Summary
마우스 trichostatin A, 비타민 C, 그리고 이온된 소 혈 청 알 부 민을 사용 하 여 복제 하는 극적으로 향상 된 방법을 설명 합니다. 우리는 복제 된 배아의 효율적인 개발을 지 원하는 단순화, 재현 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 따라서,이 메서드는 마우스 복제에 대 한 표준화 된 절차 될 수 있다.
Abstract
체세포 핵 이식 (SCNT) 직접 기증자 세포에서 복제 동물을 생산 하는 독특한 기회를 제공 하 고 숙련 기술의 사용을 요구 한다. 또한, 복제의 효율성 복제 동물, 특히 쥐의 성공적인 생산 이후 낮은 남아 있다. 복제 효율성을 개선 하기 위해 많은 시도 되었습니다 그리고 trichostatin A (TSA), 히스톤 deacetylase 억제 물 복제의 효율성을 향상 시키기 위해 널리 사용 되었습니다. 여기, 우리는 생쥐에서 극적으로 향상 된 복제 방법 보고. 이 체세포 핵 이식 방법은 일본 봉투 (HVJ-E), 쉽게 조작 가능 하 게의 Hemagglutinating 바이러스의 사용 포함. 또한, 두 개의 작은 분자, TSA와 이온된 소 혈 청 알 부 민 (dBSA), 비타민 C (VC)를 사용 하 여 치료 배아 발달에 대 한 매우 효과적입니다. 이 방법은 추가 주입도 유전자 조작, 요구 하 고 따라서 실제 사용에 대 한 간단 하 고, 적합 한 메서드를 제공. 이 메서드는 연구자 배양된 세포에서 유전자 변형된 동물 생산에 대 한 기술적으로 가능한 접근 될 수 있다. 또한, 복제를 통해 멸종 위기 동물의 구조에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다.
Introduction
SCNT 기술 enucleated oocyte 전송에 하나의 체세포 또는 핵을 사용 하 여 복제 동물의 생산을 수 있습니다. SCNT 기술의 목적 중 하나는 복제 된 배아에서 핵 이식 배아 줄기 세포 (NT-ESCs) 라인의 유래입니다. 1998 년에 와카야마 외 알., 보고 된 첫 번째 시간1Cumulina 라는 성공적으로 복제 된 마우스를 생산. 그 이후, 쥐의 복제 널리 연구 되었습니다, 그리고 체세포 핵의 핵 프로그래밍에 많은 중요 한 통찰력을 얻은. 다른 한편으로,이 기술은 꽤 어려운 수많은 micromanipulation 단계를 동반 된다 마스터, 3 개월2이상의 집중적인 훈련을 필요로.
SCNT를 사용 하 여 복제 된 쥐의 생산 일본 (HVJ)4의 Hemagglutinating 바이러스에 의해 셀 퓨전 메서드는 원래 호놀룰루 방법1, electrofusion 방법3에서 진화 했다. 그러나,는 있던 통해 세포 핵의 직접 분사는 해롭게 oocyte 생존에 영향을 미칠 경향이 있다. electrofusion은 각 세포 막에는 다른 경도, 최적의 상태를 결정 하 고 어려운 있기 때문에 효율성, 낮은. HVJ 처리 연구자 및 실험 동물의 안전에 대 한 특정 장비를 필요로 하기 때문에 힘 드는입니다. 최근, 기증자 세포와 oocyte 세포질 융합 HVJ-E 사용된5되었습니다. 만 HVJ-E는 바이러스의 증식 또는 감염 능력 없이 세포 막 융합 기능이 있다. Genomic RNAs HVJ HVJ e에서 완전히 활성화 되지 않습니다. HVJ-E의 사용은 따라서 SCNT 동안 세포 융합의 쉬운 취급을 지원합니다.
여러 보고서 TSA, 히스톤 deacetylase 억제 물와 SCNT 배아의 치료 1% ~ 6.56,7미만에서 라이브 새끼의 생산 효율을 크게 향상 됩니다 나타났습니다. TSA 치료 SCNT 배아8에서 히스톤 부호 수정 통해 프로그래밍을 가속 한다. 최근, 특정 mRNAs, 히스톤 lysine demethylase 인도의 히스톤 H3 lysin 9 (H3K9)을 제거 하는 (KDM4), 4의 주입 SCNT 배아, reprograming-내성 지역에서 특히에 trimethylation의 개발을 증가 표시 되었습니다 복제 마우스 배아9. 한편, 히스톤 한정자 역할도, VC H3K910trimethylation를 감소 했다. 또한, VC 돼지 SCNT10배아 발달을 향상 시킵니다. 그것은 SCNT 배아 dBSA 주입 배아 개발11의 개선에 지도 보고 되었습니다.
우리는 이전 작은 분자의, 즉 TSA 및 VC, dBSA, 함께 조합 SCNT 배아12의 개발을 극적으로 향상 된 것을 발견. 여기, 우리는 매우 효율적이 고 간단한 복제 절차12를 나타내는 마우스, 이전에 보고 된 SCNT 방법 선발. 우리는 또한 HVJ. 처리 설명 이들은이 SCNT 방법을 통해 유전자 변형된 동물 유전 자원 보존 하거나 발달 및 생식 생물학의 분야에서 많은 연구를 도울 수 있었다.
Protocol
모든 동물 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 긴 대학교의 지침을 준수.
1입니다. 배양 기의 준비
- 95 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 0.35 m m KH2포4, 0.2 m m MgSO4 · 구성 된 배아 문화에 대 한 수정된 KSOM (mKSOM) 매체 준비 7 H2O, 1.71 m m CaCl2 · 2 H2O, 0.2 m m D (+)-포도 당, 0.2 m m 나트륨 Pyruvate, 1.0 m L-글루타민, 1.0 g/L Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 m m NaHCO3, 10 mM 나트륨 DL-젖 산, 페니실린, 0.05 g/L 및 0.05 g/L 살 균 물에 스.
- Hepes 버퍼 CZB (HCZB) 매체 81.5 m m NaCl, 4.8 m m KCl, 1.7 mM CaCl2 · 구성 된 배아 조작에 대 한 준비 2 H2O, 1.18 m m MgSO4 · 7 H2O, 1.18 m m KH2포4, 0.11 m m EDTA · 2Na, 36.1 m m 나트륨 DL-젖 산, 5.55 m D m (+)-포도 당, 0.025 g/mL 페니실린, 0.035 g/L 스, 0.014 m m 페 놀 레드, 1.0 g/L 폴 리 비닐 알코올, 5.0 m m NaHCO3및 20.0 mM Hepes 나트륨 소금 살 균 물에.
- Oocyte 활성화에 대 한 정품 인증 매체를 준비: mKSOM 매체와 50 nM TSA, 2mm EGTA, 5 µ g/mL cytochalasin B (CB), 5 mM SrCl2보충.
2. 준비의 이온 소 혈 청 알 부 민 (dBSA)
- 상 온 (12%의 최종 농도)에서 살 균 물 10 mL에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1.2 g을 용 해.
- 부드러운 교 반으로 실내 온도에서 살 균 물에 BSA의 12%를 준비 위의 혼합된 이온 교환 수 지 구슬의 약 0.12 g을 추가 합니다.
- 구슬 파란색-녹색에서 색을 변경 하는 때 금, 복구는 피 펫을 사용 하 여 표면에 뜨는 솔루션. 다음 대체 구슬 신선한 것 들 (그림 1).
참고: 구슬의 교체 일반적으로 한 번만 수행 됩니다. 아마도 완전 이온화를 몇 가지 교체를 필요합니다. 가이드, 구슬의 색상에서 그대로 하는 경우로 골드에 파란 녹색, 그것은 이온 교환이 완료 되 나타냅니다. - 구슬 색상 변경 확인 솔루션을 복구 합니다.
참고: 복구 솔루션 흐린 경우, 원심 (175 x g, 5 분) 필터 막힘을 방지 하기 위해. - 복구 된 보충 10.5% NaHCO3의 250 µ L로 솔루션.
참고:이 프로세스 dBSA 솔루션 중화 pH 조건에 대 한 것입니다. 그러나, NaHCO3 피할 수 있습니다. - 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독 고 dBSA 재고 솔루션으로-20 ° C에서 저장 합니다.
3. oocyte 컬렉션
참고: 모든 마우스 빛 제어 및 에어컨을 갖춘 객실에서 유지 되었다.
- 슈퍼-배 란 각 여성 B6D2F1 마우스 (세 8-10 주) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)의 7.5 IU의 복 주입 및 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h PMSG 주사 후의 7.5 IU.
- 자 궁 경부 전위 14-16 h 여 안락사를 수행 hCG 주사 후. 복 부 생식로 표준 해 부 기법13를 사용 하 여 액세스를 incise합니다 간단히, 피부를 꼬 집 고 작은 측면 절 개는 중간에가 위. 단단히 위에 피부 절 개 아래 고 머리와 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 잘라가 위를 사용 하 여 복 막 하 고 밀어 용기의 코일 방식의 oviducts, 자 궁, 난소의 두 뿔의 존재를 확인 합니다.
- 작은 똑 바른가 위와 핀셋 oviducts extirpate, 표면 떨어져 피를 닦아 필터 종이. 미네랄 오일에는 oviducts를 설정 합니다. 그런 다음 절 개 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 ampulla 잘라 고 적 운 oocyte 단지 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체의 200 µ L 상품에는 수 란 관의 ampulla에서 오는 이동 합니다. 지구 온난화 접시에 5 분 동안 품 어.
주의: 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 10 분 이상 노출 된 oocytes에 대 한 해로운 것입니다. - 적 운 세포 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 일부 남은 적 운 세포 전송 두 번째 meiotic 분열 (MII) 무대 oocytes에는 stereomicroscope에서 적 운 oocyte의 단지에서 해제 됩니다 확인 하십시오. 그런 다음, 아래로 pipetting으로 MII 무대 oocytes 4 번 세척 (의 피 펫을 사용 하 여 < 100 µ m 내부 직경) mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 나머지 적 운 세포 분리에.
참고: 작은 피 펫의 사용 적 운 세포의 분리를 촉진 한다. - 37 ° C에서 5%에서 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA Mll 무대 oocytes를 품 어 enucleation까지 CO2 배양 기.
참고:는 oocyte의 그것 보다 약간 큰 직경을 가진 작은 피 펫 것이 좋습니다.
4. 핵 이식 기증자 세포의 준비
- 단계 3.3-3.5, 후 denuded oocytes 적 운 oocyte 단지에서 격리 됩니다. 나머지 적 운 세포는 stereomicroscope 아래 피 펫을 사용 하 여 HCZB 보통 6 %dBSA 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 적 운 oocyte 단지에서 분산의 소량 (약 2 µ L)를 전송 합니다.
- SCNT에 필요한 때까지 37 ° C에서 지구 온난화에 6 %dBSA HCZB 매체에 적 운 세포를 놓습니다.
참고: 때 fibroblast 세포 (예., murine 태아 섬유 아 세포 세포)는 조직 배양 접시에서 세포를 분리 하 고 펠 릿으로 원심 기증자 세포로 사용. HCZB 매체 6 %dBSA 포함 된 셀의 펠 릿 resuspend
5입니다. Oocytes enucleation
- 0.9 g PVP 10 mL HCZB 매체를 추가 하 여 9 %PVP 매체를 준비, 하룻밤 냉장고 (4 ° C), 및 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독.
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 5 mL에 CB의 5 mg을 추가 하 여 CB 재고 솔루션 (1 mg/mL의 농도)를 준비 합니다. HCZB 매체 (5 µ g/mL의 최종 농도)와 CB 재고 솔루션을 희석 하 고 enucleation 솔루션으로 사용 합니다.
- 흡입 및 멸 균된 피 펫을 통해 좀처럼 5 µ g/mL CB (enucleation 솔루션)를 포함 하는 HCZB 매체의 20 µ L에서 Mll 무대 oocytes를 세척 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에). 5 번 세척 절차를 반복 합니다. Enucleation 프로세스를 시작 하기 전에 enucleation 솔루션에서 지구 온난화에 약 10 분을 기다립니다.
- 그림 2A와 같이 enucleation 챔버를 준비 합니다. Mll oocytes enucleation 챔버 흡입 하 고 길게는 피 펫을 사용 하 여 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); enucleation 솔루션의 4 µ L를 배치 하 고 미네랄 오일 챔버 커버.
참고: 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시의 커버를 사용할 수 있습니다. - 스핀 들 및 현미경 (400 X) 실 온에서 MII 무대 oocyte의 염색체를 식별 합니다. 동양 발음 첫 극 지 몸, Mll 무대 oocyte는 스핀 들 및 염색체의 위치는 3 또는 9 시 micropipette를 들고 피 펫을 사용 하 여 (그림 2B) 위치.
참고: 사용 하는 현미경 총에서 400 배 확대의 렌즈는. 또한, 목표 렌즈 한다 5 배 / 0.12과 40 X / 0.55 이다. Piezo 펄스 모는 피 펫의 zona pellucida의 빠른 드릴링 허용 합니다. 또한, 레이저 시스템 (예, XYClone) 압 전 구동 시스템 대신 zona pellucida 드릴링에 대 한 사용할 수 이기도 합니다. - 3-6, 압 맥 박 강도 설정 하 고 운전 피 펄스 micromanipulation 피 펫 (7-8 µ m 내부 직경 평면 종단 팁)를 사용 하 여 zona pellucida 드릴. Zona pellucida에 구멍을 연 후 완전히 스핀 들 및 세포질 (그림 2C)의 최소한의 금액으로 염색체 enucleate.
참고:이 프로세스 동안 oocytes 경향이 단단히 접시 바닥에 붙이거나 BSA14없이 매체 때문에 플라스틱. 10 분 이내 enucleation 프로세스를 완료 해야 합니다, 그리고 enucleated oocytes 인큐베이터에 반환. 적절 한 수 한 enucleation에서 조작할 수 있습니다 oocytes의 10와 20 사이입니다. Oocytes의 큰 배치 enucleation 절차 반복 됩니다. - 가시광선 (그림 2C, 중간), 아래는 세포질에서 염색체의 부재를 확인 한 다음 0.3% dBSA CB 부족을 포함 하는 mKSOM 매체에 enucleated oocytes를 철저 하 게 세척 합니다. 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터에 접시 소개 셀 퓨전까지 CO2 .
참고: 후 enucleation, ooplasm에서 제거 하는 세포질 포함 스핀 들 및 염색체.
6. 기증자 세포와 Enucleated Oocyte의 융합
-
HVJ-E의 준비
- 동결 건조 된 HVJ-E에 차가운 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션의 260 µ L를 추가 (키트, 참조 테이블의 재료) 및 플라스틱 아래로 완전히 중단 될 때까지.
참고: 동결 건조 된 HVJ-E의 적절 한 금액은 한 병에 준비 하 고 260 µ L HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 키트에 포함 된다. - 5 µ L aliquots HVJ E 솔루션을 준비 하 고 셀 퓨전까지-80 ° C에서 저장.
주의: 그것 이기 때문에 온도 민감한 얼음, HVJ E를 신중 하 게 취급 합니다. 실험, 적절 하 게 압력솥 HVJ 전자 재료 및 컨테이너 바이러스 구성 요소를 완전히 비활성화를 완료 후
- 동결 건조 된 HVJ-E에 차가운 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션의 260 µ L를 추가 (키트, 참조 테이블의 재료) 및 플라스틱 아래로 완전히 중단 될 때까지.
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세포 융합
- 즉시 사용 하기 전에 셀 퓨전 버퍼의 20 µ L로 HVJ 전자 솔루션의 5 µ L를 희석. 장소 사용까지 얼음에 희석된 HVJ E 솔루션.
참고: 셀 퓨전 버퍼 HVJ 전자 키트에 포함 되어 있습니다. - 그림 3A와 같이 셀 퓨전 챔버를 준비 합니다. HCZB 매체는 피 펫을 사용 하 여 셀 퓨전 챔버 enucleated oocytes 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); 각 솔루션의 장소 4 µ L (9% 6%-BSA 기증자 세포, HVJ E 솔루션, HCZB 매체를 포함 하는 HCZB 매체 HCZB 매체에 PVP) 약 1 mL의 미네랄 오일와 챔버 커버.
참고: 적절 한 수 한 셀 퓨전 절차 동안 조작에 대 한 상공 회의소에 전송 되는 enucleated oocytes의 5에서 30입니다. Oocytes의 큰 배치, 셀 퓨전 절차 반복 됩니다. 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시 커버를 사용할 수 있습니다, 사용할 수 있는 경우. - HCZB 매체 400 X magnificationat 실 온에서 현미경 아래에 enucleated oocytes를 놓습니다. 기증자 세포 (6-7 µ m 내부 직경 평면 종단 팁), micromanipulation 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 셀 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션으로 추방.
- 다음에 분리 될 것 동등 하 게 서로 다른 직렬 세포 융합을 활성화 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 적 운 세포 하나 하나 발음. HCZB 중간 지주 피 펫을 사용 하 여 enucleated oocytes를 하십시오. Micromanipulation 피 펫 piezo 펄스 (2-3의 3-6, 속도의 강도)와 zona pellucida 드릴.
- Zona pellucida에 구멍을 연 후 oocyte 멤브레인을 거치지 않고 볼륨 5 번 적 운 세포의 볼륨 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 함께 oocyte 막에 단단히 적 운 세포를 놓습니다.
참고: 적 운 세포에 대 한 6-7 µ m 내부 직경은 평면 종단 팁 micromanipulation 펫의 준비. 펫 부드러운 셀 출시를 유지 하기 위한 9 %PVP 매체를 사용 하 여 정기적으로 세척 되어야 한다. 단계 6.2.3-6.2.5 10 분 안에 완성 해야 합니다 또는 세포 융합의 효율 낮은 것 이다. HVJ-E의 막 융합 활동 압력가 마로 소독, 세제, 또는 70% 에탄올 치료에 의해 비활성화 됩니다. 실험 후 HVJ E 솔루션의 적절 하 게 삭제 수 해야 합니다. - 세포 융합의 조작, 후 즉시 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, oocytes는 전송 고 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터로 이동 1 h의 CO2 .
- 즉시 사용 하기 전에 셀 퓨전 버퍼의 20 µ L로 HVJ 전자 솔루션의 5 µ L를 희석. 장소 사용까지 얼음에 희석된 HVJ E 솔루션.
7. 재건축된 Oocytes 및 Trichostatin A 치료와 비타민 C의 활성화
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TSA의 준비
- 5mm TSA 솔루션 3 µ L aliquots로 분배 하 고-20 ° c.에 솔루션 저장
- DMSO (12.5 µ M의 농도)의 1 mL에 5mm TSA 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 12.5 µ M TSA 재고 솔루션 활성화 매체 mKSOM 매체의 2 ml에서의 8 µ L를 희석 (50의 최종 농도 nM).
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VC의 준비
- 메 마른 내 무료 물 1 mL로 VC의 1 밀리 그램을 추가 하 고-20 ° c.에 저장
- MKSOM 매체 (10 µ g/mL의 최종 농도) VC 재고 솔루션을 추가 합니다.
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재건축된 Oocytes의 활성화
- 셀 퓨전 후 1 시간 조기 염색체 응축 (PCC) 재건축된 oocytes (그림 3B)에서 현미경 (400 X)를 사용 하 여 확인 합니다.
- 정품 인증 매체를 재건축된 oocytes를 전송 (1.3 단계 참조) TSA를 포함 하 고 37 ° C에서 5%에서 6 h에 대 한 품 어 CO2 공기 (그림 3C). SCNT 배아에서 프로-핵의 형성을 관찰 후 2 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA (그림 2C)에 TSA 치료의 더 많은 시간을 적용.
- MKSOM 보통 VC 보충 TSA 치료 배아를 전송 및 그림 3D와 같이 7 h에 대 한 품 어.
- VC 치료의 7 h 후 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, VC 치료 배아를 전송 하 고 37 ° C에서 5%에서 4 일 동안 품 어 공기에 CO2 .
참고: 복제 된 생쥐를 생산, 형태학 상으로 정상적인 2 세포 단계 태아에 전송 oviducts 의사 임신 여성 쥐 (MCH(ICR)) 질 플러그 (pseudopregnancy의 하루 0.5)15를 발견 하는 날에. 19.5 일 후 이식 사이트 및 신생아의 수는 제왕 절 개 후 기록 됩니다.
Representative Results
복제 마우스 배아를 생성 하려면 적 운 세포와 태아 섬유 아 세포 세포는 사용 되었다. 재건축된 oocytes oocyte 활성화 후 2 셀 단계에 개발의 수는 표 1에 표시 됩니다. Pronuclear (89 ~ 100%) 형성과 발전 2 세포 단계 (77 89%)의 아주 높은 속도 모든 조건 하에서 관찰 되었다. 적 운 세포에서 파생 되었고 2 셀 단계에 개발, 복제 된 배아의 일부 의사 임신 여성의 oviducts 전송 했다. 6 복제 된 자손 72 전송된 배아에서 TSA와 VC (그림 4)의 직렬 처리에 의해 세 임신 여성에서 생산 되었다. 복제 된 배아의 약 15%가 SCNT 절차12에 따라 용어를 개발 보고 되었습니다. 또한, 다른 기관에서 2 셀 배아 복제 전송 복제 배아에 단일 TSA 치료 보다 더 나은 개발을 대표 하는 9 ~ 15% 라이브 자손을 달성 했다. 또한, TSA와 VC 치료는 크게 blastocyst 단계에 체 외에서 배아 개발의 효율성을 개선 (표 2, P < 0.05, 스튜던트 t-검정). 이러한 생체 외에서 발달 데이터 TSA와 VC의 긍정적인 효과 마우스 종자도 셀 유형에 의해 제한 하는 방법을 보여 줍니다. 이 결과이 SCNT 메서드 복제 된 배아의 발달 능력을 용이 하 게 것이 좋습니다.
그림 1: dBSA 준비 합니다.
DBSA 솔루션을 준비 하기 위한 단계별 절차 묘사 된다. 이온 교환 범위 구슬의 색깔 변화에 의해 재판 될 수 있습니다. 위 왼쪽된 그림 쇼 BSA의 1.2 g 실내 온도에서 살 균 물 10 mL에 녹입니다. BSA, 해산 후 이온 교환 수 지 구슬 (오른쪽 상단) 추가 됩니다. 이온 교환 수 지 구슬 BSA 솔루션의 혼합물에서 파랑-녹색 색상을 변경 하는 때 골드 (오른쪽 아래), 신선한 것 들으로 구슬 바꿉니다. 왼쪽 아래 그림의 구슬의 색상이 블루-그린, 유지 및 이온 교환 완료 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Enucleation 절차입니다.
(A) enucleation 챔버의 그림. Oocytes enucleation CB와 HCZB 매체에서 수행 됩니다. 압 전 구동 시스템에 대 한 9 %PVP 매체의 자리는 enucleation 위한 유리 피 펫을 준비 하는 데 사용 됩니다. 관광 명소는 미네랄 오일에 포함 됩니다. (B) 다이어그램 및 한 현미경 사진 스핀 들 및 enucleation 전에 염색체의 위치를 표시합니다. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. (C) A 다이어그램 그리고 성공적인 enucleation 보여 현미경 사진. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. 파란색 화살표: zona pellucida에 구멍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 셀 퓨전 절차 및 문화 SCNT 배아의 상태.
(A) 셀 퓨전 챔버의 그림. 셀 퓨전 6 %dBSA 포함 된 HCZB 매체에서 수행 됩니다. 9 %PVP 매체의 자리는 세포 융합에 대 한 유리 피 펫을 준비 하는 데 사용 됩니다. 관광 명소는 미네랄 오일에 포함 됩니다. (B) A 다이어그램 및 조 염색체 응축의 현미경 사진 셀 퓨전 (검은 화살표) 후 1 시간을 형성 했다. (C) A 다이어그램의 pronuclear 구조 현미경 사진 형성 활성화 (검은 화살표) 후 6 시간. (D) 체계 SCNT 배아에 대 한 TSA, VC, 및 dBSA 치료입니다. 녹색 화살표는 TSA, VC (노란색 화살표)를 가진 외피 0.3 %dBSA (파란색 화살표)와 포함 하는 mKSOM 매체에서 뒤 치료를 나타냅니다. 화살표 머리 매체 변경 타이밍을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 복제 된 자손 임신의 19.5 일 후 제왕 절 개 후 그냥 적 운 세포에서 파생.
맨 윗줄에 placentae 있다. 여기에 표시 된 복제 된 자손 핵 이식 실험 3 양 어머니에서 하나 생성 되었다. 태 반 크기는 1.5 ~ 2 배 체 외에서 수정에 의해 생성 한 그들의 크기 보다 큰 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 그룹 | 기증자 셀 형식 | 마우스 스트레인 | 아니요. oocytes 사용의 | 아니요. oocytes의 융합 | 아니요. 조 염색체 응축을 보여주는 oocytes의 | 아니요. oocytes 보여주는 pronuclei 형성 (%)의 | 아니요. pronuclei 형성 oocytes의 개발 2 세포 배아 (%)를 |
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| TSA, VC | 적 운 | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| 치료 | 적 운 | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA, VC | 태아 섬유 아 세포 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| 치료 | 태아 섬유 아 세포 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
표 1:에 TSA 및 VC 치료의 효과 생체 외에서 2-셀 단계에 복제 마우스 배아의 개발.
| 그룹 | 기증자 셀 형식 | 마우스 스트레인 | 롤 사용 하는 2-셀 배아의 | 롤 2 셀 배아의 개발 각 단계 (%) | |||
| 4-셀 | morula | blastocyst | |||||
| TSA, VC | 적 운 | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89)는 | |
| 치료 | 적 운 | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA, VC | 태아 섬유 아 세포 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| 치료 | 태아 섬유 아 세포 | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| a b c d 동일한 기증자 세포 내에서 다른 위 첨자 나타냅니다 중요 한 차이 (P < 0.05) | |||||||
표 2:에 TSA 및 VC 치료의 효과 생체 외에서 blastocyst 단계로 복제 마우스 배아의 개발.
Discussion
결론적으로, 이러한 결과 제시 SCNT 메서드 수 기술적인 어려움을 줄일 수 및 유전 수정 및 mRNA 보충 (표 1, 표 2), 필요 없이 SCNT의 효율성을 증가 하 고 좋습니다 보장 복제 된 배아의 안정적인 생산입니다. 이 방법을 통해 더 나은 생존 율 및 단순화 된 프로토콜 기존의 방법 보다 더 많은 SCNT 배아를 재구성 하 수 있습니다. 이 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 세포 융합 이다. 복제 된 생쥐를 성공적으로 생성 하려면 HVJ-E 프로토콜에 설명 된 적절 한 양의 셀 퓨전 프로세스 동안 유지 되 고 oocytes 단계 6.2.3-6.2.5 동안 인큐베이터 10 분 이내에 반환 하는 데 필요한 생명 이다. 이후 20 ~ 30 기증자 세포 조작 피 펫에서 한 번에 HVJ-E 함께 발음 될 수 있다, 한 작업에서 얻은 oocytes 수는 기존 방법 보다 더 큰. 결국, 우리는 약 20 ~ 30 10 분 이내 다시 생성 된 oocytes를 생성할 수 있습니다. 한 시간 걸릴 한다 oocytes (100 이상)의 큰 배치와 셀 퓨전 절차를 작업 하는 경우에 또는 단계 6.2.3-6.2.5 반복 하 여 더 적은. 여기에 제시 된 기술과 방법 단순화 된 기술 요구 사항을 효율적인 프로토콜 사용할 수 있습니다.
현재, SCNT 배아의 개발 기본 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 이 향상 된 SCNT 메서드는 또한 같은 재활 메커니즘 공부 하는이 방법은 하나의 실험에 많은 복제 배아를 생산할 수 있기 때문에 기여. 이 방법은 세포 융합에 대 한 손상 세포 막과 체세포를 사용. 따라서,와 같은 꼬리 팁16세포, sertoli 세포17, 미 발달 줄기 (ES) 세포18다른 셀에이 접근을 적용 하 수 있습니다. 꼬리 끝 셀, 등 비교적 큰 세포를 주입에 대 한 기존의 SCNT 방법을 사용 하는 경우 직접 oocyte 세포질에 그것은 된다도 라이브 배아를 더 기술적으로 까다로운. 또한, 상대적으로 하드 세포, sertoli 세포 등는 pipetting 주입 하 여 어렵다입니다. 이러한 다양 한 셀 형식으로 간주 됩니다 때 HVJ-E를 이용 하 여 세포 융합 방법 간단 하 고 효과적입니다. 비록 HVJ-E의 안전과 가치 설득 시연된19,20왔다, 다시 농업 또는 생물 의학 목적을 위한 복제 동물 생산 HVJ-E를 사용 하 여의 타당성을 고려 하는 중요 한 수 있습니다.
또한, 최근 한 그룹은 성공적으로 복제 된 쥐 소변 세포21에서 파생 된 생산. 구조 포유류 멸종, 이제부터 SCNT 소변 셀 등 비-침략 적 방식으로 수집 된 셀을 사용 하 여 있을 것 이다 이상적인. 더 최근에, 다른 그룹은 직접 생성 된 항 원 특정 CD4를 사용 하 여 복제 마우스+ T22세포. 그것은이 방법은 효율적으로 쥐 같은 세포에서 복제에 적용 됩니다 경우 검사 흥미로울 것입니다. 또한, Latrunculin A enucleation SCNT oocytes23parthenogenetic 활성화 동안 말라 중 합 억제에 대 한 더 나은 대안으로 보고 되었습니다. 미래 연구는 Latrunculin A 치료 cytochalasin B, 대신 복제 된 자손의 세대를 더 향상 되는지 여부 공개 수 있습니다. 또한, TSA 치료는 성공적으로 사용 되었습니다 쥐, 돼지24및 토끼25 치료 시간, 기간, 및 농도 변경 하 여. 또한, VC 돼지 SCNT10, 배아 개발 향상 뿐만 아니라 또한 인간 및 쥐26iPS 셀 생산을 향상 시킵니다. 따라서, 그것은 다른 포유류 종에 TSA 및 VC 치료를 적용할 수 있습니다 그리고 우리가 각 종족에 대 한 TSA와 VC의 처리 시간을 최적화 할 수 있습니다 추측 하 듯.
결론적으로,이 방법은 간단한 절차와 효율성의 실용적인 수준으로 복제 된 쥐 생성 가능 하 게 것 이다. 따라서,이 연구의 결과 우리 SCNT 기술을 사용 하는 희귀 동물의 유전 자원 보존 및 핵 프로그래밍 및 초기 배아 발달의 분자 메커니즘을 이해를 발생할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 기본 과학 연구 프로젝트 (K.M.에 150810) K.M. 스미 토모 재단 보조금에 의해 지원 되었다. 긴 대학 연구 그랜트 (15-나-2 K.M.과 석사). 지 암 연구 영국 (C6946/A24843) 및 Wellcome 트러스트 (203144/Z/16/Z)에 의해 제공 하는 핵심 지원을 인정 합니다. 우리 양 북 아 일 Backes-카 미 무라와 씨 제이 Horvat 증거 독서에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
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