Summary
우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.
Abstract
장 내 오르가노이드 배양은 시험관내에서 장 줄기 세포를 조사하고 생물학을 토굴할 수 있는 독특한 기회를 제공하지만, 오르가노이드의 유전자 발현을 조작하는 효율적인 접근법은 이 분야에서 제한된 진전을 이루었습니다. CRISPR/Cas9 기술은 오르가노이드 생성을 위한 세포의 정확한 게놈 편집을 허용하는 동안, 이 전략은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 서열 분석에 의하여 광범위한 선택 및 검열을 요구합니다. 여기에서, 우리는 장 오르가노이드의 능률적인 바이러스성 전송을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근 방식은 빠르고 매우 효율적이므로 CRISPR/Cas9 기술에 내재된 시간과 비용을 줄입니다. 우리는 또한 유전자 발현 또는 침묵을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 면역 조직화학또는 면역형광 염색을 가진 추가 분석을 위한 본래 오르가노이드 문화에서 동결된 단면도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자 발현 또는 침묵에 대한 바이러스 벡터의 성공적인 환전이 달성된 후, 장 줄기 세포 및 토굴 기능을 빠르게 평가할 수 있다. 대부분의 오르가노이드 연구는 시험관 내 분석을 사용하지만, 오르가노이드는 생체 내 기능 분석을 위해 마우스에 전달될 수 있습니다. 더욱이, 우리의 접근은 현재 유효한 치료가 일반적으로 게놈을 바꾸기 보다는 오히려 유전자 발현 또는 단백질 기능을 변조해서 작동하기 때문에 약에 치료 반응을 예측하기 위한 유리합니다.
Introduction
장기간에 걸쳐 소장이나 결장에서 3차원 (3D) 오르가노이드로 마우스 또는 인간 토굴 세포를 배양하는 능력은 이러한 문화가 생체 내에서 장 상피의 특징을 정의하기 때문에 중요한 돌파구를 제공했습니다. 1개 , 2개 , 3. 기본 토굴에서 파생 된 오르가노이드는 자기 갱신 및 자기 조직능력이 뛰어나며, 기원조직과 유사한 세포 기능을 나타낸다. 실제로, 오르가노이드는 생체 내 토굴의 구조적 조직뿐만 아니라 많은 분자 특징을 재구성하여 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 설명하기 위하여, organoid 연구 결과는 조직 재생에관련시킨 새로운 분자 통로를 밝혔습니다 1, 2,3,4,5 뿐만 아니라 기능을 강화할 수 있는 약 병리학 설정6,7.
장 내 벽 줄기 세포의 연구는 장 내 의 박테리아, 독소 및 기타 병원체로부터 유기체를 보호하기 위해 3-5 일마다 자신을 갱신하는 가장 높은 재생 포유류 조직 중 하나이기 때문에 특히 관심이 있습니다. 장 루멘. 장 줄기 세포 (ISCs)는이 놀라운 재생 능력에 대한 책임이 있으며, 따라서 성인 줄기 세포기능을 공부하기위한 독특한 패러다임을 제공 1,2. 마우스의 계보 추적 실험은 분리된 Lgr5 양성 줄기 세포가 생체 내 대조물과 밀접하게 미러링되는 체외에서 3D 오르가노이드 또는 '미니 장'을 생성하기 위해 배양될 수 있음을 입증했습니다. 오르가노이드 배양은 또한 전구, ISCs 및 판세포로 구성된 장내 토굴 세포 분리체로부터 유래될 수 있으며, 그 중 후자는 생체 내 상피 틈새 세포를 구성한다. 사실, 1 차 적인 창 자 crypt 세포에서 organoid 문화는 널리 이용 가능한 시약을 사용 하 여 대부분의 실험실에서 구현 하기 쉬운 상대적으로 일상적인 기술로 진화 했다. 이 모델은 또한 질량 분석, 면역성 화학, 또는 면역 형광 염색 2,4,8에의한 RNA-Seq(RNA-Seq) 및 단백질에 의한 유전자 발현의 정량적 분석을 수행할 수 있다. 또한, 기능성 유전학은 기능의 이득(유전자 과발현 또는 활성화 돌연변이 유전자의 발현) 또는 기능 상실(유전자 침묵 또는 기능 상실 돌연변이의 발현)을사용하여 연구될 수 있다 2.
중요한 것은, 폴리브레인을 가진 표준 플라스미드 DNA 또는 바이러스성 감전 프로토콜의 낮은 효율 및 높은 독성은 필드에 있는 중요한 장애물 남아 있습니다. CRISPR/Cas9 기술은 정확한 게놈 편집을 허용하지만, 이 접근법은 시퀀스 유효성 검사9뒤에 시간이 많이 걸리는 선택이 필요합니다. 여기에서, 우리는 자기 나노 입자에 공고하고 자기장의 응용에 의해 바이러스 입자의 전달을 최적화하는 1 차장 오르가노이드를 위한 바이러스성 전달 프로토콜을 제시합니다. 이전 프로토콜 4,5,10,11,12,13 및 효율성을 향상시키기 위한 권장 사항에 대한 주요 수정사항이 제공됩니다. 우리는 또한 면역 조직 화학 또는 면역 형광 염색을 가진 추가 분석을 위해 3D matrigel (이제부터 지하 막 매트릭스 또는 매트릭스로 지칭)에서 배양된 손상되지 않은 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성하는 접근 법을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 존스 홉킨스 의료 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 방법10,11,12,13에서수정됩니다.
1. 시약의 준비
- 신선한 293T 배지를 몇 시간 전에 준비하고 사용 하기 전에 적어도 10 분동안 수조에서 37 °C로 따뜻하게 준비하십시오 (표 1).
- 바이러스 성 포장을 위한 플라스미드 DNA2,13,14를 준비한다. (표2).
- 기타 필요한 모든 재료(재료표)를획득합니다.
2. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 입자 생산
- 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 시종 (1일차)
- 실온(RT)에서 1시간 동안 인산완충 식염수(PBS; 10 mL/접시)에 용해된 50 μg/mL 폴리-D-리신을 코팅하여 150mm 배양 접시 를 준비합니다.
- 인산완식염수(PBS)/폴리-D-리신을 제거하고 코팅된 접시를 5 mL PBS로 두 번 세척합니다.
- 종자 293T 셀(8\u201210x 10 6)에서 293T 배지(표 1)에서 총 부피 15 mL.
- 배양 293T 세포는 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 하룻밤 동안.
- HEK 293T 세포 형질감염 (2일차)
- 세포가 70-80 % 합류에 도달하면 형질 감염을 수행하십시오 (일반적으로 8 \u201210 x 106 세포를 시드 한 후 약 24 시간).
- 상업적인 양이온 리포솜 제형(표1\u20122,재료표)과 같은 효율적인 접근법을 사용하여 형질전환 혼합물을 제조한다2.
- 렌티바이러스 DNA는 12개(총 ~24 μg 플라스미드 DNA, 표2)를 형질전환 배지의 1.2 mL에 생성하고 RT에서 5분 동안 배양하여 1.5 mL 튜브(물자 표)를 생성한다.
- 1.2 mL의 형질전환 섭정(36 μL)을 트랜스펙션 배지(재료 표)에 희석하고 제조업체의 지침에 따라 5mL 튜브로 배양합니다.
- 렌티바이러스 시약(2.2.2.1단계)을 형질감염 시약(단계 2.2.2.2)에 넣고 5 mL 파이펫을 사용하여 천천히 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
- RT에서 20 분 동안 혼합물을 배양합니다.
- 293T 세포를 5 mL의 형질전환 배지로 부드럽게 세척하고 10 mL의 형질전환 매체로 교체하십시오.
- DNA 지질 복합체(단계 2.2.2.3)를 293T 세포의 배지에 떨어뜨리고 각 접시에 DNA 지질 복합체의 균등한 분포를 보장하기 위해 수평 및 수직 방향으로 이동하여 배양 접시의 매체를 조심스럽게 혼합합니다.
- 표준 조직 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 배양(37°C, 5% CO2).
- 배양 후, 배지를 20 mL 의 신선한바이러스 수집 매체로 교체한다(표 1).
- 바이러스 수집(일 3\u20125)
- 50 mL 튜브에 바이러스 매체를 수집하고, 추가 농도를 위해 4°C 냉장고에 보관하십시오.
- 신선한 바이러스 수집 매체의 20 mL를 24 시간마다 교체하고 밤새 배양 (~ 24 h). 다음 2일 동안 미디어 컬렉션을 반복합니다(일 4\u20125).
- 5일 이후 수집된 배지의 총 부피가 ~ 60 mL(20 mL/day x 3일)인지 확인합니다.
- 바이러스 농도 (5일차)
- 수집된 매체(60 mL)를 400 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 상급자를 필터(0.45 μm 기공)를 통과하여 세포 이물질을 제거한다.
- 원심 필터 유닛에 여과된 바이러스 매체 15 mL을 추가하여 바이러스를 집중시켰다(재료 표). 2,500 x g에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기. 바이러스는이 필터를 통과 할 수 없기 때문에, 그것은 필터의 상부 챔버에 집중될 것이다.
- 튜브(bottom chamber)로부터 유동을 흡기하고 동일한 원심 필터 유닛에 잔류 바이러스 수집 매체상수의 또 다른 15 mL을 추가한다. 위와 같이 원심분리기(4°C에서 15분 동안 2,500 x g)를 초상으로부터 추가의 바이러스를 농축한다.
- 원하는 농도에 도달할 때까지 단일 트랜스듀싱 플레이트에서 60 mL 용지에 대해 동일한 필터를 사용하여 과정을 반복합니다(~100배).
참고: 우리는 일반적으로 ~600 μL에 바이러스 수집 매체의 ~60 mL농축. - 1 mL 파이펫을 사용하여 필터의 상부 챔버에서 농축 된 바이러스를 제거한 다음 나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 1.5 mL 튜브 (50\u201260 μL / 튜브)에 aliquot 및 보관하십시오. 농축 입자를 최대 6\u201212개월 동안 저장합니다.
3. 토굴 격리
- 현지 IACUC 지침에 따라 CO2를 사용하여 마우스를 안락사시한다.
- 안락사 된 동물을 등에 놓고 70 % 에탄올로 살포하여 복부를 씻으하십시오.
- 흉골에서 사타구니까지 세로 중간선 절개를 수행하고 먼저 피부를 절개한 다음 피하 조직을 절개합니다.
- 장에서 장내를 제거하십시오.
- 소장 내에서 관심 영역을 식별; 지하실은 십이지장, 제주넘 및 ileum에서 분리될 수 있습니다.
- 10 mL 주사기를 사용하여, 10cm 조직 배양 접시에 토굴 해리 완충액 (1 mM dithiothreitol (DTT),1% 페니실린 /연쇄상 구균 (No Ca2+ 및 Mg2 +)를 포함하는 미리 냉각 된 PBS)로 분리 된 소장을 플러시 (표) 1)
- 말초 지방 조직을 제거하고 멸균 유리 판 (15cm x 15cm)에 장 조직을 세로로 열거나 "모깎기"하십시오.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 장 상피 융모를 부드럽게 긁어 냅니다.
- 소장을 2\u20123 cm 길이로 자릅니다.
- 편평한 집게(116 mm)를 사용하여 미리 냉각된 PBS를 함유하는 15 mL 튜브로 조직을 옮니다. ~30s (반대 방향으로 튜브를 이동 ~60 시간)에 대 한 손으로 힘차게 흔들어 조직 조각을 씻어.
- PBS를 새로 고치고 PBS가 명확해질 때까지 다시 씻습니다.
참고: 일반적으로 조각 2\u20123 번 세척합니다. - 10 mL의 토굴 해리 완충제(표 1)를 함유하는 15 mL 원엽 튜브에서 조직을 중간 속도로 궤도 셰이커상에서 4°C에서 10분 동안 배양한다.
- 튜브를 ~30s (반대 방향 에서 60 번 반대 방향)로 힘차게 흔들고 평평한 집게를 사용하여 10 mL의 토굴 해리 버퍼를 포함하는 다른 15 mL 원추형 튜브로 조직을 옮니다. 얼음에 이 분수를 배양하십시오. 그것은 주로 융모를 포함하기 때문에 오르가노이드 문화에 대한 첫 번째 분획을 사용하지 마십시오.
- 3.11\u20123.13단계를 3\u20124번 반복하여 각 분수를 수집하고 얼음 위에 놓습니다.
- 반전된 현미경(4x)에서 각 분획에서 200 μL 샘플을 스캔하여 장 내 토굴의 가장 높은 비율로 농축된 분획을 선택합니다. 앞서 설명한 바와 같이 전형적인 형태에 의한 토굴을 식별한다 (그림1A)10.
참고: 그(것)들은 모양에 있는 둥근 타원형 표시하고 과립된 창 세포를 포함할 것입니다. 대조적으로, 융모는 과립판 세포가 결여된손가락형 구조이다(도 1B). - 필요한 경우 유사한 크기의 토굴을 얻기 위해 40 μm 셀 스트레이너를 통해 선택한 분획을 전달합니다. 대안적으로, 마우스가 EGFP-Lgr5+ 배경 또는 Lgr5+ 세포의 식별을 가능하게 하는 다른 적합한 모델에 교차되는 경우 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한유세포측정을 기반으로 Lgr5+ 줄기 세포를 분리한다 2.
- 선택한 분수의 총 토굴 수를 다음과 같이 계산합니다.
- 선택된 분획의 피펫 50 μL을 혈세포계로 넣고 반전된 광 현미경(4x)을 사용하여 토굴의 수를 계산한다. 48웰 플레이트를 사용할 때 3\u20126 웰이 유전자 침묵 또는 과발현을 위해 실험 조건당 변환되는 트랜스덕트 실험을 허용하기 위해 웰당 ~100개의 토굴을 배치한다.
- 50 μL당 토굴 수를 기준으로 필요한 토굴 해리 버퍼의 부피를 계산하고 해당 볼륨을 1.5mL 튜브로 전송합니다.
참고: 예를 들어, 50 μL당 10개의 토굴이 계산되고, 300개의 토굴에 6 x 50 μL 또는 300 μL이 필요합니다.
- 1.5 mL 튜브의 토굴을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 상층을 조심스럽게 버피팅하여 상류층을 제거하고 100 μL의 성장 인자에 펠렛을 다시 일시 중단시켜얼음에 지하 막 매트릭스를 감소시켰다(재료 표).
- 매트릭스 함유 토굴을 37°C 미리 데운 48웰 플레이트(30 μL/well, ~100 토굴/웰)로 시드한다. 매트릭스 겔화를 허용하기 위해 5\u201215 분 동안 표준 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를배양 (37 °C, 5 % CO2).
- 각 겔을 250 μL 오르가노이드 배양(ENR) 배지(표 1)로 중첩시키고 48웰 플레이트를 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 다시 놓습니다. 24 시간 후 작은, 둥근, 낭포 모양으로 토굴 조직에 대한 문화를 확인; 싹은 2 \u20125 일 후에 형성됩니다.
- 3일마다 ENR 미디어를 부드럽게 교체하십시오. 부드러운 흡입으로 오래된 ENR 용지를 제거하고 미디어를 교체할 때 매트릭스를 만지지 않도록 주의하십시오.
- 통로 오르가노이드 배양은 앞서 설명한 바와 같이 4\u20127 일마다11.
4. 오르가노이드 조각 준비
- 일단 형성되면 (1\u20122 주 이내) 또는 통과 된 후에 오르가노이드를 변환합니다. 단일 트랜스덕션 실험의 경우, 실험적 트랜스덕션 조건당 ~100\u2012200 오르가노이드/웰 또는 ~200\u2012600 오르간을 가진 조건당 48웰 플레이트에 배양된 오르가노이드 2\u20123 웰을 준비합니다.
- ENR을 250 μL 형질전환배지(표 1)로 교환하고 3일 이상 또는 오르노이드가 낭포성 형태를 채택할 때까지 형질전환 배지에서 배양한다. Wnt3a 및 ROCK 억제제(Y27632)를 형질전환 배지에 모두 포함하여 줄기 및 파네스 세포의 수를 증가시키고; 니코틴아미드(Nic)는 배양 효율을 향상시킨다(표 1의 형질전환 배지 참조).
- 1mL 파이펫을 사용하여 매질과 파이펫 팁으로 돔과 같은 지하 멤브레인 매트릭스 구조를 기계적으로 파열시킵니다.
- 오르가노이드와 매더를 멸균 된 1.5 mL 튜브로 옮김.
- 기계적으로 200 μL 파이펫 ~ 10 \u201215 번 파이펫팅하여 매트릭스를 더 방해합니다.
- 500 x g에서 500 x g에서 5 분 동안 오르가노이드 조각을 원심 분리합니다.
- 피펫을 사용하여 상급자를 조심스럽게 버리고 펠릿을 1 mL DMEM/F12배지(표 1)에 다시 놓습니다.
- 디스파제 I(10 mg/mL에서 6 μL)과 DNase I(10 mg/mL에서 2.5 μL)을 추가합니다. 1 mL 파이펫을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞습니다.
- 1.5 mL 튜브에서 20 분 동안 37 °C에서 오르가노이드를 배양합니다.
- ENR 매체의 500 μL을 첨가하여 해리 반응을 종료하는; ENR의 혈청은 반응을 종료합니다.
- 20 μm 세포 스트레이너를 통해 오르가노이드 세포를 통과시키고 5 분 동안 400 x g에서 오르가노이드 단편을 원심 분리합니다.
- 150 μL 형질전환 배지로 오르가노이드단편을 재중단한다(표 1).
5. 바이러스 성 전적에 의한 오르가노이드 또는 토굴 세포의 유전 공학
참고: 그림2를 참조하십시오.
- 종자 오르가노이드 세포 클러스터를 200 μL 형질전환 배지/웰을 48웰 플레이트에 및 표준 조직 배양 인큐베이터에서 배양한다(37°C, 5% CO2). 대안적으로, 신선하게 단리된 토굴 세포(~1,000개의 토굴)를 200 μL 트랜스덕션 배지/웰에 48웰 플레이트에 놓고 표준 조직 배양인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 배양한다.
- 48웰 플레이트에서 각 웰의 트랜스덕션을 위한 농축 바이러스의 ~50 μL을 허용하는 트랜스덕션용 바이러스의 해동 또는 24웰 플레이트에서 웰당 농축 바이러스의 ~100 μL.
- 1.5 mL 튜브에서 RT에서 15 분 동안 12 μL의 자기나노 입자 용액으로 바이러스를 인큐베이트 (표 3).
- 변환할 셀에 자기 나노입자 용액/바이러스 혼합물을 추가합니다.
- 세포 배양판을 자기 판 상에 놓고 표준 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 적어도 2시간(및 최대 ~6시간)동안 배양한다.
6. 감염된 오르가노이드 조각의 시딩
- 감염된 오르가노이드 세포 클러스터 및 형질전환 매체를 각각의 우물에서 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달한다.
- 500 x g의 원심분리기5분.
- 부드러운 흡입으로 상류물질을 버리고 얼음에 펠릿이 들어있는 튜브를 5 분 동안 식힙니다.
- 지하 멤브레인 매트릭스 120 μL을 추가하고 천천히 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 매트릭스 세포 혼합물의 종자 30 μL 방울을 새로운 48 웰 플레이트내로 하였다.
- 매트릭스가 고화될 때까지 플레이트를 5\u201215 분 동안 37 °C에서 배양합니다.
- 각 웰에 트랜스덕션 배지를 첨가하고 3\u20124 일 동안 표준 조직 배양 인큐베이터에서배양 (37 °C, 5 % CO2).
- 3\u20124 일 후에, 유기체 구조물로 세포 클러스터의 조직을 확인하기 위하여 가벼운 현미경 (10x)의 밑에 배양을 검사하십시오. 그런 다음 250 μL ENR 배지로 감전 매체를 부드럽게 교체하십시오.
- 3\u20124일마다 미디어를 교체합니다.
7. 선택(해당되는 경우)
- 2\u20123 일 후, 적절한 경우, 변환 매체에 선택을위한 관련 항생제 또는 호르몬을 추가합니다.
참고: 플라스미드는 퓨로마이신 내성 유전자2,14를품고 있기 때문에 렌티브리얼 트랜스덕션의 선택을 위해 퓨로마이신(2 μg/mL)을 사용하였다.
8. 성공적인 전이 및 유전자 발현 또는 침묵의 확인
- FUGW 렌티바이러스2,14를사용하는 경우 형광 현미경 또는 유세포 분석을 통해 GFP 신호를 측정하여 감전 효율을 추정합니다.
- 대조군 및 실험적인 오르가노이드 배양에서 mRNA의 정량적 비교를 위해 정량적 역사체 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 유전자 과발현 또는 침묵을 검증한다.
- 웨스턴 블롯 또는 면역 염색 2에 의한 단백질 코딩 유전자발현 또는 침묵에 대한 단백질 수준을 확인한다.
9. 지하 막 매트릭스의 오르노이드 냉동 절
참고: 그림3을 참조하십시오.
- 지하 멤브레인 매트릭스를 교란하지 않도록 조심하고 500 μL의 PBS로 한 번 부드럽게 씻지 않도록 부드럽게 흡입하여 ENR 배지를 제거하십시오.
- 1.0 mL의 파라포름알데히드(PFA) 용액(재료 표)으로 오가노이드를 RT에서 30분 동안 고정합니다.
- 흡입하여 PFA를 제거하고 1 mL PBS로 두 번 부드럽게 씻으십시오.
- 흡입으로 PBS를 제거하고 각 샘플에 30 % 자당 완충액 1.0 mL을 추가하십시오. 냉장실, 냉장고, 또는 얼음에서 4°C에서 1시간 동안 자당에 고정 된 오르가노이드를 배양하여 샘플을 탈수합니다.
- 흡입에 의해 자당 완충을 제거하고 각 우물에 매트릭스 층 (~ 300 μL / well)을 덮을 만큼 충분한 임베딩 화합물(재료표)을 추가하십시오.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 샘플을 -80°C 냉동고에 10분 동안 보관하거나, 임베딩 화합물이 고체와 흰색으로 변할 때까지 놓습니다.
- 가장자리를 따라 화합물의 용융을 최소화할 수 있도록 RT에 냉동 임베딩 화합물이 있는 접시를 놓습니다. 메스를 사용하여 블록을 우물 의 벽에서 분리하십시오.
- 집게를 사용하여 매트릭스 임베딩 화합물 블록을 제거하고 용융을 방지하기 위해 신속하게 작업하는 시편 블록 (예 : cryomold)에 배치하십시오.
- 몰드를 임베딩 화합물로 완전히 채우고 -80 °C에서 30 분 동안 얼어 붙습니다.
- 블록은 추가 사용을 위해 -80°C 냉동고에서 단면화 또는 보관용이다.
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Representative Results
여기에서는 자기장에 노출된 자기 나노 입자를 활용하여 관심 있는 세포에 렌티바이러스를 전달하는 신속하고 고효율의 트랜스덕션 기술을 설명합니다. 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 갓 단리 된 토굴 세포 (그림1A)를변환할뿐만 아니라, 오르가노이드 (그림2)및 더 일상적인 형질전환 접근법에 불응성 다른 세포를 변환하기 위해이 방법을 적용했습니다. 렌티바이러스 입자는 자기 나노입자에 쉽게 공액화될 수 있으며, 생성된 바이러스-나노입자 복합체는 자기판을 사용하여 자기장을 적용함으로써 효율적으로 전달된다. 이 접근을 낙하하기 위하여는, 우리는 GFP가 형광 현미경 검사법으로 형질전환한 세포를 확인하기 위하여 이용될 수 있었다 는 것을 GFP에 연결된 lentiviral 벡터를 처음으로 시험했습니다. GFP는 유기체 발달의 각 단계에서, 토굴 세포가 낭종 과 같은 구조로 구성 될 때 (그림4A)또는 오르가노이드가 싹을 형성 할 때 나중에 시점에서 (그림4B)를포함하여, 유기체 발달의 각 단계에서 시각화 될 수있다. 성공적으로 변환 된 장 오르가노이드는 세포막과 핵을 염색하여 세포막과 핵을 염색하여 세포세포를 식별하기 위해 리소자임과 같은 계보 마커와 같은 총 세포 수를 열거하여 개발 중 변경을 위한 기능 분석을 거칠 수 있습니다. 그림4C).
유전자 조작 된 오르가노이드는 여기에 설명 된 대로 냉동 섹션을생성하여 추가 분석을 위해 사용될 수있다 (그림 3). 오르가노이드를 내장 한 후, 냉동 블록을 저장하고 나중에 연구를 위해 절편 할 수 있습니다. 이 접근법은 또한 효율적입니다 (총 오르가노이드에 GFP (+) 오르가노이드의 백분율에 근거하여 ~ 95%로 추정됩니다.). 이러한 접근법은 표준 실험실 시약으로 수행될 수 있으며, 따라서 세포 수, 세포 운명, 및 특정 단백질의존재 및 수준을 포함하는 다양한 조사에 상응하는 조직을 제공한다 2. 예를 들어, 우리는 개별 세포를 확인하고 세포 유형을 확인하기 위해 냉동 섹션 및면역 형광 염색을 사용했습니다 (그림 4C).
그림 1: 전형적인 형태를 보여주는 만화와 고립 된 지하실과 융모. (A) 격리된 토굴은 원형 또는 타원형 구조를 형성합니다. (B) 빌리는 손가락과 같은 구조로 식별된다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자기 나노 입자를 사용하여 자기장의 바이러스 성 환전 및 자기장에 대한 노출의 회로도. 트랜스덕션 프로토콜의 가장 중요한 단계가 표시됩니다. (a) 1.5 mL 튜브에서 RT에서 15분 동안 바이러스 및 자기 나노입자 용액을 인큐베이트한다. (B) 변환할 세포에 자기 나노 입자 /바이러스 혼합물을 추가합니다. (C) 세포 배양판을 마그네틱 플레이트 상에 놓고 표준 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양한다. 더 긴 배양 시간도 사용할 수 있습니다 (~6 h); 대표 웰은 자기 판에 여기에 표시됩니다. (D) 바이러스 및 자기 나노입자로 트랜스되는 세포가 도시된다. (E) 감염된 오르가노이드 세포 클러스터와 트랜스덕트 매를 각각 1.5 mL 튜브와 원심분리기를 5분간 500 x g로 옮기고, 부드러운 흡입으로 상구를 버리고 얼음 에 펠릿을 함유한 튜브를 5분간 냉각시.(F) 추가 120 μL의 지하 멤브레인 매트릭스를 천천히 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 놓습니다. (G) 매트릭스 세포 혼합물을 함유하는 30 μL의 종자 방울을 새로운 48웰 플레이트에서 각각의 웰내로 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 3D 매트릭스에서 오르가노이드의 냉동 단면화의 회로도. 고정 된 절편 프로토콜의 가장 중요 한 단계가 표시 됩니다. (A) 24웰 세포 배양 플레이트 내의 단일 웰이 도시되어 있다. (B) 매트릭스 층(~300 μL/well)을 커버하기에 충분한 임베딩 화합물을 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. (C) 샘플을 냉동실에 -80C로 10분 동안 또는 임베딩 화합물이 단단하고 흰색으로 변할 때까지. 다음으로, 샘플을 따라 약간의 용융이 일어날 수 있도록 RT에 접시를 놓습니다. (D) 메스를 사용하여 블록을 우물 의 벽에서 분리합니다. (e) 집게를 사용하여 매트릭스 임베딩 화합물 블록을 제거하고 동결 조직을 위해 적절한 얕은 용기 또는 곰팡이에 놓습니다. 임베딩 컴파운드(OCT)로 금형을 완전히 채웁니다. (F) 30 분 동안 냉동고에서 -80 C에서 블록을 동결합니다. (G) 블록은 추가 사용을 위해 -80 C 냉동고에서 단면화 또는 저장할 준비가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 트랜스듀시 된 장 오르가노이드의 대표적인 이미지. (A) 빛 현미경으로 소장 오르가노이드의 대표적인 이미지 (왼쪽) 형광 현미경 검사법, 및, (오른쪽) 이식 유전자 발현의 표준 현미경 검사법 (EGFP) 3 일째에 이식 후. 스케일 바 = 50μm. (B) 자기 나노 입자를 사용하여 전이 후 오르가노이드에서 GFP를 코딩하는 유전자의 과발현의 예. 오가노이드 세포는 GFP를 발현하는 렌티바이러스로 시동되었다(FUGW; 상부) 또는 렌티바이러스 과발현 Hmga1 (FUGW-Hmga1; 아래) 전환 후 12일째에 도시된 바와 같이. 스케일 바 = 50μm. (C) 오르가노이드의 포르말린 고정 냉동 섹션의 면역 형광 이미징. 오르가노이드 절편(4 μm)은 리소자임 방지(적색), 안티-EpCAM(녹색) 및 DAPI(청색)로 염색하였다. EpCAM은 세포 경계를 경계하고, DAPI는 개별 핵을 나타내고, 리소자임은 파네스 세포를 얼룩지게 한다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 오르가노이드 배양 배지 (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12+ | 96 mL |
| L-알라닐-L-글루타민 디펩티드 보충제 (예: 글루타맥스) | 1 mL |
| 네아 (NEAA) | 1 mL |
| 펜/스트렙 | 1 mL |
| 헤페스 (주)는 | 1 mL |
| EGF (100 μg / mL) | 5 μL |
| 노긴 (100 μg / mL) | 10 μL |
| R-스폰딘 (100 μg / mL) | 10 μL |
| 또는 R-스폰딘 상태 매체 (CM) | 20 mL |
| 인간 재조합 인슐린 (10 mg / mL) | 5 μL |
| 감전 매체 | 5 mL |
| ENR 매체 | 2.4 mL |
| Wnt 상태 매체 (CM) | 2.5 mL |
| 니코틴아미드 (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| 분리 버퍼 를 해독 | 100 mL |
| PBS (Ca2 +없이, Mg2+이상) | 99 mL |
| 펜/스트렙 | 1 mL |
| 0.5 M EDTA | 100 μL |
| 0.1 M DTT (디티오트레이톨) | 100 μL |
| 293T 미디엄 | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| FBS | 10 mL |
| 바이러스 수집 매체 | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| FBS | 1 mL |
| 오르가노이드 소화 완충제 | 1 mL |
| DMEM/F12+ | 1 mL |
| 디스파제 I (10 mg / mL) | 6 μL |
| Dnase I (10 mg / mL) | 2.5 μL |
표 1: 프로토콜에 사용되는 미디어입니다.
| 격판덮개 | 10cm | 15cm |
| 렌티바이러스 변환 벡터 | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR8.91 | 8 μg | 12 μg |
| 메릴랜드. G | 2 μg | 3 μg |
| 총 벡터 | ≤16 μg | ≤24 μg |
표 2: 형질혈을 위한 플라스미드 DNA의 양.
| 격판덮개 | 마그네틱 비드(μL) | 바이러스의 양 (μL) | 최종 변환볼륨(μL) |
| 48웰 | 6개 | 50개 | 250개 |
| 24웰 | 12세 | 100개 | 500개 |
표 3: 자기 비드 용액 및 벡터의 부피.
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Discussion
오르가노이드로서 성인 장 상피의 1차 배양은 줄기세포 기능, 장상피 항상성 및 병리학 1,2,3에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 4. CRISPR/Cas9 기술은 오가노이드9를유전자 조작하는 데 사용될 수 있지만 원하는 유전 적 변화에 대한 서열 분석에 기초한 광범위한 스크리닝 및 선택에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜의 목표는 렌티 또는 레트로바이러스가 장내 오르가노이드에 자성 나노입자 전달을 위한 비디오 기반 자습서를 통해 명확하고 간결한 지침을 제공하고 추가 분석을 위해 동결된 절편을 제공하는 것입니다.
이 프로토콜은 장 오르가노이드를 유전적으로 엔지니어링하고 유전자 과발현 또는 냉동 섹션에서 침묵의 결과를 분석하는 신속하고 효율적인 방법입니다. 중요 단계는 그림2, 그림3에 설명되어 있습니다. 이 전략은 장 줄기 세포에서 유전 적 변경 (과발현 또는 침묵)의 생물학적 중요성을 조사하고 3D 조건2,13에서배양 된 자손의 조사를 허용합니다. 우리는 또한 다른 1차 세포2,13에서시험관내에서 세포 전달 및 이식유전자 발현을 향상시키기 위해 바이러스 벡터의 자기 나노입자 기반 전달을 사용하였다.
이 접근법으로, 바이러스 입자는 자기 나노 입자로 코팅되고 자기장에 노출에 의해 세포에 전달됩니다. 현재 의 전형 방법에 비해, 이러한 가시 세포화의 유무와 같은 폴리브렌 10,15,자기 나노 입자 바이러스 복합체는 유전 물질의 섭취가 내분비증에 의해 매개되기 때문에 세포에 덜 독성이 있고 pinocytosis, 세포막에 상당한 손상을 유도하지 않는 두 가지 자연 발생 생물학적 과정. 따라서, 세포 생존력과 형질전환 효율이 모두 향상된다. 감전 효율은 이전에 보고된바와같이 더 큰 토굴 또는 전체 오르가노이드 대신에 작은 토굴 단편 또는 단일 세포(단계 4.8 참조)를 사용하여 더 증가할 수 있다. 자기 유도 나노 입자 전달은 표적 세포2,13에바이러스 벡터의 빠른 축적, 침투 및 섭취를 초래한다. 자기 나노 입자는 완전히 생분해성이며 특정 독점 양이온 분자로 코팅 된 산화 철로 만들어집니다. 바이러스 벡터와의 나노입자 연관은 염-유도 콜로이드 응집 및 정전기 상호작용에 의해 달성된다. 나노입자는 배양 접시 아래에 배치된 자기판에 의해 생성된 외부 자기장에 의해 세포에 집중된다. 트랜스덕션 효율이 95%에 가까워지는 동안 모든 셀이 변환되는 것은 아니며, 이는 이 기술의 한계입니다. 추가적으로, 관심의 내인성 표현된 유전자는 CRISPR/Cas9 접근과 같이 변경되지 않습니다.
유전자 과발현 또는 침묵에 이어, 오르가노이드는 유전자 발현 분석, 세포 내 의 프로테오믹 변경 또는 세포에 의해 분비되는, 대사 변경, 및 형태학적 변화. 살아있는 조직과 마찬가지로, 동결된 단면도는 전사 인자, 세포질 분자, 또는 세포 표면 마커와 같은 특정 단백질의 면역 조직화학 및 면역 형광 연구를 위해 장악될 수 있습니다. 우리의 기사는 3D 문화에서 자신의 위치와 조직을 방해하지 않고 오르가노이드에서 냉동 섹션을 얻을 수있는 효과적인 접근 방식을 포함한다. 이는 선행 기술이동결(16)하기전에 지하 막 매트릭스로부터 오르가노이드를 제거해야 하기 때문에 유리하다. 매트릭스에서 제거에 의한 유기체를 처리하는 것은 시험관 내 성장 및 발달을 반영하기보다는 오르가노이드의 구조적 조직을 방해할 수 있다.
장 내 오르가노이드를 유전적으로 설계하는 이 프로토콜은 또한 다른 세포 기반 모델 및 오르가노이드 시스템을 연구하기 위해 적응될 수 있다. 예를 들면, 췌장, 결장, 간, 심장 및 대뇌 organoid 시스템은 이 접근으로 변환될 수 있었습니다. 더 표준 배양 기술하에서 성장하는 세포조차도 나노 입자 기술에 대한 의무가 있습니다. 또한,이 접근법은 줄기 세포 유래 오르가노이드 시스템의 맥락에서뿐만 아니라 종양 오르가노이드에서도 질병의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.
요약하면, 장 내 오르가노이드 연구를 위한 이 프로토콜에 기술된 중요한 수정은 잘하면 장 줄기 세포및 그들의 자손의 생물학에서 관련시킨 중요한 요인 및 하류 통로의 역할을 설명하는 과학자를 강화할 것입니다 . 이 접근은 생리학및 병리학 조건 둘 다의 밑에 자기 갱신, 세포 운명 결정, 조직 항상성 및 장 상피 재생의 밑에 분자 기계장치에 관하여 더 많은 것을 배울 수 있는 방법을 제공해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), 미국 폐 협회, 알레게니 건강 네트워크의 보조금에 의해 지원되었다 홉킨스 연구 기금과 홉킨스 소화기 질환 기초 연구 핵심 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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