Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/57040

Summary

نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.

Abstract

توفر الثقافات العضوية المعوية فرصة فريدة للتحقيق في الخلايا الجذعية المعوية وبيولوجيا السرداب في المختبر، على الرغم من أن النهج الفعالة للتعامل مع التعبير الجيني في الأعضاء قد حققت تقدما محدودا في هذا المجال. في حين أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم الدقيق للخلايا لتوليد الأعضاء، فإن هذه الاستراتيجية تتطلب اختيارًا وفرزًا واسعًا من خلال تحليل التسلسل، وهو أمر يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفًا على حد سواء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لنقل الفيروسية كفاءة من الأعضاء المعوية. هذا النهج سريع وعالي الكفاءة، وبالتالي تقليل الوقت والنفقات المتأصلة في تكنولوجيا CRISPR/Cas9. كما نقدم بروتوكولا لتوليد أقسام مجمدة من الثقافات العضوية سليمة لمزيد من التحليل مع تلطيخ المناعية الكيميائية أو الفلورسنت المناعية، والتي يمكن استخدامها لتأكيد التعبير الجيني أو إسكات. بعد أن يتم تحقيق انتقال ناجح من النواقل الفيروسية للتعبير الجيني أو إسكات، يمكن تقييم الخلايا الجذعية المعوية ووظيفة سرداب بسرعة. على الرغم من أن معظم الدراسات العضوية تستخدم في الاختبارات المختبرية، يمكن أيضا أن يتم تسليم الأعضاء إلى الفئران للتحليلات الوظيفية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن نُهجنا مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية للأدوية لأن العلاجات المتاحة حاليا تعمل عموما عن طريق تعديل التعبير الجيني أو وظيفة البروتين بدلا من تغيير الجينوم.

Introduction

القدرة على ثقافة الماوس أو خلايا سرداب الإنسان كما ثلاثي الأبعاد (3D) الأعضاء من الأمعاء الدقيقة أو القولون على مدى فترات زمنية طويلة قدمت اختراقا كبيرا لأن هذه الثقافات عرض ملامح تعريف ظهارة الأمعاء في الجسم الحي 1 , 2 , 3. العضوية المستمدة من سرداب الأولية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي، وتظهر وظائف الخلوية مماثلة لأنسجة المنشأ الخاصة بهم. في الواقع، فإن الأعضاء تُخزّن ليس فقط التنظيم الهيكلي للأقبية في الجسم الحي، ولكن أيضاً العديد من السمات الجزيئية، وبالتالي توفير أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا الطبيعية وحالات المرض. لتوضيح ذلك، كشفت الدراسات العضوية مسارات جزيئية جديدة تشارك في تجديد الأنسجة فضلا عن الأدوية التي يمكن أن تعزز وظيفة في الإعدادات المرضية6،7.

دراسة الخلايا الجذعية المعوية ذات أهمية خاصة لأن بطانة الأمعاء هي من بين أنسجة الثدييات الأكثر تجديدا للغاية، وتجديد نفسها كل 3-5 أيام لحماية الكائن الحي من البكتيريا والسموم، وغيرها من مسببات الأمراض داخل اللومن المعوية. الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) هي المسؤولة عن هذه القدرة التجديدية الرائعة وبالتالي توفير نموذج فريد لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية الكبار1،2. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب في الفئران أن الخلايا الجذعية الإيجابية Lgr5 المعزولة يمكن أن يتم زرعها لتوليد أجهزة عضوية ثلاثية الدائية أو "أحشاء صغيرة" في المختبر حيث تعكس عن كثب نظيراتها في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستمد الثقافات العضوية من عزل خلايا سرداب الأمعاء تتألف من الذرية، ISCs، وخلايا بانيث، وهذا الأخير التي تشكل الخلايا المتخصصة الظهارية في الجسم الحي. في الواقع، تطورت الثقافة العضوية من خلايا سرداب الأمعاء الأولية إلى تقنية روتينية نسبيا التي من السهل تنفيذها في معظم المختبرات باستخدام الكواشف المتاحة على نطاق واسع. هذا النموذج هو أيضا قابلة للتحليل الكمي للتعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) والبروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي، والكيمياء المناعية، أو تلطيخ الفلورسنت المناعي2،4،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة علم الوراثة الوظيفية باستخدام كسب الوظيفة (التعبير المفرط للجين أو التعبير عن جين متحول المنشط) أو فقدان الوظيفة (إسكات الجينات أو التعبير عن متحولة فقدان الوظيفة) النهج2.

والأهم من ذلك، أن انخفاض الكفاءة والسمية العالية للحمض النووي البلازمي القياسي أو بروتوكولات الانكل الفيروسي مع البوليبرين لا تزال تشكل عقبة رئيسية في هذا المجال. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم بدقة، فإن هذا النهج يتطلب اختيارًا يستغرق وقتاً طويلاً متبوعًا بالتحقق من صحة التسلسل9. هنا، نقدم بروتوكول تحويل الفيروسية للأعضاء المعوية الأولية التي يحسن تسليم الجسيمات الفيروسية عن طريق الاقتران إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية وتطبيق حقل مغناطيسي. وترد التعديلات الرئيسية على البروتوكولات السابقة4و5و10و11و12 و13 وتوصيات لتعزيز الكفاءة. كما نقوم بوصف نهج لتوليد أقسام مجمدة من الأعضاء السليمة المستزرعة في matrigel 3D (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو مصفوفة) لمزيد من التحليل مع الكيمياء المناعية أو تلطيخ الفلورسنت المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات الطبية جونز هوبكنز (IACUC). يتم تعديل هذا البروتوكول من أساليب نشرتمسبقا10و11و12و13.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد 293T الطازجة المتوسطة عدة ساعات مقدما ودافئة إلى 37 درجة مئوية فيحمام مائي لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الاستخدام (الجدول 1).
  2. إعداد الحمضالنووي بلازميد 2،13،14 للتغليف الفيروسي. (الجدول2).
  3. الحصول على جميعالمواد الأخرى المطلوبة (جدول المواد).

2. لينتيفيروس أو إنتاج الجسيمات الرجعية

  1. الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T زرع الخلايا (اليوم الأول)
    1. إعداد طبق ثقافة واحد 150 مم عن طريق الطلاء مع 50 ميكروغرام / مل بولي-د-يسين المذاب في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS؛ 10 مل / طبق) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. إزالة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)/ بولي د-يسين وغسل الطبق المطلي مرتين مع 5 مل PBS.
    3. خلايا البذور 293T (8\u201210 x 106)في 293T المتوسطة (الجدول1)إلى حجم إجمالي قدره 15 مل.
    4. ثقافة 293T الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنةزراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
  2. HEK 293T خلية التغوط (اليوم 2)
    1. إجراء التغوط بمجرد أن تصل الخلايا 70-80٪ التقاء (عادة حوالي 24 ساعة بعد البذر 8\u201210 × 106 الخلايا).
    2. إعداد خليط التغوط باستخدام نهج فعال مثل تركيبة اللبوسوم الموجبة التجارية (الجداول1\u20122، جدولالمواد)2.
      1. يخفف الحمض النووي لينتيفيروس 12 (مجموع ~ 24 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي، الجدول 2)في 1.2 مل من التغوط المتوسطة والحضانة لمدة 5 دقائق في RT في أنابيب 1.5 مل (جدول المواد).
      2. تخفيف transfection ريجنت (36 درجة مئوية) في 1.2مل من التغوط المتوسطة (جدول المواد) وحضانة في أنابيب 5 مل لمدة 5 دقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. إضافة كاشف فيروس lenti (الخطوة 2.2.2.1) إلى كاشف التغوط (الخطوة 2.2.2.2) وخلط بلطف عن طريق الأنابيب بطيئة صعودا وهبوطا باستخدام pipet 5 مل.
      4. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT.
    3. غسل بلطف خلايا 293T مع 5 مل من التغوط المتوسطة واستبدال مع 10 مل من المتوسطة transfection.
    4. إضافة مجمعات الدهون الحمض النووي (من الخطوة 2.2.2.3) قطرة إلى وسط الخلايا 293T وخلط بعناية وسائل الإعلام في أطباق الثقافة عن طريق التحرك في الاتجاهات الأفقية والرأسية لضمان التوزيع المتساوي للمجمعات الدهون الحمض النووي في كل طبق.
    5. حضانة لمدة 6 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية(37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    6. بعد الحضانة، استبدال وسائل الإعلام مع 20 مل فيروسجديد جمع المتوسطة (الجدول 1).
  3. مجموعة الفيروسات (الأيام 3\u20125)
    1. جمع وسائل الإعلام الفيروس في أنابيب 50 مل، وتخزينها في ثلاجة 4 درجة مئوية لمزيد من التركيز.
    2. استبدال 20 مل من فيروس جديد جمع المتوسطة كل 24 ساعة والثقافة بين عشية وضحاها (~ 24 ساعة). كرر جمع الوسائط خلال اليومين التاليين (أيام 4\u20125).
    3. تأكد من أن الحجم الإجمالي للمتوسط الذي تم جمعه بعد اليوم 5 هو ~ 60 مل (20 مل / يوم × 3 أيام).
  4. تركيز الفيروس (اليوم 5)
    1. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها (60 مل) لمدة 5 دقائق في 400 × ز. ثم، تمرير supernatant من خلال مرشح (0.45 ميكرومتر المسام) لإزالة أي الحطام الخلوي.
  5. تركيز الفيروس عن طريق إضافة 15 مل من وسائل الإعلام الفيروس تصفيتها في وحدة تصفية الطرد المركزي (جدول المواد). الطرد المركزي في 2500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. لأن الفيروس لا يمكن أن تمر من خلال هذا التصفية، سيتم تتركز في الغرفة العليا من عامل التصفية.
    1. يستنشق التدفق من خلال من الأنبوب (الغرفة السفلى) وإضافة آخر 15 مل من وسائل الإعلام جمع الفيروسية المتبقية supernatant إلى نفس وحدة تصفية الطرد المركزي. الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه (2500 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية) لتركيز فيروس إضافي من supernatant.
    2. كرر العملية باستخدام نفس الفلتر لوسائط 60 مل من لوحة واحدة مستحثة حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب (~ 100 أضعاف).
      ملاحظة: نحن عادة ما تركز ~ 60 مل من وسائل الإعلام جمع الفيروس إلى ~ 600 درجة مئوية.
    3. إزالة الفيروس المركز من الغرفة العليا للمرشح باستخدام أنبوب 1 مل، ثم aliquot وتخزينها في أنابيب 1.5 مل (50\u201260 μL/tube) في -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. تخزين الجسيمات المركزة لمدة تصل إلى 6\u201212 أشهر.

3. عزل سرداب

  1. قتل الفئران باستخدام CO2 وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC المحلية.
  2. وضع الحيوان القتل الرحيم على ظهره وغسل البطن عن طريق الرش مع الإيثانول 70٪.
  3. إجراء شق خط الوسط الطولي من القص إلى الفخذ، وتقطيع الجلد أولا، ومن ثم الأنسجة تحت الجلد.
  4. إزالة الأمعاء الدقيقة من المعدة إلى cecum.
  5. تحديد المناطق ذات الاهتمام داخل الأمعاء الدقيقة؛ يمكن عزل سرداب من الاثني عشر، جيجونوم واللفائفي.
  6. باستخدام حقنة 10 مل، امسح الأمعاء الدقيقة المعزولة مع حاجز انفصال سرداب (PBS المبردة مسبقا ً التي تحتوي على 1 مليون ديثيوثريتول (DTT)، 1٪ بنسلين/ ستريتوبيسين (لا Ca2+ وMg2+)) في طبق زراعة الأنسجة 10 سم (جدول 1)
  7. إزالة الأنسجة الدهنية الطرفية، وفتح أو "فيليه" الأنسجة المعوية طوليا على لوحة زجاجية معقمة (15 سم × 15 سم).
  8. كشط بلطف قبالة الزغب الظهاري المعوي باستخدام مكشطة الخلية.
  9. قطع الأمعاء الدقيقة إلى 2\u20123 سم طول الحكمة المقاطع.
  10. نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على PBS المبردة مسبقا باستخدام ملقط مسطحة (116 ملم). غسل شظايا الأنسجة عن طريق هز بقوة باليد ل ~ 30 ق (تحريك الأنبوب في اتجاهات معاكسة ~ 60 مرات).
  11. قم بتحديث PBS وكرر الغسيل حتى يصبح PBS واضحًا.
    ملاحظة: عادة ما نغسل الشظايا 2\u20123 مرات.
  12. احتضان الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت فك التشفير (الجدول1) لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية على شاكر المداري ة بسرعة متوسطة بمجرد أن يكون PBS واضحا.
  13. هز بقوة الأنبوب باليد ل ~ 30 ق (الاتجاهات المعاكسة 60 مرات) ونقل الأنسجة باستخدام ملقط مسطحة إلى أنبوب مخروطي آخر 15 مل تحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت انفصال سرداب. احتضان هذا الكسر على الجليد. لا تستخدم الكسر الأول للثقافة العضوية لأنه يحتوي على الزغب في المقام الأول.
  14. كرر الخطوات 3.11\u20123.13 لـ 3\u20124 مرات، وجمع كل كسر ووضعها على الجليد.
  15. حدد الكسر الذي يتم إثراؤه بأعلى نسبة مئوية من سرداب الأمعاء عن طريق مسح عينات 200 ميكرولتر من كل كسر تحت المجهر المقلوب (4x). تحديد الأقبية من قبل مورفولوجيا نموذجية كما هو موضح سابقا (الشكل1A)10.
    ملاحظة: وسوف تظهر مستديرة أو بيضاوية في الشكل وتحتوي على خلايا بانيث الحبيبية. وعلى النقيض من ذلك، فإن الزغب هياكل تشبه الأصابع تفتقر إلى خلايا البانيث الحبيبية (الشكل1B).
  16. تمرير الكسر المحدد من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على سرداب من حجم مماثل إذا لزم الأمر. بدلا من ذلك، عزل Lgr5 + الخلايا الجذعية على أساس تدفق الخلايا للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) إذا تم عبور الفئران على خلفية EGFP-Lgr5 + أو نموذج آخر مناسب التي تمكن من تحديد الخلايا Lgr5 +2.
  17. حساب العدد الإجمالي للأقبية في الكسر المحدد كما يلي.
    1. ماصة 50 درجة مئوية من الكسر المحدد في مقياس الهيموكيتومتر وحساب عدد من سرداب باستخدام المجهر الضوئي المقلوب (4X). ضع حوالي 100 سرداب لكل بئر عند استخدام لوحة من 48 بئرًا للسماح بتجارب التحويل التي سيتم فيها نقل 3\u20126 من الآبار لكل حالة تجريبية لإسكات الجينات أو التعبير المفرط.
    2. استناداً إلى عدد الأقبية لكل 50 ميكرولتر، احسب حجم المخزن المؤقت للانفصال عن القبو اللازم ونقل هذا الحجم إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم حساب 10 سرداب لكل 50 ميكرولتر، 6 × 50 ميكرولتر أو 300 ميكرولتر لـ 300 سرداب.
  18. طرد مركزي سرداب في أنابيب 1.5 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  19. تجاهل بعناية supernatant عن طريق الأنابيب بلطف قبالة الطبقة السائلة العليا وإعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من عامل النمو خفض مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد (جدولالمواد).
  20. قم بزرع الأقبية المحتوية على المصفوفة في لوحة 48 بئرًا مُسخنة مسبقًا بـ 37 درجة مئوية (30 درجة مئوية/بئر، أي حوالي 100 سرداب/بئر). احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة 5\u201215 دقيقة للسماح لهلام مصفوفة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  21. تراكب كل هلام مع 250 درجة مئوية ثقافةالجهاز (ENR) المتوسطة (الجدول 1) ووضع لوحات 48 جيدا مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). تحقق من الثقافات لتنظيم سرداب في الأشكال الصغيرة، جولة، الكيسي بعد 24 ساعة. سوف تشكل براعم بعد 2\u20125 أيام.
  22. استبدال وسائل الإعلام ENR بلطف كل 3 أيام. إزالة وسائل الإعلام ENR القديمة مع شفط لطيف، مع الحرص على عدم لمس المصفوفة عند استبدال وسائل الإعلام.
  23. مرور الثقافات العضوية كل 4\u20127 أيام كما سبق وصفها11.

4. إعداد جزء العضوية

  1. الأعضاء المنقولة بمجرد تشكيلها (في غضون 1\u20122 أسابيع) أو بعد مرورها. لتجربة نقل واحدة، إعداد 2\u20123 الآبار من الأعضاء المستزرعة في لوحة 48 جيدا لكل حالة مع ~ 100\u2012200 organoids/well أو ~ 200\u2012600 organoids لكل حالة تحويل تجريبية.
  2. تبادل ENR مع 250 μLوسائل الإعلام transduction (الجدول 1) والثقافة في وسائل الإعلام transduction لمدة 3 أيام أو أكثر أو حتى الأعضاء اعتماد مورفولوجيا الكيسي. تضمين كل من Wnt3a ومثبطات ROCK (Y27632) في وسيط التحويل لزيادة عدد الخلايا الجذعية والبانيث. نيكوتيناميد (Nic) يحسن كفاءة الثقافة (انظر المتوسطة transduction في الجدول 1).
  3. تمزق ميكانيكيا هيكل مصفوفة غشاء الطابق السفلي مثل قبة مع وسائل الإعلام وطرف pipet باستخدام أنبوب 1 مل.
  4. نقل الأعضاء ووسائل الإعلام إلى أنبوب معقمة 1.5 مل.
  5. ميكانيكيا تعطيل المصفوفة كذلك عن طريق الأنابيب مع 200 ميكرولتر pipet ~ 10\u201215 مرات.
  6. طرد مركزي شظايا الجهاز ية في RT في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  7. تخلص من الـ supernatant بعناية باستخدام ماصة وتعليق بيليه في 1مل DMEM/F12 المتوسطة (الجدول 1).
  8. إضافة ديسباسي الأول (6 ميكرولتر في 10 ملغ / مل) وDNase الأول (2.5 ميكرولتر في 10 ملغ / مل). يُمزج جيداً عن طريق الأنابيب برفق باستخدام أنبوب 1 مل.
  9. حضانة الأعضاء في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في أنبوب 1.5 مل.
  10. إضافة 500 درجة مئوية من وسائل الإعلام ENR لإنهاء رد فعل التفكك؛ المصل في ENR ينهي رد الفعل.
  11. تمرير الخلايا العضوية من خلال مصفاة خلية 20 ميكرومتر والطرد المركزي شظايا الجهاز في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  12. إعادة تعليق الشظايا العضوية مع 150ميكرولتر المنقولة المتوسطة (الجدول 1).

5. الهندسة الوراثية للأورغانويدات أو خلايا سرداب عن طريق الترانسدوكشن الفيروسي

ملاحظة: انظر الشكل 2.

  1. مجموعات الخلايا العضوية البذور مع 200 درجة مئوية transduction المتوسطة / جيدا في لوحة 48 جيدا وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). بدلا من ذلك، وضع خلايا سرداب معزولة حديثا (~ 1000 سرداب) في 200 μL transduction المتوسطة / جيدا في لوحة 48 جيدا وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  2. ذوبان قارورة من الفيروس للانتراب مما يسمح ل ~ 50 ميكرولتر من الفيروس المركز لنقل كل بئر في لوحات 48 جيدا أو ~ 100 ميكرولتر من الفيروس المركز لكل بئر في لوحات 24 جيدا.
  3. فيروس احتضان مع 12 ميكرولتر من محلول الجسيمات النانوية المغناطيسية لمدة 15 دقيقة في RT في أنبوب 1.5 مل (الجدول3).
  4. إضافة محلول الجسيمات النانوية المغناطيسية / خليط الفيروس إلى الخلايا التي سيتم نقلها.
  5. وضع لوحة ثقافة الخلية على لوحة مغناطيسية وحضانة لمدة 2 ساعة على الأقل (وتصل إلى ~ 6 ح)في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).

6. بذر شظايا الأعضاء المصابة

  1. نقل مجموعات الخلايا العضوية المصابة ووسائل نقل الوسائط من كل بئر إلى أنبوب 1.5 مل.
  2. الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  3. تخلص من الـ supernatant مع شفط لطيف وتبريد الأنبوب الذي يحتوي على بيليه على الجليد لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة 120 درجة مئوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا.
  5. البذور 30 ميكروغرام قطرات من خليط مصفوفة الخلية في لوحة جديدة 48 جيدا.
  6. قم باحتضان اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5\u201215 دقيقة حتى تترسخ المصفوفة.
  7. إضافة وسيط ة تحويل إلى كل بئر وحضانة في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة 3\u20124 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  8. بعد 3\u20124 أيام، فحص الثقافات تحت المجهر الخفيف (10X) لضمان تنظيم مجموعات الخلايا في هياكل الجهازية. ثم، استبدال بلطف وسائل الإعلام transduction مع 250 μL ENR المتوسطة.
  9. استبدال الوسائط كل 3\u20124 أيام.

7- الاختيار (إن وجد)

  1. بعد 2\u20123 أيام، إضافة المضادات الحيوية ذات الصلة أو الهرمونات للاختيار إلى وسيط ة التحويل إذا كان ذلك مناسباً.
    ملاحظة: استخدمنا البورومسين (2 ميكروغرام / مل) لاختيار الترانسدوكشن lentivrial لأن بلازميدات يأوي الجينات المقاومة البورومسين2،14.

8. تأكيد الترانسدوكتيون الناجحة والتعبير الجيني أو الإسكات

  1. إذا كان استخدام FUGW lentivirus14،تقدير كفاءة transduction عن طريق قياس إشارات GFP عن طريق المجهر الفلورسنت أو تدفق قياس السيتومترية.
  2. التحقق من صحة الإفراط في التعبير الجيني أو إسكات باستخدام الكمية عكس النسخ polymerase تفاعل سلسلة (RT-PCR) للمقارنة الكمية من mRNA في الثقافات العضوية التحكم والتجريبية.
  3. تأكيد مستويات البروتين للتعبير الجيني الترميز البروتين أو إسكات من قبل لطخة الغربية أو تلطيخ المناعة2.

9. استئصال التبريد العضوي في الطابق السفلي غشاء مصفوفة

ملاحظة: انظر الشكل 3.

  1. إزالة ENR المتوسطة عن طريق شفط لطيف، والحرص على عدم تعكير مصفوفة غشاء الطابق السفلي وغسل بلطف مرة واحدة مع 500 درجة مئوية من PBS.
  2. إصلاح organoids مع 1.0 مل من 4٪ بارافورمالهايد(PFA) الحل (جدول المواد) في RT لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة PFA عن طريق الشفط، وغسل بلطف مرتين مع 1 مل PBS.
  4. إزالة PBS عن طريق شفط وإضافة 1.0 مل من 30٪ السكروز العازلة إلى كل عينة. حضانة الأعضاء الثابتة في السكروز لمدة ساعة واحدة في 4 درجة مئوية في غرفة باردة، ثلاجة، أو على الجليد لتجفيف العينات.
  5. إزالة العازلة السكروز عن طريق شفطوإضافة ما يكفي من مجمع تضمين (جدول المواد) لتغطية طبقة المصفوفة (~ 300 درجة مئوية / جيدا) في كل بئر.
  6. حضانة في RT لمدة 5 دقائق.
  7. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أو حتى يتحول مجمع التضمين إلى صلب وأبيض.
  8. ضع الطبق مع مركب التضمين المجمدة في RT للسماح لذوبان الحد الأدنى من المجمع على طول الحواف. استخدام مشرط لفصل كتلة من جدران البئر.
  9. إزالة كتلة مركب مصفوفة التضمين باستخدام ملقط ووضعها في كتلة عينة (على سبيل المثال cryomold)، والعمل بسرعة لمنع ذوبان.
  10. ملء القالب تماما مع مجمع تضمين وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. استخدام كتلة هو للتقسيم أو التخزين في -80 درجة مئوية الفريزر لمزيد من الاستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، ونحن نصف تقنية نقل سريعة وعالية الكفاءة التي تسخر الجسيمات النانوية المغناطيسية المعرضة لحقل مغناطيسي لتسليم فيروس لينتي إلى الخلايا ذات الأهمية. مع الأدوات المتاحة بسهولة، قمنا بتطبيق هذا النهج ليس فقط لنقل خلايا سرداب معزولة حديثا (الشكل 1A)،ولكن أيضا للأجهزة (الشكل2)وغيرها من الخلايا التي هي الحرارية إلى نهج نقل أكثر روتينية. يمكن بسهولة تترافق الجسيمات اللنتيفية مع الجسيمات النانوية المغناطيسية ويتم تسليم المجمعات التي ينتج عنها فيروس الجسيمات النانوية بكفاءة عن طريق تطبيق حقل مغناطيسي باستخدام لوحة مغناطيسية. ولتحسين هذا النهج، اختبرنا أولاً ناقلات الفيروسات اللينة المرتبطة بـ GFP بحيث يمكن استخدام GFP لتحديد الخلايا المستحثة مع الفحص المجهري الفلوري. يمكن تصور GFP في كل مرحلة من مراحل تطوير الجهازية، بما في ذلك في وقت مبكر عندما تنظم خلايا سرداب في هياكل تشبه الكيس (الشكل4A)،أو في وقت لاحق نقاط عندما تشكل البراعم العضوية (الشكل 4B). يمكن أن تخضع الأعضاء المعوية المستحثة بنجاح بعد ذلك لتحليل وظيفي للتعديلات في التنمية عن طريق تلطيخ أغشية الخلايا والنوى لتعداد إجمالي عدد الخلايا بالإضافة إلى علامات النسب، مثل lysozyme لتحديد خلايا بانيث ( الشكل 4جيم).

ويمكن استخدام الأعضاء المعدلة وراثيا لمزيد من التحليل عن طريق توليد أقساممجمدة على النحو المبين هنا (الشكل 3). بعد تضمين الأعضاء، يمكن تخزين الكتل المجمدة وقسمها في وقت لاحق للدراسات المستقبلية. هذا النهج هو أيضا فعالة (يقدر أن يكون ~ 95٪ على أساس النسبة المئوية من GFP (+) الأعضاء إلى مجموع الأعضاء). ويمكن تنفيذ هذا النهج مع الكواشف المختبرية القياسية، وبالتالي توفير الأنسجة التي هي قابلة للتحقيقات المتنوعة،بما في ذلك رقم الخلية، ومصير الخلية، ووجود ومستويات بروتينات محددة 2. على سبيل المثال، استخدمنا أقسام المجمدة وتلطيخ الفلورسنت المناعي لتحديد الخلايا الفردية والتأكد من نوع الخلية (الشكل4C).

Figure 1
الشكل 1: سرداب معزولة وvilli مع الرسوم التي تظهر مورفولوجيا نموذجية. (أ) شكل سرداب معزول ة هياكل مستديرة أو بيضاوية. (ب) يتم تعريف فيلي كهياكل تشبه الأصابع. شريط مقياس = 50 درجة.

Figure 2
الشكل 2: مخطط للانتقال الفيروسي للأوعية باستخدام جسيمات نانوية مغناطيسية والتعرض لحقل مغناطيسي. يتم عرض الخطوات الأكثر أهمية من بروتوكول التحويل. (أ) فيروس الحضانة وحل الجسيمات النانوية المغناطيسية لمدة 15 دقيقة في RT في أنبوب 1.5 مل. (ب) إضافة الجسيمات النانوية المغناطيسية / خليط الفيروس إلى الخلايا ليتم نقلها. (C) وضع لوحة ثقافة الخلية على لوحة مغناطيسية وحضانة لمدة 2 ح في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية. ويمكن أيضا أن تستخدم أوقات الحضانة أطول (~ 6 ح)؛ يظهر بشكل جيد ممثل هنا على لوحة مغناطيسية. (د) يتم عرض خلية يتم نقلها مع الفيروس والجسيمات النانوية المغناطيسية. (هـ)نقل مجموعات الخلايا العضوية المصابة ووسائط التحويل من كل بئر إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق. 120 درجة مئوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا. (G) قطرات البذور من 30 ميكرولتر تحتوي على خليط مصفوفة الخلية في كل بئر في لوحة جديدة 48 جيدا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط للتقسيم المجمد ة من الأعضاء في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. يتم عرض الخطوات الأكثر أهمية من بروتوكول التيكون المجمدة. (أ) يتم تصوير بئر واحد داخل لوحة ثقافة الخلية 24-well. (B) إضافة ما يكفي من مجمع تضمين لتغطية طبقة المصفوفة (~ 300 درجة مئوية / جيدا) وحضانة في RT لمدة 5 دقائق (C) وضع عينات في -80 C في الفريزر لمدة 10 دقائق أو حتى يتحول مجمع التضمين الصلبة والبيضاء. بعد ذلك، ضع الطبق في RT للسماح لذوبان طفيف على طول حواف العينة. (D) استخدام مشرط لفصل كتلة من جدران البئر. (E) إزالة كتلة مركب مصفوفة التضمين باستخدام ملقط ووضعها في حاوية ضحلة مناسبة أو العفن لتجميد الأنسجة. ملء القالب تماما مع مجمع التضمين (OCT). (F) تجميد كتلة في -80 C في الفريزر لمدة 30 دقيقة (G) كتلة جاهزة للتقسيم أو التخزين في -80 C الفريزر لمزيد من الاستخدام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الصور التمثيلية للأعضاء المعوية المستحثة. (أ) صورة تمثيلية للأعضاء المعوية الصغيرة تحت المجهر الخفيف تظهر المجهر الفلوري (الأيسر)، و(يمين) الفحص المجهري القياسي للتعبير عبر الجينات (EGFP) في اليوم 3 بعد التحويل. شريط مقياس = 50 درجة مئوية (B) مثال على التعبير المفرط لترميز الجينات GFP في الجهاز بعد التحويل باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية. تم نقل الخلايا العضوية مع فيروس لينتي التعبير عن GFP (FUGW; أعلى) أو فيروس لينتي الإفراط في التعبير Hmga1 (FUGW-Hmga1; أسفل) كما هو مبين في اليوم 12 بعد التحويل. شريط مقياس = 50درجة مئوية (C) التصوير المناعي للقسم المجمدة ثابتة من الأعضاء. كانت المقاطع العضوية (4 ميكرومتر) ملطخة بمضادات الليسوزيم (الأحمر) والمضادة للـ EpCAM (الأخضر) وDAPI (الأزرق). EpCAM يحدد حدود الخلية، وأشار DAPI النوى الفردية، وبقع lysozyme خلايا بانيث. شريط مقياس = 50 درجة.

[أرغويد] ثقافة وسط ([إنر]) 100 مل
DMEM/F12+ 96 مل
L-ألانل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد الملحق (على سبيل المثال الجلوتاماكس) 1 مل
NEA 1 مل
القلم / العقدية 1 مل
HEPES 1 مل
EGF (100 ميكروغرام / مل) 5 ميكرولتر
نوجين (100 ميكروغرام/ مل) 10 ميكرولتر
R-سبوندين (100 ميكروغرام / مل) 10 ميكرولتر
أو [ر-سبوندين] شرط متوسّطة ([كم]) 20 مل
الأنسولين المؤتلف البشري (10 ملغ / مل) 5 ميكرولتر
[ترندوسشن] متوسّطة 5 مل
ENR المتوسطة 2.4 مل
[ونت] شرط متوسّطة ([كم]) 2.5 مل
نيكوتيناميد (1M) 100 ميكرو لتر
Y27632 (10 درجة مئوية) 10 ميكرولتر
المخزن المؤقت للانفصال عن الأقبية 100 مل
PBS (بدون Ca2+, Mg2+) 99 مل
القلم / العقدية 1 مل
0.5 مليون درهم EDTA 100 ميكرو لتر
0.1 [م] [دتّ] ([ديثيوثريتول]) 100 ميكرو لتر
293T متوسطة 100 مل
فى الانمازـم 90 مل
FBS 10 مل
فيروس جمع المتوسطة 100 مل
فى الانمازـم 99 مل
FBS 1 مل
المخزن المؤقت للهضم العضوي 1 مل
DMEM/F12+ 1 مل
ديسباسي 1 (10 ملغ / مل) 6 ميكرولتر
دنسي 1 (10 ملغ / مل) 2.5 ميكرولتر

الجدول 1: الوسائط المستخدمة في البروتوكول.

لوحات 10 سم 15 سم
ناقل ناقل فيروس لينتي 6 ميكروغرام 9 ميكروغرام
CMVΔR8.91 8 ميكروغرام 12 ميكروغرام
Md. ز 2 ميكروغرام 3 ميكروغرام
مجموع المتجهات ≤ 16 ميكروغرام ≤ 24 ميكروغرام

الجدول 2: كمية الحمض النووي البلازميد للتغوط.

لوحه الخرز المغناطيسي (ميكرولتر) حجم الفيروس (μL) حجم التحويل النهائي (ميكرول)
48-حسنا 6 50 250
24-حسنا 12 100 500

الجدول 3: حجم محلول الخرزة المغناطيسية وناقلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الثقافة الأولية للظهارة المعوية الكبار كما organoids يوفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في وظيفة الخلايا الجذعية، التوازن الظهاري المعوي، وعلم الأمراض1،2،3، 4. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 يمكن استخدامها لهندسة الأعضاء وراثيا9، فهي محدودة بالحاجة إلى فحص واختيار واسع النطاق على أساس تحليل التسلسل للتغيرات الوراثية المطلوبة. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير تعليمات واضحة وموجزة مع دروس تستند إلى الفيديو لتسليم الجسيمات النانوية المغناطيسية من الفيروسات اللينة أو الرجعية إلى الأعضاء المعوية، تليها الأقسام المجمدة لمزيد من التحليل.

هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة وفعالة لهندسة وراثيا الأعضاء المعوية وتحليل عواقب الإفراط في التعبير الجيني أو إسكات من الأقسام المجمدة. وترد الخطوات الحاسمة في الشكل 2، الشكل 3. تسمح هذه الاستراتيجية للتحقيق في الأهمية البيولوجية للتغييرات الوراثية (الإفراط في التعبير أو إسكات) في الخلايا الجذعية المعوية وذريتها المستزرعة في ظل ظروف 3D2،13. لقد استخدمنا أيضا هذا التسليم المغناطيسي القائم على الجسيمات النانوية من ناقلات الفيروسية لتعزيز نقل الخلايا والتعبير عبر الجينات في المختبر في الخلايا الأولية المختلفة2،13.

مع هذا النهج، يتم تغطية الجسيمات الفيروسية مع الجسيمات النانوية المغناطيسية وتسليمها إلى الخلايا عن طريق التعرض لحقل مغناطيسي. بالمقارنة مع أساليب التحويل الحالية، مثل polybrene مع أو بدون التسريب10،15، المجمعات المغناطيسية نانوجسيمات فيروسية هي أقل سمية للخلايا لأن الاستفادة من المواد الوراثية يتم بوساطة بطانة الرحم و بينوسيتو، وهما عمليتان بيولوجيتان تحدثان بشكل طبيعي ولا تسببان ضرراً كبيراً لأغشية الخلايا. وهكذا، يتم تعزيز كل من صلاحية الخلية وكفاءة التحويل. ويمكن زيادة كفاءة التحويل باستخدام شظايا سرداب صغيرة أو خلايا واحدة (انظر الخطوة 4.8) بدلا ً من سرداب أكبر أو أجهزة عضوية كاملة كما ورد سابقاً2و10و13و16. يؤدي تسليم الجسيمات النانوية الموجهة مغناطيسياً إلى التراكم السريع، والاختراق، والانتشار، والانتشار للناقلات الفيروسية إلى الخلايا المستهدفة13. الجسيمات النانوية المغناطيسية مصنوعة من أكسيد الحديد، الذي هو قابل للتحلل البيولوجي بالكامل والمغلفة مع جزيئات محددة الملكية الموجبة. ويتحقق ارتباط الجسيمات النانوية مع النواقل الفيروسية عن طريق التجميع الغروي الناجم عن الملح والتفاعلات الكهروستاتيكية. ثم تتركز الجسيمات النانوية على الخلايا بواسطة حقل مغناطيسي خارجي يتم إنشاؤه بواسطة اللوحة المغناطيسية الموضوعة تحت طبق الثقافة. في حين أن كفاءة التحويل تقترب 95٪، لا يتم نقل جميع الخلايا، وهو قيد على هذه التقنية. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم تغيير الجينات التي يتم التعبير عنها من قبل داخلي كما هو الحال مع نهج CRISPR/Cas9.

بعد الإفراط في التعبير الجيني أو إسكاته، يمكن استخدام الأعضاء لعدد لا يحصى من الدراسات، اعتمادا على الأهداف العلمية، بما في ذلك تحليل التعبير الجيني، والتغيرات البروتيومية داخل الخلايا أو تفرزها الخلايا، والتعديلات الأيضية، و التغيرات المورفولوجية. كما هو الحال مع الأنسجة الحية، يمكن الحصول على أقسام مجمدة لدراسات الفلورة المناعية والمناعية لبروتينات محددة مثل عوامل النسخ، والجزيئات السيتوبلازمية، أو علامات سطح الخلية. مقالنا يتضمن نهجا فعالا للحصول على أقسام المجمدة من organoids دون إزعاج موقفهم وتنظيمها في ثقافة 3D. وهذا مفيد لأن التقنيات السابقة تتطلب إزالة الجهازية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي قبل تجميد16. معالجة الأعضاء عن طريق إزالة من المصفوفة يمكن أن تعطل التنظيم الهيكلي للأوعية بدلا من أن تعكس النمو في المختبر والتنمية.

ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لهندسة وراثيا الأعضاء المعوية لدراسة النماذج الأخرى القائمة على الخلايا والأنظمة العضوية. على سبيل المثال، يمكن أن يتم نقل نظم البنكرياس والقولون والكبد والقلب والجهاز الدماغي مع هذا النهج. حتى الخلايا التي تنمو تحت تقنيات الثقافة أكثر القياسية قابلة لتكنولوجيا الجسيمات النانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج لدراسة الآليات الجزيئية للأمراض، ليس فقط في سياق النظم العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية، ولكن أيضا في الأعضاء السرطانية.

وباختصار، فإن التعديلات الرئيسية الموصوفة في هذه البروتوكولات لدراسات الأعضاء المعوية نأمل أن تمكن العلماء من توضيح دور العوامل الهامة ومسارات المصب المشاركة في بيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية وذريتها . وينبغي أن توفر هذه النهج الوسائل لمعرفة المزيد عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التجديد الذاتي، وتحديد مصير الخلية، وتوازن الأنسجة، وتجديد الظهارية المعوية، في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للصحة (R01DK102943، R03CA182679، R03CA191621)، وصندوق ميريلاند لبحوث الخلايا الجذعية (2015-MSCRFE-1759، 2017-MSCRFD-3934)، وجمعية الرئة الأمريكية، وشبكة أليغيني الصحية - جونز صندوق هوبكنز للبحوث ومركز هوبكنز للبحوث الأساسية للبحوث الهضمية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092 Base medium for 293T cells
DMEM/F12+ Thermo Fisher Scientific 12634010 Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum Corning 35-011-CV Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific 15140122 Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+) Thermo Fisher Scientific 10010049 A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA Thermo Fisher Scientific 11140050 Component of organoid culture medium
GlutamaxII Thermo Fisher Scientific 35050061 Component of organoid culture medium
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Component of organoid culture medium
EGF Millipore Sigma E9644 Component of organoid culture medium
Noggin Peprotech 250-38 B Component of organoid culture medium
R-spondin R&D 7150-RS-025/CF Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin Millipore Sigma I9278-5ml Component of organoid culture medium
Nicotinamide Millipore Sigma N3376-100G Component of Transduction medium
Wnt3A R&D 5036-WN-010 Component of Transduction medium
Y27632 Millipore Sigma Y0503-1MG Component of Transduction medium
0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher Scientific R0861 Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I Millipore Sigma D4818-2MG Component of organoid digestion buffer
DNase I Millipore Sigma 11284932001 Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced) Corning 356231 Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L Oz Biosiences RL40200 Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate Oz Biosiences MF10000 Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine Millipore Sigma A-003-E Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution Boster AR1068 Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound Thermo Fisher Scientific 4583S For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes Corning 352054
50 mL Falcon Tubes Sarstedt 62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker Boekel Scientific 260250
Olympus Inverted microscop CK30 Olympus CK30 for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence Nikon Axiovert 200 for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane Milipore Sigma UFC910024 For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) pluriSelect SKU 43-50020 For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 352340 For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) Millipore Sigma M8937-100EA ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J Jackson Lab #000664 For organoid culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).

Tags

هذا الشهر في JoVE العدد 147 لينتيفيروس ماوس معوية أجهزة مغناطيسية جسيمات نانوية فيروس رجعي
الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xian, L., Chia, L., Georgess, D.,More

Xian, L., Chia, L., Georgess, D., Luo, L., Shuai, S., Ewald, A. J., Resar, L. M. S. Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning. J. Vis. Exp. (147), e57040, doi:10.3791/57040 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter