteunt dus gemakkelijk te hanteren van celfusie tijdens SCNT.
Verschillende rapporten is gebleken dat de behandeling van SCNT embryo's met TSA, een histone deacetylase inhibitor, aanzienlijk de productieefficiency van levende pups van minder dan 1% tot 6.5%6,7 verbetert. TSA behandeling versnelt herprogrammering door Histon merken in SCNT embryo's8wijzigen. Onlangs, injectie van bepaalde mRNAs, de Histon lysine demethylase onderfamilie 4 (KDM4), waarvan Histon H3 lysine 9 (H3K9 verwijderen) trimethylation in SCNT embryo's, met name op reprograming-resistente gebieden, is aangetoond dat het verhogen van de ontwikkeling van gekloonde muis embryo's9. Ondertussen, is VC, die ook als een Histon modifier fungeert, trimethylation van H3K910afgenomen. Bovendien verhoogt VC embryonale ontwikkeling in varkens SCNT10. Er werd gemeld dat de injectie van dBSA in SCNT embryo's tot verbetering van de embryonale ontwikkeling11 leidt.
Eerder vonden we dat de combinatie van kleine molecules, namelijk TSA en VC, samen met dBSA, ontwikkeling van SCNT embryo's12dramatisch verbeterd. Hier, detail we de eerder gemelde SCNT methode voor muizen, waarmee zeer efficiënte en eenvoudige klonen procedures-12. Ook beschrijven we de behandeling van HVJ-E. Deze kon vele onderzoekers op het gebied van ontwikkelings- en reproductieve biologie aan het behoud van genetische hulpbronnen of genetisch gemodificeerde dieren produceren door middel van deze methode SCNT helpen.
Protocol
Alle dierlijke procedures gelijkvormig aan de richtlijnen van Kindai Universiteit voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. bereiding van de voedingsbodems
- Het gewijzigde KSOM (mKSOM)-medium voorbereiden embryocultuur, bestaande uit 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0.35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-Glucose, 0.2 mM natrium pyruvaat, 1,0 mM L-Glutamine, 1,0 g/L Polyvinylpyrrolidon (PVP), 25.07 mM NaHCO3, 10 mM natrium DL-lactaat 0,05 g/L penicilline en streptomycine in steriel water 0,05 g/L.
- Bereiden van het medium Hepes-buffer CZB (HCZB) voor de manipulatie van embryo's, bestaande uit 81,5 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0.11 mM EDTA · 2Na, 36.1 mM natrium DL-lactaat, 5.55 mM D (+)-Glucose, 0,025 g/mL penicilline, 0,035 g/L streptomycine, 0.014 mM fenol rood, 1,0 g/L Polyvinyl alcohol, 5.0 mM NaHCO3en 20,0 mM Hepes natriumzout in steriel water.
- Bereiden van het medium van de activering voor oöcyt activering: mKSOM medium aangevuld met 50 nM TSA, 2 mM EGTA 5 µg/mL cytochalasin B (CB) en 5 mM SrCl2.
2. voorbereiding van gedeïoniseerd bovien serumalbumine (dBSA)
- Los 1.2 g bovien serumalbumine (BSA) in 10 mL steriel water op kamertemperatuur (een eindconcentratie van 12%).
- Ongeveer 0,12 g gemengde ionenwisseling harsparels aan het bovenstaande toevoegen, bereid van 12% van de BSA in steriel water bij kamertemperatuur met zachte roeren.
- Wanneer de kralen Verander kleur van blauw-groen goud, herstellen het supernatant oplossing met behulp van een precisiepipet. Vervang de kralen door de fresh enen (Figuur 1).
Opmerking: De vervanging van kralen is normaal gesproken slechts één keer uitgevoerd. Het vereist misschien een paar vervangingen voor volledige deionization. Alleen als een gids, als de kleur van kralen ongewijzigd ten opzichte van blijft blauwgroen naar goud, het geeft aan dat ion exchange is voltooid. - Het herstellen van de oplossing nadat u hebt bevestigd dat er geen kleurverandering in de kralen is.
Opmerking: Indien de herstelde oplossing weer troebel wordt, centrifugeren om te voorkomen dat verstopping van het filter (175 x g, 5 min). - Aanvulling op de herstelde de oplossing met 250 µL van 10,5% NaHCO3.
Opmerking: Dit proces is bedoeld voor de oplossing van de dBSA te neutraliseren de pH voorwaarde. NaHCO3 kan echter overbodig. - De bovendrijvende vloeistof met behulp van een 0,45 µm filter steriliseren en bewaren bij-20 ° C als dBSA stockoplossing.
3. oöcyt collectie
Opmerking: Alle muizen werden onderhouden in licht-gecontroleerde kamers met airconditioning.
- Super-eisprong elke vrouwelijke B6D2F1 muis (leeftijd 8-10 weken) door intraperitoneale injectie van 7,5 IU van zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG) en 7,5 IU van humaan choriongonadotrofine (hCG) 48 h na de injectie van de PMSG.
- Euthanasie door cervicale dislocatie 14-16 h uitvoeren na de hCG-inspuiting. Incise de buik voor toegang tot het voortplantingskanaal met behulp van standaard dissectie technieken13. Kort, knijpen van de huid en maakt een kleine incisie van de laterale op de middellijn met schaar. Houd de huid stevig boven en onder de snede en trek de huid naar de kop en de staart. Snij het buikvlies met behulp van schaar, duw de spoelen van de darm uit de weg en de aanwezigheid van de twee hoorns van de eierstokken, de baarmoeder en de oviducts bevestigen.
- Oviducts met kleine rechte schaar en pincet verdrukken, plaats op een vel filtreerpapier te vegen het bloed weg van het oppervlak. Stel de oviducts in minerale olie. Knip van de Papil van het oviduct gebruik dissectie naalden, en vervolgens de complexen van de cumulus-oöcyt vanuit de Papil van het oviduct in 200 µL druppels HCZB medium met 0,1% hyaluronidase verplaatsen. Incubeer gedurende 5 min op een opwarming van de aarde plaat.
Let op: Een blootstelling langer dan 10 min in HCZB medium met 0,1% hyaluronidase schadelijk zou zijn voor de eicellen. - Bevestigen dat de cumulus cellen worden vrijgelaten uit de complexen van de cumulus-oöcyt onder een stereomicroscoop, overdracht tweede meiosemetafase metafase (MII) fase eicellen met enkele resterende cumulus cellen te mKSOM medium met 0,3% dBSA. Daarna, het wassen van de MII fase eicellen viermaal door omhoog en omlaag pipetteren (met behulp van een precisiepipet van < 100 µm binnendiameter) in mKSOM gemiddeld met 0,3% dBSA voor het loskoppelen van de resterende cellen van cumulus.
Opmerking: Het gebruik van een kleine pipet vergemakkelijkt detachement van de cumulus cellen. - Incubeer Mll fase eicellen in mKSOM gemiddeld met 0,3% dBSA bij 37 ° C minder dan 5% CO2 incubator tot enucleation.
Opmerking: Een kleine pipet met een diameter die is iets groter dan die van de oöcyt wordt aanbevolen.
4. voorbereiding van Donor cellen voor de overdracht van nucleaire
- Na stap 3.3-3.5, zijn kale eicellen geïsoleerd van de cumulus-oöcyt complexen. Een kleine hoeveelheid (ongeveer 2 µL) overdracht van de resterende cellen van de cumulus verspreid ten opzichte van de cumulus-oöcyt complexen in HCZB medium met 0,1% hyaluronidase op HCZB gemiddeld met 6% dBSA door met behulp van een precisiepipet onder een stereomicroscoop.
- Plaats de cumulus cellen in HCZB medium met 6% dBSA op de opwarming van de aarde plaat bij 37 ° C totdat nodig voor SCNT.
Opmerking: Wanneer cellen van de fibroblast (bv., lymfkliertest foetale fibroblast cellen) worden gebruikt als donor cellen, loskoppelen van de cellen van een weefselkweek schotel samen en centrifugeer ze in een pellet. Resuspendeer de pellet van cellen in HCZB medium met 6% dBSA.
5. enucleation van eicellen
- Voorbereiden van 9% PVP medium door het toevoegen van 0.9 g PVP op 10 mL HCZB gemiddeld, houden in de koelkast 's nachts (4 ° C) en vervolgens steriliseren met behulp van een 0,45 µm filter.
- Bereiden CB stamoplossingen (concentratie van 1 mg/mL) door toevoeging van 5 mg voor CB aan 5 mL dimethylsulfoxide (DMSO). Verdun de CB-stockoplossing met HCZB medium (een eindconcentratie van 5 µg/mL) en gebruiken als oplossing voor enucleation.
- Wassen van de eicellen fase Mll in 20 µL van HCZB medium met 5 µg/mL CB (enucleation-oplossing) door inademen en uitademen via de gesteriliseerde Pipet (binnendiameter: 150 µm tot 200 µm). Herhaal de procedure wassen vijfmaal. Wacht ongeveer 10 min op de opwarming van de aarde plaat in enucleation oplossing vóór aanvang van het proces van enucleation.
- Bereiden de kamer van de enucleation zoals aangegeven in figuur 2A. De enucleation-zaal de Mll eicellen overbrengen door inademen en uitademen gebruik de Pipet (binnendiameter: 150 µm tot 200 µm); plaats 4 µL van enucleation oplossing en dekking van de zaal met minerale olie.
Opmerking: In plaats van een kamer, een cover van een 60 mm petrischaal kan worden gebruikt. - Identificeer de spindels en de chromosomen van de MII fase oöcyt onder een microscoop (400 X) bij kamertemperatuur. Oriënteren de oöcyt fase Mll met het uitgesproken eerste polar lichaam, zodat de positionering van de spindel en chromosoom op de 3 of 9 uur (figuur 2B) positie met behulp van een pipet van het bedrijf en de micropipet.
Opmerking: De Microscoop gebruikt heeft lenzen van 400 X vergroting in totaal. Ook is het objectief N.A 5 X / 0,12 en 40 X / 0.55. Het besturen van piezo puls van de pipet maakt snelle boren van de zona zitten. Daarnaast, is een lasersysteem (bijvoorbeeld, XYClone) ook bruikbaar voor het boren van de zona zitten in plaats van het drijvende piëzo-systeem. - De intensiteit van de puls piezo ingesteld op 3-6, en boor naar de zona zitten met behulp van een precisiepipet micromanipulation (7-8 µm binnendiameter flat-ended tip) met de pols van de piezo rijden. Na het openen van een gat in zona zitten, volledig enucleate de spindels en chromosomen met een minimale hoeveelheid cytoplasma (figuur 2C).
Opmerking: Tijdens dit proces, de eicellen neiging om strak hechten aan de onderkant van de schotel of Pipetteer als gevolg van het medium zonder BSA14. Binnen 10 min, het enucleation moet worden voltooid, en de enucleated eicellen moeten worden teruggegeven aan de incubator. Het juiste aantal eicellen, die kan worden gemanipuleerd in een enucleation ligt tussen 10 en 20. Bij grotere partijen van de eicellen, wordt de enucleation-procedure herhaald. - Bevestig het ontbreken van chromosomen in cytoplasma onder zichtbaar licht (figuur 2C, midden) en de enucleated eicellen grondig wassen in mKSOM medium met 0,3% dBSA CB ontbreekt. De schotel kennismaken met de incubator bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 tot celfusie.
Opmerking: Na enucleation bevat het cytoplasma verwijderd van ooplasm de spindels en chromosomen.
6. de fusie van de cel van een Donor en een Enucleated oöcyt
-
Voorbereiding van HVJ-E
- 260 µL van ijskoude HVJ-E schorsing oplossing toevoegen aan gelyofiliseerd HVJ-E (Zie de Tabel van de materialenuit de kit) en Pipetteer op en neer totdat volledig geschorst.
Opmerking: De juiste hoeveelheid gelyofiliseerd HVJ-E wordt bereid in een fles en 260 µL HVJ-E schorsing oplossing is inbegrepen in de kit. - 5 µL aliquots van het HVJ-E-oplossing te bereiden en op te slaan bij-80 ° C tot celfusie.
Let op: Zorgvuldig behandelen het HVJ-E op het ijs, aangezien het temperatuurgevoelig. Na afloop van het experiment, op passende wijze autoclaaf HVJ-E materialen en containers naar volledig inactivering van virus onderdelen.
- 260 µL van ijskoude HVJ-E schorsing oplossing toevoegen aan gelyofiliseerd HVJ-E (Zie de Tabel van de materialenuit de kit) en Pipetteer op en neer totdat volledig geschorst.
-
Celfusie
- Verdun de 5 µL van HVJ-E oplossing met 20 µL van de fusie van de cel buffer onmiddellijk vóór gebruik. Plaats de verdunde oplossing van het HVJ-E op ijs tot gebruik.
Opmerking: De fusie van de cel buffer is opgenomen in het HVJ-E kit. - Bereiden de cel fusion kamer zoals weergegeven in figuur 3A. Overdracht van de enucleated eicellen op HCZB gemiddeld op de cel fusion kamer met behulp van de Pipet (binnendiameter: 150 µm tot 200 µm); plaats 4 µL van elke oplossing (HCZB medium met 6% -BSA voor donor cellen, HVJ-E oplossing, HCZB middel, 9% PVP in HCZB medium) en bedek de zaal met ongeveer 1 mL van minerale olie.
Opmerking: Het juiste aantal enucleated eicellen die worden overgedragen aan de kamer voor manipulatie tijdens één cel fusion procedure is van 5 tot en met 30. Bij grotere partijen van oöcyten, wordt de cel fusion procedure herhaald. In plaats van de kamer, kan een 60-mm petrischaal cover worden gebruikt, indien beschikbaar. - Plaats de enucleated eicellen in HCZB medium onder een Microscoop kamertemperatuur 400 X magnificationat. De cellen van de donor met behulp van de micromanipulation-Pipet (6-7 µm binnendiameter flat-ended tip) gecombineerd en verdrijven van cellen in HVJ-E Luchtvering oplossing.
- Vervolgens gecombineerd cumulus cellen één voor één met de oplossing van de schorsing HVJ-E te worden even van elkaar gescheiden, waardoor seriële celfusie. Houd de enucleated eicellen in HCZB medium met behulp van een precisiepipet bedrijf. Boor de zona zitten met de Pipet van de micromanipulation met de piezo-pols (intensiteit van 3-6, snelheid van 2-3).
- Na het openen van het gat in de zona zitten, plaatst u een cumulus cel strak aan de oöcyt membraan, samen met HVJ-E schorsing oplossing met een volume van 5 maal het volume van een cumulus cel, zonder het gaan door het membraan van de oöcyt.
Opmerking: 6-7 µm binnendiameter flat-ended tips van micromanipulation pipetten voorbereiden op cumulus cellen. Pipetten moeten gewassen worden regelmatig met behulp van 9% PVP medium voor het behoud van soepele cel release. Stappen 6.2.3 - 6.2.5 dient te worden voltooid binnen 10 min, of de efficiëntie van de celfusie lager zal zijn. Membraan fusion activiteit van HVJ-E wordt geïnactiveerd door autoclaaf, behandeling met afwasmiddel, of 70% ethanol. Na het experiment, de HVJ-E-oplossing op de juiste manier afvoeren. - Na de manipulatie van de celfusie, snel overbrengen van de eicellen te mKSOM medium met 0,3% dBSA en verplaatsen naar een incubator bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 1 h.
- Verdun de 5 µL van HVJ-E oplossing met 20 µL van de fusie van de cel buffer onmiddellijk vóór gebruik. Plaats de verdunde oplossing van het HVJ-E op ijs tot gebruik.
7. de activering van de gereconstrueerde oöcyten en behandeling met Trichostatin A en vitamine C
-
Voorbereiding van TSA
- Afzien van 5 mM TSA oplossing in 3 µL aliquots en slaat u de oplossing bij-20 ° C.
- Voeg 2.5 µL van 5 mM TSA stockoplossing tot 1 mL van DMSO (een concentratie van 12,5 µM).
- Verdun 8 µL van 12,5 µM TSA stockoplossing in 2 mL van de activering medium en mKSOM medium (een eindconcentratie van 50 nM).
-
Voorbereiding van VC
- Toevoegen van 1 mg van VC in 1 mL steriele endotoxine-gratis water, en opgeslagen bij-20 ° C.
- De VC-stockoplossing toevoegen aan mKSOM medium (een eindconcentratie van 10 µg/mL).
-
Activering van de gereconstrueerde eicellen
- Een uur na celfusie, Controleer de voortijdige chromosoom condensatie (PCC) in de gereconstrueerde eicellen (figuur 3B) met behulp van een microscoop (400 X).
- De gereconstrueerde eicellen overbrengen in het medium van de activering (Zie de stap 1.3) met TSA en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 in lucht (Figuur 3 c). Observeren van de vorming van pro-kernen in de SCNT embryo's, breng dan 2 meer uren van TSA behandeling in mKSOM gemiddeld met 0,3% dBSA (figuur 2C).
- De TSA-behandelde embryo's overbrengen mKSOM medium aangevuld met VC en incubeer gedurende 7 h, zoals weergegeven in figuur 3D.
- Na 7 uur voor de behandeling van VC de VC-behandelde embryo's overbrengen mKSOM gemiddeld met 0,3% dBSA en incubeer gedurende 4 dagen bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 in lucht.
Opmerking: Voor de productie van gekloonde muizen, Pipetteer morfologisch normale 2 cellen fase embryo's in de oviducts van pseudo-zwangere vrouwelijke muizen (MCH(ICR)) op de dag wanneer een vaginale stekker (0,5 dag van pseudopregnancy)15is gevonden. Na 19.5 dagen, worden het aantal sites van de implantatie en pasgeborenen afgelezen na een keizersnede.
Representative Results
Voor de productie van gekloonde muis embryo's, werden cumulus cellen en foetale fibroblast cellen gebruikt. Het aantal gereconstrueerde eicellen en de ontwikkeling naar de fase 2-cel na activering van de oöcyt staan vermeld in tabel 1. Een zeer hoog tarief van pronuclear vorming (89-100%) en ontwikkeling naar het werkgebied van de 2-cel (77 tot en met 89%) werden waargenomen onder alle omstandigheden. Sommige van de gekloonde embryo's, die waren afgeleid van de cumulus cellen en ontwikkeld naar de fase 2-cel, werden overgedragen aan de oviducts van de pseudo-zwangere vrouwen. Zes gekloonde nakomelingen uit 72 overgebrachte embryo's werden geproduceerd van drie zwangere vrouwtjes door de seriële behandeling van TSA en VC (Figuur 4). Ongeveer 15% van de gekloonde embryo's hebben gemeld te ontwikkelen door het volgen van deze SCNT procedures12termijn. Bovendien heeft de overdracht van gekloonde embryo's de 2-cel bij andere instellingen levende nakomelingen van 9 tot en met 15%, waarmee betere ontwikkeling dan de interne behandeling van de TSA op gekloonde embryo's bereikt. Bovendien, de behandeling met TSA en VC aanzienlijk verbeterd de efficiëntie van in vitro embryonale ontwikkeling tot het blastocyst-stadium (tabel 2, P < 0,05, Student t-test). Deze in vitro developmental gegevens tonen aan dat het positieve effect van TSA en VC beperkt door muis stammen noch door celtypes. Deze resultaten suggereren dat deze methode SCNT developmental vermogen van de gekloonde embryo's vergemakkelijkt.
Figuur 1: Bereiding van dBSA.
Stapsgewijze procedures voor het opstellen van de dBSA oplossing worden afgebeeld. De omvang van ionenwisseling kan worden beoordeeld door de kleur te veranderen van de parels. De bovenste linker figuur toont dat 1,2 g van BSA wordt ontbonden in 10 mL steriel water op kamertemperatuur. Nadat het BSA wordt ontbonden, worden de ion-exchange harsparels toegevoegd (rechtsboven). Wanneer het mengsel van BSA oplossing met ionenwisseling harsparels Verander kleur van blauw-groen goud (rechtsonder), vervangen door de kralen vers. De linkerbenedenhoek afbeelding ziet u dat de kleur van kralen blauw-groen blijft en ion exchange is voltooid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Enucleation procedures.
(A) een illustratie van de enucleation-zaal. Enucleation van de eicellen gebeurt in het medium van de HCZB met CB. Voor de piezo-aandrijfsysteem, wordt een plek van 9% PVP medium gebruikt om de glazen pipet voor enucleation. Plekken zijn bedekt met minerale olie. (B) een diagram en een opname wordt de positie van de spindels en chromosomen voordat enucleation weergeven. Zwarte pijlpunten: de spindels en chromosomen. Rode pijlpunten: het eerste polar lichaam. (C) A diagram en een opname te tonen van succesvolle enucleation. Zwarte pijlpunten: de spindels en chromosomen. Rode pijlpunt: het eerste polar lichaam. Blauwe pijlpunt: het gat in zona zitten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Cell fusion procedures en cultuur van de voorwaarde van SCNT embryo's.
(A) een illustratie van de cell fusion kamer. Celfusie wordt uitgevoerd in het medium van de HCZB met 6% dBSA. Een plek van 9% PVP medium wordt gebruikt voor te bereiden op de glazen pipet celfusie. Plekken zijn bedekt met minerale olie. (B) een diagram en een opname van de voortijdige chromosoom condensatie vormden één uur na celfusie (zwarte pijlpunt). (C) A diagram en een opname van de pronuclear structuur gevormd zes uur na activering (zwarte pijlpunten). (D) regeling van de TSA, VC en dBSA behandeling van SCNT embryo's. Groene pijl vertegenwoordigt behandeling met TSA, gevolgd door incubatie met VC (gele pijl) onder mKSOM medium dat met 0,3% dBSA (blauwe pijl). Pijlpunten geven de timing voor het wijzigen van medium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Gekloonde nakomelingen die zijn afgeleid van cumulus cellen net na de keizersnede na 19.5 dagen van de zwangerschap.
Er zijn placentae op de bovenste rij. De gekloonde nakomelingen die hier worden weergegeven zijn ontstaan in een nucleaire overdracht experimenteren van drie foster moeders. De grootte van de placenta was 1,5 tot 2 keer groter dan de grootte van die geproduceerd door in vitro bevruchting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Groep | Donor celtype | Muis stam | Nr. van eicellen gebruikt | Nr. van eicellen gesmolten | Nr. van eicellen tonen vroegtijdige chromosoom condensatie | Nr. van eicellen waaruit pronuclei vorming (%) | Nr. van pronuclei-gevormd eicellen die ontwikkeld op 2-cel embryo's (%) |
|
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| onbehandeld | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA, VC | foetale fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| onbehandeld | foetale fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
Tabel 1: effecten van de behandeling van de TSA en VC op de in vitro ontwikkeling van de muis van de gekloonde embryo's naar de fase 2-cel.
| Groep | Donor celtype | Muis stam | Nr. van 2-cel embryo's gebruikt | Nr. van 2-cel embryo's ontwikkeld om elke stadia (%) | |||
| 4-cel | Morula | Blastocyste | |||||
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) een | |
| onbehandeld | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA, VC | foetale fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| onbehandeld | foetale fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| a-b, c-d Verschillende superscript binnen dezelfde donor cellen vertegenwoordigen significante verschillen (P < 0.05) | |||||||
Tabel 2: effecten van de behandeling van de TSA en VC op de in vitro ontwikkeling van de muis van de gekloonde embryo's tot het blastocyst stadium.
Discussion
Kortom, suggereren deze resultaten dat de onderhavige SCNT-methode kan verminderen van technische problemen, en verhoging van de efficiëntie van SCNT zonder genetische modificaties en mRNA suppletie (tabel 1, tabel 2), en zorgen stabiele productie van gekloonde embryo's. Deze methode ons in staat stelt om te reconstrueren meer SCNT-embryo's dan conventionele methoden als gevolg van de betere overlevingskans en vereenvoudigde protocol. In dit protocol is een essentiële stap celfusie. Succesvol produceren gekloonde muizen, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid HVJ-E beschreven in het protocol wordt gehandhaafd tijdens de fusie cel en eicellen moeten worden teruggegeven aan de incubator binnen 10 min tijdens de stappen 6.2.3 - 6.2.5. Aangezien 20 tot 30 donor cellen kunnen worden aanzuiging samen met HVJ-E op een moment in de pipet manipulatie, is het aantal eicellen verkregen door één bewerking groter dan die van de bestaande methode. Uiteindelijk kunnen wij produceren ongeveer 20 tot 30 opnieuw gebouwd eicellen binnen 10 min. Zelfs wanneer u werkt met een grote partij van eicellen (100 of meer), de cel fusion procedure moet nemen een uur of minder door de stappen 6.2.3 - 6.2.5 te herhalen. De methode en de technieken die hier gepresenteerd kunnen dienen als efficiënt protocollen met vereenvoudigde technische voorschriften.
De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van SCNT embryo's zijn momenteel nog onduidelijk. Deze verbeterde SCNT-methode draagt ook bij aan het bestuderen van deze herprogrammering mechanismen, aangezien deze methode veel gekloonde embryo's in slechts één experiment kan opleveren. Deze methode maakt gebruik van somatische cellen met intact celmembranen voor celfusie. Aldus, kan het mogelijk zijn deze benadering toepassen op andere cellen zoals staart tip16cellen, sertoli17 cellenen18van de cellen van de embryonale stamcellen (ES). Wanneer conventionele SCNT-methoden worden gebruikt voor het injecteren van relatief grote cellen, zoals staart tip cellen, rechtstreeks in het cytoplasma van de oöcyt wordt zelfs meer technisch veeleisende om levende embryo's. Bovendien zijn relatief harde cellen, zoals de sertoli-cellen, moeilijk te breken door pipetteren voor het injecteren. Wanneer deze verschillende celtypes worden beschouwd, wordt de cel fusion methode met behulp van HVJ-E is eenvoudig en effectief. Hoewel de waarde en veiligheid van HVJ-E hebben overtuigend aangetoond dat19,20, is het wellicht belangrijk te heroverwegen de haalbaarheid van het gebruik van HVJ-E voor het produceren van gekloonde dieren voor landbouw of biomedische doeleinden.
Bovendien onlangs een groep met succes geproduceerd gekloonde muizen afgeleid van urine cellen21. Om te redden van bedreigde soorten zoogdieren, voortaan SCNT de cuvetten verzameld in een niet-invasieve wijze, zoals de cel van de urine, ideaal. Meer recentelijk, een andere groep heeft direct gegenereerd gekloonde muizen met antigeen-specifieke CD4+ T cellen22. Het zou interessant zijn om te onderzoeken of deze methode ook geldt voor het efficiënt kloon muizen van dergelijke cellen. Latrunculin A heeft bovendien als een beter alternatief voor de remming van de polymerisatie van actine tijdens enucleation en ongeslachtelijke activering van SCNT eicellen23gemeld. Toekomstige studie kan onthullen of de behandeling van de Latrunculin A, in plaats van cytochalasin B, generatie nakomelingen van gekloonde verder verbetert. Bovendien, is de TSA behandeling met succes gebruikt in muizen, varkens24en25 van de konijnen door het veranderen van de behandeltijd, periode en concentratie. Bovendien, VC verhoogt embryonale ontwikkeling in varkens SCNT10, maar verbetert ook iPS celproductie bij mensen en muizen26. Het is dus aannemelijk om te speculeren dat TSA en VC behandeling kan ook worden toegepast op andere soorten zoogdieren, en wij kunnen moeten optimaliseren de behandeltijd van TSA en VC voor elke soort.
Kortom, zou deze methode het mogelijk maken voor het genereren van de gekloonde muizen met een praktische niveau van efficiëntie met eenvoudige procedures. Dus, de resultaten van deze studie kunnen leiden wij de SCNT-technologie gebruiken voor het behoud van de genetische hulpbronnen van de zeldzame dieren en voor het begrip van de moleculaire mechanismen van nucleaire herprogrammering en de vroege embryonale ontwikkeling.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI subsidie nummers JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 tot K.M. Sumitomo verlenen van de Stichting voor fundamenteel onderzoeksprojecten van de wetenschap (150810 aan K.M.). Kindai Universiteit onderzoeksbeurs (15-I-2 K.M. en M.A.). M.O. erkentelijk voor de steun van de kern geboden door Cancer Research UK (C6946/A24843) en de Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Wij danken mevrouw N. Backes-Kamimura en Mr. J. Horvat voor bewijs lezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
