Summary
トリコスタチン A、ビタミン C、および脱イオン ウシ血清アルブミンを使用してマウスのクローニングのため大幅に向上手法について述べる。クローン胚の効率的な開発をサポートする簡略化された、再現可能なプロトコルを示す.したがって、このメソッドは、マウスのクローニングのための標準化された手順になります。
Abstract
体細胞核移植法は、直接ドナー細胞からクローンとして作られた動物を生成するユニークな機会を提供しています、熟練した技術が必要です。さらに、クローン作成の効率は、クローン動物、特にマウスの成功の生産以来低残っています。クローン作成の効率を向上させる多くの試みがずっとあるとトリコスタチン A (TSA)、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、クローン作成の効率を高めるために広く使用されています。ここでは、マウスで劇的に改善されたクローンの作成方法を報告します。この体細胞核移植法には、簡単な操作を可能にする日本の封筒 (HVJ-E)、センダイウイルスベクターの使用が含まれます。また、TSA との脱ウシ血清アルブミン (地場)、ビタミン C (VC)、2 つの小さな分子を用いた治療は萌芽期の開発のために非常に効果的。このアプローチは追加注入も遺伝子操作を必要とし、こうしてシンプルで適切な活用法を示します。このメソッドは、培養細胞からの遺伝子改変動物を生産する研究者のための技術的に可能なアプローチになるかもしれない。さらに、クローニングを介して絶滅寸前の動物の救助のための便利な方法ででしょう。
Introduction
法技術により、除核卵子に転送する 1 つだけの体細胞や核を用いたクローン動物の生産。法技術の目的の 1 つは、クローン胚からの核移植胚性幹細胞 (NT Esc) 線の派生です。1998 年、和歌山ら。 名前 Cumulina 最初時間1正常にクローン マウスを生産で報告された。その後、マウスのクローニングは広く研究されていると核体細胞核のリプログラミングに多くの重要な洞察を取得されています。その一方で、この手法は、ことはかなり困難である多数のマイクロマニピュレーション ステップ伴われるマスター、3 ヶ月2以上の集中的な訓練を必要とします。
法を用いたクローン マウスの生産は、日本 (HVJ)4センダイウイルスベクターによる細胞融合法に元ホノルル法1融合の方法3から進化しています。ただし、有棘を介して細胞核の直接注入は卵母細胞生存に不利に作用する傾向があります。各細胞膜は最適条件を決定するが難しく、硬さが異なるので、融合は低効率です。HVJ の取り扱いは、研究者と実験動物の安全のために特定の機器が必要なため面倒です。最近では、ドナーの細胞と卵母細胞の細胞質の融合、HVJ-E に使用される5をされています。HVJ エンベロープベクターは、ウイルスの増殖や感染能力なし膜を融合する能力のみが。HVJ のゲノム Rna は HVJ e. で完全に活性化HVJ エンベロープベクターの使用したがって細胞融合法中の使いやすさをサポートします。
いくつかのレポートは、TSA、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と法胚の治療が 1% から 6.56,7未満からライブ子犬の生産効率を大幅に向上を示しています。TSA 治療法胚8のヒストンを修飾によるリプログラミングを加速します。最近、特定の Mrna、ヒストンのリジン デメチラーゼ亜科ヒストン H3 ライシン 9 (H3K9) を削除する 4 (KDM4) の注入法胚で、耐 reprograming 地域で特にトリメチルの開発の増加に示されているクローンとして作られました。マウス胚9。一方、VC、ヒストン修飾としても、H3K910トリメチルを減少しています。また、VC はブタ法10の胚を強化し。それは、法胚に地場の注入は胚11の改善につながることが報告されています。
以前、地場、一緒に小分子、すなわち TSA と VC の組み合わせが大幅に法胚12の開発を強化とわかった。ここでは、非常に効率的でシンプルなクローン作成の手順12を表しますマウス、以前に報告された法方法を詳しく説明します。HVJ E の処理についても述べるこれらは、遺伝資源を保存またはこの法による遺伝子改変動物を生産する発達と生殖生物学の分野で多くの研究者を助けることができます。
Protocol
動物のすべてのプロシージャは、ケアと実験動物の使用のための近代大学のガイドラインに適合。
1. 培地の調製
- 成る 95 mM の NaCl, KCl 2.5 mM、0.35 mM KH2PO4, 0.2 mM MgSO4 · 胚培養に変更された KSOM (mKSOM) メディアを準備します。7 H2O、1.71 mM CaCl2 ·2 H2O、0.2 mM D-(+)-グルコース、0.2 mM ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM 1.0 g/L ポリビニルピロリドン (PVP)、25.07 mM NaHCO3、L-グルタミン 10 mM DL-乳酸ナトリウム、0.05 g/L、ペニシリン、0.05 g/L の滅菌水にストレプトマイシン。
- 胚操作、81.5 mM の NaCl、KCl、4.8 mM 1.7 mM CaCl2 · から成る Hepes バッファー CZB (HCZB) メディアを準備します。2 H2O、1.18 mM MgSO4 ·7 H2O、1.18 mM KH2PO4、0.11 mM EDTA ·36.1 mM 2Na ナトリウム DL-乳酸、5.55 mM D-(+)-グルコース、0.025 g/mL ペニシリン、ストレプトマイシンの 0.035 g/L、0.014 mM フェノール レッド、1.0 g/L ポリビニル アルコール、5.0 mM NaHCO3と 20.0 mM Hepes ナトリウム塩を滅菌水。
- 卵母細胞の活性化のため活性化メディアの準備: 50 nM TSA、2 ミリメートル グリコールエーテルジアミン四酢酸、5 μ G/ml サイトカラシン B (CB) と 5 mM SrCl2と mKSOM 培。
2. 準備の純水ウシ血清アルブミン (地場)
- ウシ血清アルブミン (BSA) の 1.2 g を常温 (12% の最終的な集中) 滅菌水 10 mL に溶かしてください。
- 穏やかな攪拌しながら常温で滅菌水に BSA の 12% を用意して上記に混合イオン交換樹脂ビーズ約 0.12 g を追加します。
- ビーズが青緑色から色を変更するとき金にピペットを使用して培養上清中の解決策を回復します。新鮮なとビーズを置き換えるもの (図 1)。
メモ: ビーズの交換は一度だけ実行されます通常。おそらく、完全な脱塩し、いくつかの代替が必要です。ビーズの色が変わらない場合、ガイドとしてのみゴールド ブルー グリーン、そのイオン交換が完全なことを示します。 - ビーズの色の変化がないことを確認した後、ソリューションを回復します。
注: 回収液は曇りになると、遠心 (175 x g、5 分) のフィルターの目詰まりを防ぐために。 - 回復した補足 10.5% NaHCO3の 250 μ L でソリューション。
注: このプロセスは、ph を中和する地場ソリューション用です。ただし、NaHCO3が不可欠であることができます。 - 0.45 μ m のフィルターを使用して上清を殺菌し、地場原液として-20 ° C で保存します。
3. 採卵
注: すべてのマウスは、光制御とエアコン付きの客室で維持されました。
- 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG) 7.5 IU の腹腔内投与による各女性の B6D2F1 マウス (高齢者は 8-10 週間) のスーパー排卵とひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 48 h PMSG 投与後の 7.5 IU。
- 頚部転位 14-16 h で安楽死 hCG 注射後。標準的な解剖技術13を用いた生殖管にアクセスする腹部を切開します。簡単に、皮をつまむし、ハサミで正中線で小さな横切開を行います。皮膚切開部の上下にかかわらずしっかりと押しながらヘッドとテールに向かって皮膚を引っ張ったりします。はさみを使って腹膜を切り取って腸のコイルをプッシュ方法のうち、子宮、卵管、卵巣の 2 つの角の存在を確認します。
- ストレートのハサミとピンセットで卵管を勧めた、表面の血を拭くためのフィルター紙のシート上に配置します。鉱物油で卵管を設定します。解剖針を使用して卵管の膨大部をカットし、200 μ L 滴 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中に卵管の膨大部からくる卵丘卵子複合体を移動します。温暖化のプレート上で 5 分間インキュベートします。
注意: 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中 10 分以上の露出は卵母細胞の有害でしょう。 - 転送第 2 減数分裂中期 (MII) 段階卵子 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場いくつかの残りの卵丘細胞を顕微鏡下で - 卵子複合体から卵丘細胞が解放されることを確認します。上下にピペッティングにより MII 期卵子を 4 回、洗って (のピペットを使用して < 100 μ m の内径) mKSOM 中含まれている 0.3% 地場残りの卵丘細胞のデタッチのために。
注: 小さなピペットの使用卵丘細胞の剥離が容易になります。 - MKSOM 中含まれている 0.3% 地場 37 ° c 未満 5% に Mll ステージ卵をインキュベート摘出まで CO2インキュベーター。
注:、卵母細胞のそれより若干大きい直径の小さなピペットをお勧めします。
4. ドナー細胞の核移植のための準備
- 手順 3.3 3.5 後、裸出卵子は卵丘卵子複合体から分離されます。顕微鏡下でピペットを使用して 6% 地場と HCZB 培地に 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 培地で卵丘卵子複合体から分散して残りの卵丘細胞の少量 (約 2 μ L) を転送します。
- 37 ° c まで法に必要な地球温暖化のプレートに 6% 地場と HCZB 中に卵丘細胞を配置します。
注: とき線維芽細胞 (e.g。、マウス胎児線維芽細胞) が培養皿からセルを外し、ペレットにそれらを遠心分離機ドナー細胞として使用する。HCZB 培 6% 地場における細胞のペレットを再懸濁します。
5. 卵母細胞の核出
- 0.9 g PVP を 10 mL HCZB 中に追加することによって 9 %pvp メディアの準備、(4 ° C)、一晩冷蔵庫で保存し、0.45 μ m のフィルターを使用してそれを殺菌します。
- CB 原液 (1 Mg/ml の濃度) を準備するには、ジメチルスルホキシド (DMSO) 5 mL に CB の 5 mg を追加します。HCZB 中 (最終濃度 5 μ G/ml) CB 原液を希釈し、摘出解決策として使用します。
- 吸い込むと滅菌ピペットを吐き出す HCZB 培 5 μ G/ml CB (摘出ソリューション) の 20 μ L Mll ステージ卵母細胞を洗い (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から)。5 回洗濯手順を繰り返します。摘出プロセスを開始する前に摘出ソリューションで温暖化のプレートに約 10 分を待ちます。
- 図 2 aに示すように、核出術室を準備します。核出術室に転送 Mll 卵子は吸い込むと吐き出すピペットを使用して、(内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);摘出ソリューションの 4 μ L を置き、チャンバー内に鉱物油をカバーします。
注: 代わりに、商工会議所、60 mm のペトリ皿のカバーを使用することができます。 - スピンドルと室温で顕微鏡 (400 倍) で MII 期卵子の染色体を識別します。ホールディング ピペット、マイクロ ピペットを使用して (図 2 b) 位置 3 または 9 では染色体とスピンドルの位置決め、顕著な第一極体と Mll 段階卵子に合わせます。
注: 使用される顕微鏡は、合計で 400 倍の倍率のレンズをあります。また、対物レンズ N.A は 5 X/0.12 と 40 X/0.55 です。ピペットのピエゾ パルス駆動透明帯の急速な掘削を許可します。さらに、レーザー システム (例えばXYClone) もピエゾ駆動システムの代わりに透明帯の掘削に使用可能です。 - 3 - 6、ピエゾ パルス強度を設定し、ピエゾ パルス駆動マイクロ ピペット (7-8 μ m 内径フラット エンド チップ) を使用して透明帯にドリルします。透明帯に穴を開ける後、完全にスピンドルと細胞質 (図 2) の最低量の染色体を摘出します。
注: この処理中に卵がちしっかりと皿の底を付けるまたは BSA14なし媒体によるピペットします。10 分以内摘出を完了する必要がありますと除核卵子がインキュベーターに返却する必要があります。適切な 1 つ摘出で操作することができます卵母細胞数は 10 と 20 の間です。卵母細胞の大きなバッチは、摘出術の手順が繰り返されます。 - 可視光 (図 2中間)、細胞質の染色体の有無を確認し、mKSOM 培 CB を欠けている 0.3% 地場で除核卵子を徹底的に洗います。37 ° C 未満 5% でインキュベーターに皿を紹介細胞融合までの CO2 。
注: 摘出後卵から削除される細胞質含むスピンドルと染色体。
6. 除核卵子ドナー細胞の融合
-
HVJ エンベロープベクターの準備
- 凍結乾燥 HVJ-E に冷たい HVJ-E 懸濁液ソリューションの 260 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください) とピペットの上下まで十分に中断されました。
注: 凍結乾燥 HVJ-E の適切な量は、瓶の中の準備し、260 μ L HVJ-E 懸濁液ソリューション キットに含まれております。 - HVJ-E 溶液 5 μ L の因数を準備し、細胞融合まで-80 ° C で保存します。
注意: それは温度に敏感なので慎重に氷の上 HVJ-E を扱います。実験、適切にオートクレーブ HVJ-E 材料およびウイルス コンポーネントを完全に不活化するコンテナーの完了後。
- 凍結乾燥 HVJ-E に冷たい HVJ-E 懸濁液ソリューションの 260 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください) とピペットの上下まで十分に中断されました。
-
細胞融合
- 使用直前に細胞融合バッファーの 20 μ L で HVJ-E ソリューションの 5 μ L を希釈します。氷の上に使用されるまで薄めた HVJ-E を配置します。
注: セル融合バッファーは、HVJ-E キットに含まれます。 - 図 3 aに示すように、セル核融合炉チェンバーを準備します。ピペットを使用して細胞融合の商工会議所の除核卵子を HCZB 媒体に転送 (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);各ソリューションの場所 4 μ L (HCZB 培ドナー細胞、HVJ-E ソリューション、HCZB 培地、6% BSA 9 %hczb 中 PVP) と鉱物油の約 1 mL とチャンバーをカバーします。
注: 適切な除核卵子が 1 つの細胞融合手順中の操作のために部屋に転送される数は、30 に 5 からです。卵母細胞の大きなバッチは、細胞融合手順が繰り返されます。商工会議所、代わりに 60 mm シャーレ カバーできる使用可能な場合。 - HCZB 中 400 X magnificationat 室温で顕微鏡下除核卵子を配置します。(6 7 μ m 内径フラット エンドの先端)、マイクロ ピペットを使用してドナー細胞を吸引、HVJ-E 懸濁液ソリューションに細胞を追放します。
- その後、卵丘細胞一つずつシリアル細胞融合を有効に、お互いから分離する均等に HVJ-E 懸濁液の解決策を吸い出しなさい。ホールディング ピペットを使用して HCZB 媒体に除核卵子をしてください。ピエゾ パルス (3-6、2 - 3 速の強さ) をマイクロ ピペットで透明帯をドリルします。
- 透明帯に穴開いたら、卵膜を経由せず卵丘細胞量の 5 倍のボリュームと HVJ-E 懸濁液の解決策と共に、卵膜にしっかりと積雲の細胞を配置します。
注: は、卵丘細胞をマイクロ ピペットの 6-7 μ m 内径先端フラット エンドを準備します。ピペットは、平滑リリースを維持するため定期的に 9 %pvp 中を使用して洗浄する必要があります。6.2.5 6.2.3 - の手順は 10 分以内に終えなければならないまたは細胞融合の効率は低くなります。HVJ エンベロープベクターの膜融合活性はオートクレーブ、洗剤、または 70% エタノール投与による不活化します。実験の後の HVJ-E ソリューションを適切に破棄する必要があります。 - 細胞融合の操作後、速やかに mKSOM 媒体含む 0.3% 地場、卵母細胞を転送し、37 ° C 5% 未満で保育器に移動 1 h の CO2 。
- 使用直前に細胞融合バッファーの 20 μ L で HVJ-E ソリューションの 5 μ L を希釈します。氷の上に使用されるまで薄めた HVJ-E を配置します。
7. 再建された卵母細胞と治療トリコスタチン A とビタミン C の活性化
-
TSA の準備
- 3 μ 因数に 5 mM TSA ソリューションを省略し、-20 ° C でソリューションを格納
- 1 mL の DMSO (12.5 μ M の濃度) に 5 mM TSA 原液の 2.5 μ L を追加します。
- 活性化中小企業 mKSOM 培地 2 mL に 12.5 μ M TSA 貯蔵液 8 μ L を希釈 (最終濃度 50 nM)。
-
VC の準備
- 滅菌のエンドトキシン フリーの水の 1 mL に VC の 1 mg を追加し、-20 ° C で保存
- MKSOM 培地 (最終濃度 10 μ G/ml) に VC 原液を追加します。
-
再建された卵母細胞の活性化
- 細胞融合後 1 時間は、時期尚早の染色体凝縮 (PCC) 再建された卵母細胞 (図 3 b) 顕微鏡 (400 倍) を使用してを確認してください。
- 再建された卵子を活性化媒体に転送 (手順 1.3 参照)、TSA を含む、37 ° C 未満 5% で 6 時間インキュベート CO2空気 (図 3)。Pro-核法胚の形成を観察し、適用 2 mKSOM 中含まれている 0.3% (図 2) 地場で TSA 治療のより多くの時間。
- VC と mKSOM 培に TSA 治療胚を転送し、 3 D 図で示すように、7 時間孵化させなさい。
- VC 治療の 7 時間後 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場 VC 治療胚を転送し、37 ° C 未満 5% で 4 日間インキュベート空気中の CO2 。
メモ: クローン マウスを生成するためには、通常形態の 2 細胞期胚を転送擬似妊娠したメスマウス (MCH(ICR)) (偽妊娠の 0.5 日)15見つかったら腟栓日の卵管に。19.5 日後帝王切開後着床と新生児の数が記録されます。
Representative Results
クローン マウス胚を作り出す、卵丘細胞と胎児線維芽細胞を使用されました。再建された卵と 2 細胞期に卵母細胞活性化後の開発の数は表 1のとおりです。前核形成 (89 ~ 100%) と 2 細胞期 (77 に 89%) に開発の非常に高い割合は、あらゆる条件下で観察されました。卵丘細胞から派生され、2 細胞期に開発された、クローンとして作られた胚の一部は擬似妊娠雌の卵管に移されました。72 転送胚から六つのクローンとして作られた子孫は、TSA の VC (図 4) シリアル処理による 3 妊娠中の女性から生産されました。クローン胚の約 15% は、この法の手順12を次で長期的に開発に報告されています。さらに、他の機関でのクローンの 2 細胞期胚の転送クローン胚の単一の TSA の治療よりもより良い開発を表します 9 ~ 15% 生きている子孫を遂げています。また、TSA と VC 治療が胚盤胞期胚培養の効率を大幅に改善 (表 2、 P < 0.05、スチューデントの t 検定)。これら体外発育のデータは、TSA と VC の肯定的な効果のマウス系統も細胞の種類によって限られたことを示します。この法法がクローンとして作られた胚の発生能を促進が示唆されました。
図 1: 地場の準備。
地場のソリューションを準備するための手順が描かれています。イオン交換の範囲は、ビーズの色の変化で判断できます。上左図 BSA の 1.2 g を常温で滅菌水 10 mL で溶解します。BSA が解散した後、イオン交換樹脂ビーズには (右上) が追加されます。イオン交換樹脂ビーズの BSA 溶液の混合物が青緑色から色を変更すると金 (右下)、新鮮なものでビーズを置き換えます。左下図は、ビーズの色が青緑のイオン交換が完了したことを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 摘出プロシージャ。
(A) 摘出術室の図。卵母細胞の摘出は、CB が HCZB 中で実行されます。ピエゾ駆動系 9 %pvp 中のスポットが摘出のためガラス ピペットを準備する使用されます。スポットは、鉱物油で覆われています。(B) A 図と顕微鏡写真は、スピンドルと摘出する前に染色体の位置を示します。黒の矢印: スピンドルと染色体。赤矢印: 第一極体。(C) A の図および成功した眼球摘出を顕微鏡写真。黒の矢印: スピンドルと染色体。赤矢印: 第一極体。青い矢印: 透明帯に穴。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: セルの融合のプロシージャおよび文化法胚の状態。
(A) セル核融合炉チェンバーのイラスト。6% 地場を含む HCZB 培地で細胞融合を行います。9 %pvp 中のスポットを使用して、細胞融合用ガラス ピペットを準備します。スポットは、鉱物油で覆われています。(B) A 図と時期尚早の染色体凝縮の顕微鏡写真は形成細胞融合 (黒矢印) 後 1 時間です。(C) A の図、前核構造の顕微鏡写真は、活性化 (黒矢印) 後 6 時間を形成しました。(D) 法胚の地場、VC、TSA の治療法緑の矢印は、TSA、0.3% 地場 (青い矢印) と mKSOM 培下で VC (黄色の矢印) と孵化によって続かれて治療を表します。矢印は、媒体を変更するタイミングを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: クローン動物の子孫は帝王切開後妊娠の 19.5 日の直後に卵丘細胞から派生しました。
一番上の行に胎盤があります。ここに示すクローン動物の子孫は、核移植実験 3 母親から 1 つに発生しました。胎盤サイズが体外受精によって作り出されるそれらのサイズより 1.5 倍から 2 倍大きくなった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| グループ | ドナー細胞型 | マウス緊張 | 違います。卵使用の | 違います。卵母細胞の融合 | 違います。時期尚早の染色体凝縮を示す卵母細胞の | 違います。卵前核形成 (%) を表示 | 違います。開発前核形成卵母細胞の 2 細胞胚 (%) |
|
| TSA、VC | 積雲 | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| 未処理 | 積雲 | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA、VC | 胎児線維芽細胞 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| 未処理 | 胎児線維芽細胞 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
表 1: TSA は、VC の処理に及ぼす影響、体外クローン マウス 2 細胞期胚の開発。
| グループ | ドナー細胞型 | マウス緊張 | 違います。2 細胞期胚を使用 | 違います。2 細胞期胚の各段階 (%) を開発 | |||
| 4 セル | 桑実胚 | 胚盤胞 | |||||
| TSA、VC | 積雲 | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) 、 | |
| 未処理 | 積雲 | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA、VC | 胎児線維芽細胞 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| 未処理 | 胎児線維芽細胞 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| a b c d同じドナー細胞の内で別の上付き文字を表す有意差 (P 0.05 <) | |||||||
表 2: TSA は、VC の処理に及ぼす影響、体外クローン マウス胚盤胞期胚の開発。
Discussion
結論として、示唆こと提示法法でした技術的な問題を減らすと遺伝の修正および mRNA の補足 (表 1表 2) を必要とせず法の効率を高めることを確認クローン胚の安定生産。このメソッドは、私たちの生存率と簡略化されたプロトコルのための従来の方法よりもより多くの法胚を再構築すること。このプロトコルでは 1 つの重要なステップは細胞融合です。正常に生成されたクローン マウスを HVJ-E プロトコルで説明されている適切な量が細胞融合プロセス中に維持、卵母細胞は 6.2.5 6.2.3 - の手順で 10 分以内のインキュベーターに返却する必要があることを確認する重要です。20 に 30 ドナー細胞は、操作ピペットで一度に HVJ-E と共に吸気することができます、ので、1 つの操作によって得られる卵の数は既存のメソッドのより大きい。最後に、我々 は 10 分以内約 20 に 30 再構築卵子を生成できます。6.2.3 - 6.2.5 の手順を繰り返して、卵 (100 以上)、大規模なバッチで細胞融合手順の作業は時間がかかる必要がある場合でも以下のもの。メソッドとここで紹介する手法は、簡略化された技術的な要件と効率的なプロトコルとして使用できます。
現時点では、法の胚の開発の基礎となる分子メカニズムはまだ不明です。この改良法法は、このメソッドはのみ 1 つの実験で多くのクローン胚を作り出すことができるので、このようなリプログラミングの機構を勉強にも貢献します。このメソッドは、そのまま細胞膜は細胞を使用して細胞融合を。したがって、尾先端細胞16、セルトリ細胞17、および胚性幹 (ES) 細胞18など、他のセルにこのアプローチを適用することがあります。尻尾先端電池などの比較的大きな細胞を注射で使用する従来法直接卵母細胞の細胞質になるもライブ胚を取得するより技術的に厳しい。また、比較的硬い細胞、セルトリ細胞など、ピペッティングを注入するため、断ち切ることは困難。これらの様々 な細胞のタイプを考慮する場合、HVJ-E を利用した細胞融合法はシンプルで効果的です。値、HVJ-E の安全性は、説得力のある実証19,20をされていますが、農業や医療の目的でクローン動物を生産するため HVJ-E を使用しての可能性を再検討することが重要ででしょう。
さらに、最近 1 つのグループは正常に尿細胞21から派生したクローン マウスを生産しました。今後哺乳類の絶滅危惧種を救うため尿細胞などの非侵襲的な方法で収集した細胞を用いた法が理想的であります。最近では、別のグループが直接抗原特異的 cd 4 を使用してクローン マウスを生成+ T 細胞22。それは、この方法は、効率的にそのような細胞からマウスのクローンに適用される場合は、検討は興味深いでしょう。さらに、Latrunculin A は、眼球摘出と単為法卵子23の中にアクチンの重合を阻害するためのより良い代替手段として報告されています。今後の研究は、サイトカラシン B のではなく、Latrunculin A 治療がさらにクローン動物の子孫の世代を改善かどうかを明らかにするかもしれない。さらに、TSA の治療使用されています正常にマウス、豚24、ウサギ25で治療時間、期間、および濃度を変更することによって。さらに、VC だけでなく豚法10、萌芽期の開発を強化、また人間とマウス26iPS 細胞生産を向上させます。したがって、TSA と VC の治療は他の哺乳類種にも適用でき、それぞれの種の TSA と VC の治療時間を最適化する必要があります推測するもっともらしいです。
結論としては、このメソッドは、簡単な手順で効率の実用的なレベルでクローン マウスを生成することが可能でしょう。したがって、本研究の結果は、私たち希少動物の遺伝資源の保全と分化と初期胚の分子機構を理解するために法技術を使用する可能性があります。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 JP15H06753、JP16H01321、JP16H01222、キロ住友財団基礎科学研究 (150810 キロに) に JP17H05045 によって支えられました。近代大学研究助成金 (15-私-2 キロと修士)。ミズーリ州は、癌研究イギリス (C6946/A24843) および Wellcome の信頼 (203144/Z/16/Z) によって提供されるコアのサポートを認めます。 証明書の読み取り、Backes 上村さん (名) と氏・ j ・ ホルバートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
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