Summary
אנו מתארים שיטה משופרת באופן משמעותי עבור העכבר שכפול באמצעות trichostatin A, ויטמין C, ואלבומין שור יונים. אנו מראים פרוטוקול מפושטת, לשחזור התומך פיתוח יעיל של העוברים משובטים. לכן, בשיטה זו יכול להיות הליך מתוקננת של העכבר שיבוט.
Abstract
העברת גרעין תאים סומטיים (SCNT) מספק הזדמנות ייחודית לייצר ישירות בעל חיים משובטים מתא תורם, והוא מחייב השימוש בטכניקות מיומן. בנוסף, היעילות של שיבוט נשארו נמוך מאז הייצור מוצלחת של בעלי חיים משובטים, במיוחד עכברים. היו ניסיונות רבים על מנת לשפר את יעילות שיבוט, trichostatin A (TSA), מעכב deacetylase היסטון, כבר בשימוש נרחב כדי לשפר את היעילות של שיבוט. כאן, אנחנו מדווחים על שיטת השיבוט שיפור דרמטי בעכברים. שיטה זו של העברת גרעין תאים סומטיים כרוך השימוש Hemagglutinating וירוס של יפן מעטפת (HVJ-E), המאפשרת טיפול קל. יתר על כן, הטיפול באמצעות שתי מולקולות קטנות, TSA וויטמין C (VC), עם יונים שור אלבומין (dBSA), הוא יעיל להתפתחות עוברית. גישה זו מחייבת הזרקת נוספים וגם לא מניפולציה גנטית, ובכך מציג שיטה פשוטה, מתאים לשימוש מעשי. שיטה זו יכולה להיות גישה אפשרי מבחינה טכנית עבור חוקרים לייצר מהונדסים בעלי חיים מן תאים בתרבית. יתר על כן, זה יכול להיות דרך שימושית על לעזרתו של חיות בסכנת הכחדה באמצעות שיבוט.
Introduction
SCNT הטכנולוגיה מאפשרת הייצור של בעלי חיים משובטים באמצעות תאים סומטיים אחד בלבד או גרעין תועבר oocyte enucleated. אחת המטרות של הטכניקה SCNT היא ההטיה של העברת גרעין של עוברי משובטים קווים בתאי גזע עובריים (NT-ESCs). בשנת 1998, וואקאיאמה et al., דווח על הפקת עכבר בהצלחה משובטים בשם Cumulina עבור ה-בפעם הראשונה1. מאז, השיבוט של עכברים נרחב נחקרה, תובנות חשובות רבות התכנות הגרעין של גרעינים סומאטית הושגו. מצד שני, טכניקה זו מלווה מדרגות חוץ-גופית רבות אשר די קשה מאסטר, הדורשים אימונים אינטנסיביים של יותר מ- 3 חודשים2.
הפקה של משובטים עכברים באמצעות SCNT התפתח המקורי הונולולו שיטה1, שיטת ריתוך חשמלי3, לשיטת פיוז'ן תא על-ידי וירוס Hemagglutinating של יפן (HVJ)4. עם זאת, הזרקה ישירה של גרעין התא דרך cytomembrane נוטה detrimentally להשפיע על oocyte הישרדות. ריתוך חשמלי הוא נמוך, יעילות, מאז כל קרום התא יש קושי שונות, ולכן קשה לקבוע מצב אופטימלי. הטיפול HVJ היא מייגעת, מכיוון שהיא דורשת ציוד ספציפי לשלומם של חוקרים, חיות מעבדה. לאחרונה, ששילבו את הציטופלסמה של התא ואת oocyte התורם, HVJ-E כבר בשימוש5. HVJ-E יש רק את היכולת נתיך ממברנות ללא יכולת המקדימות או זיהומיות של וירוסים. RNAs גנומית של HVJ הן לחלוטין לא מופעל ב- HVJ-אי השימוש HVJ-E ובכך תומך טיפול קל של היתוך תא במהלך SCNT.
מספר דיווחים הראו כי הטיפול של SCNT עוברי עם מהטי מעכב deacetylase היסטון, משפר באופן משמעותי את יעילות הייצור של הגורים חיים של פחות מ 1% 6.5%6,7. טיפול TSA מאיצה התכנות באמצעות שינוי היסטון סימני עוברי SCNT8. לאחרונה, הזרקה של mRNAs מסוים, היסטון ליזין demethylase תת משפחה 4 (KDM4), אשר להסיר היסטון H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation ב SCNT עוברי, במיוחד בזמן אזורים עמידים reprograming, הוכח להגדיל את הפיתוח של משובטים העכבר עוברי9. בינתיים, VC, אשר משמש גם צירוף היסטון, הצטמצמה trimethylation של H3K910. יתר על כן, VC משפר את התפתחות SCNT חזירי10. בעבר דווח כי ההזרקה של dBSA לתוך SCNT עוברי מוביל השיפור של התפתחות11.
קודם לכן מצאנו כי השילוב של מולקולות קטנות, כלומר TSA ו- VC, יחד עם dBSA, משופרת באופן משמעותי התפתחות העוברים SCNT12. כאן, אנו מפרטים את שיטת SCNT שדווחה בעבר עבור עכברים, אשר מייצג את פשוט ויעיל מאוד שיבוט הליכים12. אנחנו גם לתאר את הטיפול HVJ-אי אלה יכול לסייע חוקרים רבים בתחום ביולוגיה התפתחותית וההולדה לשמר משאבים גנטי או לייצר מהונדסים בעלי חיים באמצעות פעולת שירות זו SCNT.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים תאמו ההנחיות של אוניברסיטת Kindai על טיפול ועל שימוש של חיות מעבדה.
1. הכנת תרבות המדיה
- להתכונן המדיום שונה KSOM (mKSOM) העובר תרבות, המורכב 95 מ מ NaCl, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 0.35 מ מ ח'2PO4, 0.2 מ מ MgSO4 · 7 שעות2O, מ"מ 1.71 CaCl2 · 2H2O, 0.2 מ מ עומק (+)-0.2 מ מ פירובט נתרן, גלוקוז 1.0 מ מגלוטמין, 1.0 g/L פוליוינילפירולידון (PVP), מ מ 25.07 NaHCO3, 10 מ מ נתרן DL-לקטט 0.05 g/L פניצילין, 0.05 g/L סטרפטומיצין במים סטריליים.
- להתכונן המדיום באגירה Hepes CZB (HCZB) העובר מניפולציה, המורכב מ מ 81.5 NaCl, 4.8 מ"מ אשלגן כלורי, 1.7 מ"מ CaCl2 · 2H2O, מ מ 1.18 MgSO4 · 7 שעות2O, מ מ 1.18 ח'2PO4, מ מ 0.11 EDTA · 2Na, מ מ 36.1 נתרן DL-לקטט, 5.55 ממ ד (+)-גלוקוז, 0.025 g/mL פניצילין, 0.035 g/L סטרפטומיצין, מ"מ 0.014 פנול אדום, 1.0 g/L אלכוהול, NaHCO 5.0 מ מ3ו 20.0 mM Hepes מלח הנתרן במים סטריליים.
- היכונו המדיום הפעלה להפעלה oocyte: בינוני mKSOM בתוספת 50 ננומטר TSA, 2 מ מ EGTA, µg/mL 5 cytochalasin B (CB), ו SrCl 5 מ מ2.
2. הכנה של יונים שור אלבומין (dBSA)
- להמיס 1.2 גר' אלבומין שור (BSA) 10 מ ל מים סטריליים בטמפרטורת החדר (ריכוז סופי של 12%).
- להוסיף כ 0.12 גרם של מעורבות חילוף יונים-שרף חרוזים לעיל מוכן 12% של BSA במים סטריליים בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין.
- מתי החרוזים משנים צבע כחול-ירוק לזהב, לשחזר את הפתרון supernatant באמצעות פיפטה של. מכן להחליף את החרוזים הטרייה אלה (איור 1).
הערה: ההחלפה של חרוזים בדרך כלל מבוצע פעם אחת בלבד. זה כבר דורש כמה החלפות כדי להשלים deionization. רק בתור מדריך, אם הצבע של חרוזים נותרת ללא שינוי של כחול-ירוק לזהב, הוא מציין את חילוף יונים הושלם. - לשחזר את הפתרון לאחר שנוכח כי אין שינוי צבע בהחרוזים.
הערה: אם הפתרון התאושש הופך מעוננים, centrifuge אותו כדי למנוע סתימת המסנן (175 x g, 5 דקות). - תוספת התאושש את הפתרון עם 250 µL של 10.5% NaHCO3.
הערה: תהליך זה מיועד הפתרון dBSA לנטרל. את מצב ה-pH. עם זאת, NaHCO3 ניתן לוותר. - לחטא את תגובת שיקוע באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר, ולאחסן ב-20 ° C כפתרון מניות dBSA.
3. oocyte אוסף
הערה: כל העכברים היו מתוחזקים שבשליטת אור וחדרים ממוזגים.
- סופר-מביצת כל עכבר B6D2F1 הנשי (בגילאי 8-10 שבועות) על ידי הזרקת בקרום הבטן של 7.5 IU של סוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) ו- 7.5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) 48 שעות לאחר הזריקה PMSG.
- לבצע המתת חסד על-ידי נקע בצוואר הרחם 14-16 שעות לאחר הזרקת hCG. תחתכי את הבטן כדי לגשת את באיברי הרבייה באמצעות טכניקות ניתוח סטנדרטי13. בקצרה, צובטים את העור ולגרום חתך לרוחב קטן בקו האמצע עם מספריים. להחזיק העור בחוזקה מעל ומתחת החתך ומשוך את העור כלפי בראש וזנב. חתך של הצפק באמצעות מספריים, לדחוף את הסלילים של המעיים מהדרך ואשר נוכחותם של שני קרניים של הרחם, oviducts את השחלות.
- שושלת oviducts עם פינצטה ומספריים ישרים קטנים, מקום על גליון נייר סינון לנגב את הדם פני. להגדיר את oviducts שמן מינרלי. לאחר מכן, לחתוך ampulla של oviduct באמצעות מחטים לנתיחה, ולהעביר את מתחמי קומולוס-oocyte מגיע ampulla של oviduct לתוך µL 200, טיפות HCZB בינוני עם 0.1% hyaluronidase. תקופת דגירה של 5 דקות על צלחת התחממות כדור הארץ.
התראה: חשיפה של יותר מ 10 דקות HCZB בינוני עם 0.1% hyaluronidase יהיה מזיק עבור oocytes. - ודא כי התאים cumulus משתחררים מן מתחמי קומולוס-oocyte תחת stereomicroscope, העברה מפה של meiotic (MII) השני בשלב oocytes עם כמה תאים cumulus הנותרים כדי dBSA mKSOM בינוני 0.3% המכיל. לאחר מכן, לשטוף את oocytes הבמה MII ארבע פעמים על ידי pipetting למעלה ולמטה (באמצעות על פיפטה של < 100 מיקרומטר הקוטר הפנימי) ב- mKSOM בינוני המכיל dBSA 0.3% עבור ניתוק cumulus תאים.
הערה: השימוש פיפטה קטן מאפשר ניתוק cumulus התאים. - דגירה oocytes הבמה Mll ב mKSOM בינוני המכיל dBSA 0.3% ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 החממה עד העקירה.
הערה: פיפטה קטנים בקוטר מעט גדולה יותר מזו של oocyte היא מומלצת.
4. הכנה של תאי התורם העברת גרעין
- לאחר צעדים 3.3-3.5, oocytes חשופה מבודדים מן מתחמי קומולוס-oocyte. העברת כמות קטנה (כ- 2 µL) של התאים cumulus הנותרים התפזרו מ מתחמי קומולוס-oocyte HCZB בינוני עם 0.1% hyaluronidase HCZB בינוני עם 6% dBSA באמצעות פיפטה של תחת stereomicroscope.
- המקום התאים cumulus HCZB בינוני עם 6% dBSA בצלחת התחממות כדור הארץ ב 37 ° C עד לצורך SCNT.
הערה: כאשר תאי פיברובלסט (למשל., מאתר פיברובלסטים עוברית) הם משמשים תאי התורם, לנתק את התאים מתוך קערה תרביות רקמה, centrifuge אותם לתוך גלולה. Resuspend בגדר של תאים HCZB בינוני המכיל 6% dBSA.
5. העקירה של Oocytes
- להכין 9% PVP בינוני על-ידי הוספת 0.9 g PVP בינוני HCZB מ"ל, לשמור במקרר ללילה (4 ° C) ולאחר מכן לחטא אותו באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר.
- להכין CB מלאי פתרונות (ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל) על-ידי הוספת 5 מ"ג של CB 5 מ של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). לדלל את הפתרון מניות CB HCZB בינונית (ריכוז הסופי של 5 µg/mL) ולהשתמש כפתרון העקירה.
- לשטוף את oocytes הבמה Mll ב 20 µL בינוני HCZB המכיל 5 µg/mL CB (פתרון העקירה) על ידי שאיפה ונשיפה דרך פיפטה סטיריליים (בתוך קוטר: מיקרומטר 150 200 מיקרומטר). חזור על הפעולות כביסה חמש פעמים. להמתין כ 10 דקות בצלחת התחממות כדור הארץ בפתרון העקירה לפני התחלת תהליך העקירה.
- הכינו את תא העקירה כפי שמוצג באיור 2A. להעביר את oocytes Mll לתא העקירה על ידי שאיפה ונשיפה באמצעות פיפטה של (בתוך קוטר: מיקרומטר 150 200 מיקרומטר); מקום 4 µL של העקירה פתרון ולכסות את התא עם שמן מינרלי.
הערה: במקום חדר, גרסת כיסוי של 60 מ מ פטרי יכול לשמש. - לזהות את הצירים ואת כרומוזומים של oocyte הבמה MII תחת מיקרוסקופ (400 X) בטמפרטורת החדר. אוריינט את oocyte הבמה Mll עם הגוף בולטת הקוטב הראשון, כך המיקום של ציר של כרומוזום הוא 3 או 9 (איור 2B) מיקום באמצעות פיפטה אחזקות micropipette.
הערה: המיקרוסקופ משמש יש עדשות של 400 X הגדלה בסה. בנוסף, העדשה המטרה N.A הוא 5 X / 0.12 ו 40 X / 0.55. הדופק piezo הנהיגה של פיפטה היתרי קידוח מהיר pellucida zona. בנוסף, מערכת הלייזר (למשל, XYClone) הוא גם שמיש עבור קידוח של pellucida zona במקום מערכת הנהיגה piezo. - להגדיר את עוצמת הדופק piezo 3-6, ולאחר לקדוח pellucida zona באמצעות פיפטה המיקרומניפולציה (7-8 מיקרומטר הקוטר הפנימי שטוח הסתיימה tip) עם דופק piezo נהיגה. לאחר פתיחת חור zona pellucida, enucleate לחלוטין את הצירים ואת כרומוזומים עם כמות מינימלית של הציטופלסמה (איור 2C).
הערה: במהלך תהליך זה, oocytes נוטים בחוזקה לצרף לתחתית צלחת או פיפטה בשל המדיום ללא BSA14. תוך 10 דקות, יש להשלים את תהליך העקירה, oocytes enucleated צריכה להחזיר אותם החממה. מספר מתאים של oocytes כי ניתן לטפל באחד העקירה היא בין 10 ל- 20. עבור קבוצות גדולות יותר של oocytes, הוא חזר ההליך העקירה. - לאשר את העדר של כרומוזומים בתוך הציטופלסמה תחת האור הנראה (איור 2C, התיכון), ולאחר מכן לשטוף את oocytes enucleated ביסודיות בינוני mKSOM המכיל dBSA 0.3% חסר CB. להכיר את המנה החממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 עד תא פיוז'ן.
הערה: לאחר העקירה, הציטופלסמה יוסר פלסמת הביצה מכיל את הצירים ואת כרומוזומים.
6. היתוך של תא התורם, של Oocyte Enucleated
-
הכנת HVJ-E
- להוסיף µL 260 בפתרון ההשעיה כקרח HVJ-E HVJ lyophilized-E (הערכה, ראה את הטבלה של חומרים), פיפטה למעלה ולמטה עד מושעה באופן מלא.
הערה: הכמות המתאימה של HVJ lyophilized-E מוכן בבקבוק, 260 µL HVJ-E השעיית פתרון כלול בערכה. - להכין 5 aliquots µL של הפתרון HVJ-E ולאחר מכן לאחסן ב- 80 ° C עד תא פיוז'ן.
התראה: להתייחס בזהירות את HVJ-E על קרח, שכן הוא הרגיש. לאחר סיום הניסוי, כראוי חומרי החיטוי HVJ-E, מכולות כדי לחלוטין הפוך ללא פעיל וירוס רכיבים.
- להוסיף µL 260 בפתרון ההשעיה כקרח HVJ-E HVJ lyophilized-E (הערכה, ראה את הטבלה של חומרים), פיפטה למעלה ולמטה עד מושעה באופן מלא.
-
תא פיוז'ן
- לדלל את µL 5 HVJ-E פתרון עם 20 µL של המאגר פיוז'ן תא מיד לפני השימוש. במקום הפתרון HVJ-E מדולל על הקרח עד השימוש.
הערה: המאגר פיוז'ן תא כלולה ערכת HVJ-E. - הכן תא למכונה כפי שמוצג באיור 3 א. להעביר את oocytes enucleated HCZB בינוני על המיזוג התא באמצעות פיפטה של (בתוך קוטר: מיקרומטר 150 200 מיקרומטר); מקום 4 µL של כל פתרון (HCZB בינוני המכיל 6% -BSA תאי התורם, פתרון HVJ-E, HCZB בינוני, 9% PVP HCZB בינוני) ולכסות את התא עם-1 מ של שמן מינרלי.
הערה: מספר מתאים של oocytes enucleated מועברים לתא מניפולציה במהלך הליך פיוז'ן תא אחד היא בין 5 ל- 30. עבור קבוצות גדולות יותר של oocytes, ההליך פיוז'ן תא חוזר על עצמו. במקום חדר, כיסוי פטרי 60 מ מ ניתן להשתמש, אם הם זמינים. - מניחים את oocytes enucleated HCZB בינוני תחת מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר X magnificationat 400. האחות תאי התורם באמצעות על פיפטה המיקרומניפולציה (6-7 מיקרומטר הקוטר הפנימי שטוח הסתיימה tip), לסלק תאים לתוך HVJ-E השעיית פתרון.
- אז תשאף cumulus התאים אחד-אחד עם הפתרון הבולם HVJ-E באותה מידה להפרידם אחד מהשני, הפעלת תא טורי פיוז'ן. שמור את oocytes enucleated בינוני HCZB באמצעות פיפטה של אחזקות. תרגיל של pellucida zona עם פיפטה המיקרומניפולציה עם דופק אלמנט פייזו (האינטנסיביות של 3-6, במהירות של 2-3).
- לאחר פתיחת החור pellucida zona, מניחים תלולית תא בחוזקה הקרום oocyte יחד עם HVJ-E פתרון הבולם עם אמצעי אחסון 5 פעמים הנפח של תא קומולוס, מבלי לעבור דרך קרום oocyte.
הערה: להכין 6-7 מיקרומטר הקוטר הפנימי שטוח הסתיימה טיפים של פיפטות המיקרומניפולציה cumulus תאים. פיפטות יש לרחוץ באופן קבוע באמצעות 9% PVP בינונית לשמירה על שחרור תא חלקה. צעדים 6.2.3 - 6.2.5 חייב להסתיים בתוך 10 דקות, או היעילות של פיוז'ן התא יהיו נמוכים. ממברנה ודוקטורנט של HVJ-E הוא מומת על ידי autoclaving, טיפול עם חומרי ניקוי, או 70% אתנול. לאחר הניסוי, הפתרון HVJ-E יש כראוי להמית. - לאחר מניפולציה של פיוז'ן תא, מיד להעביר את oocytes dBSA mKSOM בינוני 0.3% המכיל, ולעבור אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לשעה.
- לדלל את µL 5 HVJ-E פתרון עם 20 µL של המאגר פיוז'ן תא מיד לפני השימוש. במקום הפתרון HVJ-E מדולל על הקרח עד השימוש.
7. הפעלה של Oocytes המשוחזרת ואת הטיפול עם Trichostatin A ויטמין C
-
הכנת TSA
- לוותר על פתרון TSA 5 מ מ לתוך 3 µL aliquots, ולאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
- להוסיף 2.5 µL של 5 מ מ TSA מניות פתרון 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (ריכוז של 12.5 מיקרומטר).
- לדלל 8 µL של 12.5 מיקרומטר TSA מניות פתרון 2 מ"ל של הפעלת בינוני, בינוני mKSOM (ריכוז סופי של 50 ננומטר).
-
הכנת VC
- להוסיף 1 מ ג של VC לתוך 1 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין סטרילי, ולאחסן ב-20 ° C.
- להוסיף הפתרון מניות הון סיכון בינוני mKSOM (ריכוז הסופי של µg 10/mL).
-
הפעלת Oocytes המשוחזרת
- שעה לאחר היתוך תא, בדוק את כרומוזום מוקדמת עיבוי (PCC) ב- oocytes ששוחזר (איור 3B) באמצעות מיקרוסקופ (400 X).
- להעביר את oocytes המשוחזרת המדיום הפעלה (ראה את הצעד 1.3) המכיל TSA ולאחר תקופת דגירה של 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 באוויר (איור 3C). להתבונן היווצרות של pro-גרעינים ב העוברים SCNT, ולאחר מכן להחיל 2 שעות הטיפול TSA mKSOM בינוני המכיל 0.3% dBSA (איור 2C).
- העברת העוברים שטופלו TSA לבינונית mKSOM בתוספת VC, תקופת דגירה של 7 שעות, כפי שמוצג באיורתלת-ממד.
- לאחר 7 שעות של טיפול VC, להעביר את העוברים VC שטופלו dBSA בינוני mKSOM 0.3% המכיל ולאחר תקופת דגירה של 4 ימים ב- 37 מעלות מתחת 5% CO2 באוויר.
הערה: כדי לייצר עכברים משובטים, להעביר שלב 2 תאים נורמליים מורפולוגית עוברי לתוך oviducts של עכברים נקבה בהריון מדומים (MCH(ICR)) ביום כאשר פקק הנרתיק נמצא (יום 0.5 pseudopregnancy)15. לאחר ימים 19.5, המספר של ההשתלה, ילודים נרשמים אחרי קיסרי.
Representative Results
כדי לייצר עוברי העכבר משובטים, תלולית תאים פיברובלסטים עוברית שימשו. מספר oocytes המשוחזרת ופיתוח לשלב 2-תא לאחר הפעלת oocyte מוצגים בטבלה 1. שיעור גבוה מאוד של היווצרות pronuclear (89 ל- 100%) ופיתוח לשלב 2-תא (77-89%) נצפו בכל התנאים. חלק עוברים משובטים, אשר היו נגזר מן התאים cumulus ופיתח לשלב 2 תאים, הועברו oviducts של נשים בהריון מדומים. הצאצאים משובטים שישה מתוך 72 עוברי שהועברו יוצרו של שלוש נקבות בהריון על ידי טיפול סדרתי של TSA ו- VC (איור 4). כ- 15% של העוברים משובטים דווחו לפתח המונח על-ידי ביצוע הליכים זו SCNT12. בנוסף, העברת העוברים משוכפל 2-תא במוסדות אחרים השיג צאצאים חיים 9 עד 15%, אשר מייצג את התפתחות טובה יותר מאשר הטיפול TSA יחיד על עוברי משובטים. יתר על כן, הטיפול עם TSA ו- VC לשפר באופן משמעותי את היעילות של במבחנה התפתחות לשלב הבלסטוציסט (טבלה 2, P < 0.05, מבחן t של סטודנט). במבחנה התפתחותית נתונים אלה מדגימים כי ההשפעה החיובית של TSA ו- VC הינה מוגבלת על ידי העכבר זנים וגם על ידי סוגי תאים. תוצאות אלו מראים כי שיטה זו SCNT מקלה על יכולת התפתחותית של העוברים משובטים.
איור 1: הכנת dBSA.
מתוארים הליכים צעד אחר צעד להכנת dBSA פתרון. היקף יונים יכולה להישפט על-ידי שינוי הצבע של החרוזים. באיור השמאלי העליון מציג את 1.2 גר' BSA הוא מומס 10 מ"ל מים סטריליים בטמפרטורת החדר. לאחר BSA התפרקה, החרוזים שרף-יונים נוספים (מימין). כאשר התערובת של BSA פתרון עם חרוזים שרף חילוף יונים משנים צבע כחול-ירוק כדי זהב (הימנית התחתונה), להחליף את החרוזים חדשים. הדמות הימנית התחתונה מראה הצבע של חרוזים נשאר כחול-ירוק, יונים הסתיימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הליכים העקירה.
(א) ציור של תא העקירה. העקירה של oocytes מתבצע על המדיום HCZB עם CB. עבור מערכת הנהיגה piezo, מקום של 9% PVP בינוני משמש כדי להתכונן פיפטה מזכוכית את העקירה. כתמים מכוסים על ידי שמן מינרלי. דיאגרמה (B) A ומיקרוסקופ להציג את המיקום של הצירים, כרומוזומים לפני העקירה. ראשי חץ שחור: הצירים ואת כרומוזומים. ראשי חץ אדום: הגוף הקוטב הראשון. (ג) A תרשים, מיקרוסקופ כדי להראות העקירה מוצלחת. ראשי חץ שחור: הצירים ואת כרומוזומים. ראש חץ אדום: הגוף הקוטב הראשון. ראש חץ כחול: החור zona pellucida. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תא פיוז'ן הליכים, תרבות תנאי SCNT עוברי.
(א) ציור של תא למכונה. תא פיוז'ן מתבצע במדיום HCZB המכיל 6% dBSA. מקום 9% PVP בינוני משמש כדי להכין את פיפטה מזכוכית תא פיוז'ן. כתמים מכוסים על ידי שמן מינרלי. דיאגרמה (B) A ומיקרוסקופ של עיבוי כרומוזום מוקדמת הקימו שעה לאחר תא פיוז'ן (חץ שחור). (ג) A תרשים, מיקרוסקופ של המבנה pronuclear הקים שש שעות לאחר הפעלת (חץ שחור). סכימת (D) של הטיפול TSA VC, dBSA SCNT עוברי. החץ הירוק מייצג את הטיפול עם TSA, ואחריו הדגירה עם VC (חץ צהוב) תחת mKSOM בינוני המכיל עם 0.3% dBSA (חץ כחול). ראשי חץ לציין את התזמון של שינוי בינוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הצאצאים משובטים נגזר cumulus תאים רק לאחר ניתוח קיסרי לאחר 19.5 ימי ההריון.
יש placentae בשורה העליונה. אופספרינג משובטים המוצגת כאן נוצרו באחד העברת גרעין ניסוי של שלוש אמהות פוסטר. גודל השליה היה גדול פי 1.5 עד פי 2 יותר מהגודל של אלה המיוצר על ידי הפריה במבחנה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| קבוצה | סוג התא התורם | המתח העכבר | לא. של oocytes בשימוש | לא. של oocytes התמזגו | לא. של oocytes מציג כרומוזום מוקדמת עיבוי | לא. של oocytes מראה pronuclei היווצרות (%) | לא. של oocytes מעוצב-pronuclei שהתפתח ל 2-תא עוברי (%) |
|
| מהטי VC | קומולוס | × C57BL/6 DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| ללא טיפול | קומולוס | × C57BL/6 DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| מהטי VC | פיברובלסט עוברית | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| ללא טיפול | פיברובלסט עוברית | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
טבלה 1: השפעת הטיפול TSA ו- VC במבחנה פיתוח של העכבר משובטים העוברים לשלב 2-תא.
| קבוצה | סוג התא התורם | המתח העכבר | לא. 2 תאי העובר בשימוש | לא. של 2 תאים העוברים שפותח עבור כל שלב (%) | |||
| 4 תאים | morula | הבלסטוציסט | |||||
| מהטי VC | קומולוס | × C57BL/6 DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) | |
| ללא טיפול | קומולוס | × C57BL/6 DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| מהטי VC | פיברובלסט עוברית | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| ללא טיפול | פיברובלסט עוברית | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| -b, c-d עילי שונים בתוך התאים התורם אותו מייצגים הבדלים משמעותיים (P < 0.05) | |||||||
בטבלה 2: השפעות הטיפול TSA ו- VC במבחנה פיתוח של העכבר משובטים העוברים לשלב הבלסטוציסט.
Discussion
לסיכום, תוצאות אלה מראים כי השיטה SCNT שהוצגו יכול להפחית קשיים טכניים, להגביר את היעילות של SCNT מבלי לדרוש שינויים גנטיים, תוספי mRNA (טבלה 1, בטבלה 2) ואני להבטיח ייצור יציב עוברים משובטים. שיטה זו מאפשרת לנו לשחזר עוברי SCNT יותר מאשר בשיטות המקובלות עקב שיעור ההישרדות יותר פרוטוקול מפושטת. פרוטוקול זה, הינו צעד קריטי תא פיוז'ן. להפקת בהצלחה עכברים משובטים, היא חיונית כדי להבטיח הכמות הנכונה של HVJ-E תיאר בפרוטוקול נשמר במהלך תהליך היתוך תא oocytes צריך לחזור החממה בתוך 10 דקות במהלך השלבים 6.2.3 - 6.2.5. מאז 20-30 תאי התורם יכול aspirated יחד עם HVJ-E במועד פיפטה מניפולציה, מספר oocytes מתקבל על ידי פעולה אחת הוא גדול מזה של השיטה הקיימת. בסופו של דבר, נוכל לייצר כ 20 עד 30 oocytes נבנה מחדש בתוך 10 דקות. גם כאשר עובד עם אוסף גדול של oocytes (100 או יותר), ההליך פיוז'ן התא צריך לקחת שעה או פחות על ידי חוזרות המדרגות 6.2.3 - 6.2.5. השיטה וטכניקות המובאת כאן יכול לשמש פרוטוקולים יעיל עם דרישות טכניות מפושטת.
בזמן הנוכחי, המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפיתוח של SCNT עוברי עדיין אינם ברורים. שיטה SCNT משופרת זו תורם גם לימוד מנגנונים אלה התיכנות, שכן בשיטה זו יכול לייצר רבים עוברים משובטים בניסוי אחד בלבד. שיטה זו משתמשת תאים סומטיים עם קרום התא שלם פיוזן התא. לפיכך, ייתכן שתהיה אפשרות ליישם גישה זו לתאים אחרים כגון קצה הזנב תאים16, תאי סרטולי17ו-18תאי גזע עובריים (ES). כאשר שיטות קונבנציונליות SCNT משמשים הזרקת תאים גדולים יחסית, כגון תאים קצה הזנב, ישירות לתוך הציטופלסמה oocyte, הוא הופך אפילו תובעניים יותר מבחינה טכנית להשיג עוברי בשידור חי. בנוסף, תאים קשה יחסית, כמו תאי סרטולי, קשים לפרוץ על ידי pipetting עבור הזרקה. כאשר אלה סוגי תאים שונים נחשבים, השיטה פיוז'ן תא ניצול HVJ-E היא פשוטה ויעילה. למרות הערך והבטיחות של HVJ-E היה להן כמשכנע והפגינו19,20, זה עשוי להיות חשוב לשקול מחדש את הכדאיות של שימוש HVJ-E להפקת משובטים חיות למטרות חקלאיות או ביו.
יתר על כן, קבוצה אחת לאחרונה הפיקה בהצלחה עכברים משובטים נגזר שתן תאים21. כדי להציל את זני יונקים בסכנת הכחדה, מעתה ואילך SCNT באמצעות התאים שנאספו בצורה לא פולשנית, כגון התא שתן, יהיה אידיאלי. לאחרונה, קבוצה נוספת יצר ישירות משובטים עכברים באמצעות CD4 אנטיגן ספציפי+ T תאים22. זה יהיה מעניין לבחון אם שיטה זו ישימה גם לשבט עכברים מתאי כזה ביעילות. יתר על כן, Latrunculin א דווח כחלופה טובה יותר עבור עיכוב פלמור אקטין במהלך העקירה והפעלה parthenogenetic של SCNT oocytes23. חקר העתיד עלול לגלות אם הטיפול Latrunculin A, במקום cytochalasin B, משפר עוד יותר דור הצאצאים משובטים. בנוסף, הטיפול TSA בהצלחה שימש ב עכברים, חזירים24ו ארנבונים25 על-ידי שינוי זמן טיפול, תקופה, או ריכוז. יתר על כן, VC משפר את התפתחות SCNT חזירי10אלא גם משפר את ייצור תאי iPS בני אדם ו עכברים26. לכן סביר לשער כי TSA וטיפול VC ניתן להחיל גם על זני יונקים אחרים, אולי נזדקק לייעל את הזמן טיפול של TSA ו- VC עבור כל המינים.
לסיכום, שיטה זו יהיה ניתן לייצר עכברים משובטים ברמה המעשית של יעילות עם נהלים פשוטים. לכן, התוצאות של מחקר זה יכול להוביל אותנו להשתמש בטכנולוגיה SCNT על שימור המשאבים הגנטי של בעלי חיים נדירים, להבנת המנגנון המולקולרי של התכנות גרעינית, התפתחות מוקדמת.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מספרים גרנט JSPS KAKENHI JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 והספקה Sumitomo גרנט קרן עבור פרויקטים מחקריים מדע בסיסי (150810 כדי והספקה). Kindai אוניברסיטת מחקר גרנט (15-I-2 והספקה, m. A). שיטת הפעולה להכיר את התמיכה הליבה שסופקו על-ידי לחקר הסרטן בבריטניה (C6946/A24843) וטרסט (203144/Z 16 Z). אנו מודים גב ש Backes-Kamimura, מר ג'יי חורבת על הוכחה קריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
